DE1793413A1 - Tetrapeptidverbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

DR. ELISABETH JUNG. DR. VOLKER VOSSJUS, DIPL.-ING. GERHARD COLDEWEY

• MOHCHINlS · 91IQEtSTHAtSEIt . TILIPONMMt? ■ TILIOBAMM-ADHISSE: INVENT/MONCHEN

u.Z. : D 742 München, den 13.9.68/B«/vo

TANABE SEIYAKU CO., LTD. Osaka, Japan

"Tetrapeptidverbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Priorität : 13. September 1967· Japan Anmelde-Nr.: 58 806/67

Die Erfindung betrifft neue letrapeptidverbirföungen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung, insbesondere L-Leucyl-L-leuoyl-L-leucjri-Ir^Binoeäurei.in denen der Aainosaurerest ein Tyrosin- oder Pheayleleninrest ist, nämlich L-Leuoyl-L-leucyl-L-ltucyl-L-tyrcein und L-Leucyl-L-leuoyl-L-leucyl-L-phenylalanin sowie deren aus Amino ende gesohütste oder ungeschützte Ester und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Die neuen Tetrapeptide und deren Derivate sind als Mittel gegen. Hypotonie oder als Nahrungsmittel oder als Zwischenprodukte für deren Herstellung brauchbar.

Die Tetrapeptide und deren Derivate werden erfindungegeraäsa durch Kondensieren von L-Leucin mit einer L-Leucyl-

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L-leucyl-L-aminosäure (L-Leucyl-L-leucyl-L-tyrosin oder L-Leucyl-L-leucyl-L-phenylalanin) von L-Leucyl-L-leucin mit einer L-leucyl-L-aminosäure (L-Leucyl-L-tyrosin oder L-Leucyl-L-piienylalanin) oder von L-Leucyl-L-leucyl-lrleucin mit einer L-Aminoaäure (L-Tyrosin oder L-Phenylalanin) in deren reaktiven Formen und gegebenenfalls anschliessender Abspaltung der Schutzgruppe oder Schutzgruppen hergestellt.

Unter "reaktive Form" soll eine zur Umsetzung der betreffenden Aminosäure oder des Peptide üblicherweise geeignete Verbindungsform verstanden werden, die für die Peptidbildung , also der Ausbildung einer Peptidbindung Verwendung finden kann. Beispielsweise können L-Leuoin, L-Leucyl-L-leucin und L-Leueyl-L-leucyl-L-leucin, die im Folgenden als Verbindungen der Gruppe I bezeichnet werden sollen, am Aminoende geschützt sein und ein Carboxylende besitzen, das frei oder aktiviert ist. Die L-Leucyl-L-leucyl-L-aminosäure, die L-Leucyl-L-aminosäure und die L-Aminosäure, die im Folgenden als Verbindungen der Gruppe IX bezeichnet werden sollen, sind am Carboxylende geschützt und können ein freies oder aktiviertes Aminoende besitzen.

Beispiele für Schutzgruppen für das Aminoende sind Benzyl·» oxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxyoarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl-, p-(p'-Methoxyphenylazo)-benEyloxyoarbonyl-, t-Butyloxycarbonyl-, t-Amyloxyaarbonyl-, Trityl-, Tosyl-_t Formyl-, Phthaloyl-, Trifluolnaoetyl-, o-Hitrophenyleulfenyl-, Benzylidengruppen und dergleichen. Für den Schutz das Carboxyl ende β können verschiedene Estergruppen verwendet werden, z.B. Methyl-, Äthyl-, t-Butyl-, Benzyl-, p-Hitrobenzyl-, ρ-Mathoxybenzyl- und Trimsthyleily!estergruppen.

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Beispiele für aktivierte Carboxylenden sind daß Säurechlorid, Azid₅ Phosphoroxychlorid, Äthoxycarbonsäureanhydrid, Isobutoxycarbonsäureanhyärid, der Cyanmethylester, Thiophenylest er, p~JJitrophenyles ter, Pentachlorphenylester,. N-Hydroxysuecinimidester oder dergleichen.

Die Kondensation kann in an sich "bekannter Weise durchgeführt werden. Beispielsweise kann eine Verbindung der Gruppe I mit einer Verbindung der Gruppe II in einem organischen Lösungsmittel, z.B. Di chlorine than, Chloroform, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Äthylacetat ,oder Diäthylphosphit innerhalb eines weiten Temperaturbereichs, der gewöhnlich zwischen -30 und 40⁰C liegt, umgesetzt werden, wobei in Gegenwart eines Kondensationsmittels, z.B. Dieyclohexylcarbodiiraid, Oarbonyläiimidazol, Tetraäthyl- . pyrophosphit, l~Äthyl-3-(3*-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid, gearbeitet wird, wenn weder das Garboxylende in der Verbindung der Gruppe I noch das Aminoende.in der.Verbindung der Gruppe II aktiviert ist. Ein bevorzugtes Verfahren ist das sogenannte Azidverfahren, wobei die Verbindung dsr Gruppe I, die entsprechend am Aminoende geschützt und als Azid am Carboxylende aktiviert ist, mit der Verbindung der Gruppe II umgesetzt wird, die am Carboxylende entsprechend geschützt ist und ein freies Arainoende hat. Die Umsetzung wird bei einem pH-Wert zwischen 7 und 9 unter Verwendung einer basischen Substanz z.B. Pyridin, Srimethylamin, Triäthylarain oder Natriumbicarbonat in einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform oder Tetrahydrofuran bei einer Temperatur nicht über O⁰C durchgeführt.

Die Abspaltung der Schutzgruppe(n), die im erhaltenen Peptid vorliegen, kann nach einem entsprechenden Verfahren erfolgen,'dar; von der Art der Schutzgruppe(n) abhängt.

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Beispielsweise kommen für die Abspaltung von Schutegruppen des Aminoendes folgende Verfahren in Betraoht: Die Hydrierung in Gegenwart eines PaAlMiumkatalygators, z.B. Palladium auf Kohle oder Palladiumschware bei Benzyloxycarbohyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl-, p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxyoarbonyl- und Sritylgruppenj eine Behandlung mit Bromwasserstoff in Eisessig bei Beneyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Phenylasobanayloxycarbonyl-, p-Cp'^MethoxyphenylazoJ-benzyloxyoarboayl- und t-Butyloxyoarbonylgruppenj eine Behandlung mit Natriummetall in flüssigem Ammoniak bei Benzyloxyoarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl- und Tosylgruppen oder eine Behandlung mit Salzsäure und/oder Essigsäure bei Trityl-, t-Butyloxycarbonyl-, Forrayl- und Benzylidengruppen. Die Schutzgruppe am Carboxylende wird durch eine Behandlung mit Alkali bei Methyl-, Äthyl und Benzylestergruppen, durch eine Behandlung mit Säure bei Methyl-, Äthyl-, Benzyl-, p-Methoxybenzyl- und t-Butylestergruppen oder durch die Hydrierung in Gegenwart eines Palladiumkatalysators bei Benzyl- und p-fiitrobenzylestergruppen und dergleichen abgespalten. Zur Abspaltung der Benzyloxyoarbony!gruppe, die gewöhnlich zum Schutz des Aminoendes gemäß8 der Erfindung verwendet wird, ist die Hydrierung in Gegenwart eines Palladiumkatalysators bei Raumtemperatur ist sauren Medium oder eine Behandlung mit Bromwasserstoff in Bisessig bei Raumtemperatur bevorzugt. Zur Freisetzung der Carboxylgruppe aus dem Alkylester, z.B. den Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl- oder Ootylester , der gewöhnlioh sum Schutz des Carboxylendes gemäes der Erfindung verwendet wird, ist rine Behandlung mit Natriuahydroxidlöeung bei Raumtemperatur bevorzugt.

Die derart hergestellten Tetrapeptide und ihre Euter, die am Aminoende geeohUtst oder ungeschützt eind, sind Ale

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Mittel gegen Hypotonie oder als Zwischenprodukte für deren Herstellung brauchbar. Beispielsweise hemmen L-Leueyl-L-leucyl-L~leucyl-L~phenylalaniJimethylester und L-Leucyl-L-laucyl-L-leusyl-L-tyrosinmethylester die enzymatische Wirkung von Renin {ein aus der Niere sekretiertes Enzym)

auf das im Plasma vorhandene Angiotensinogen unter Bildung von Angiotansin I oder die V/irkung eines üinwandlungsenzyme auf Ängiotensin I, das in dieser Weise gebildet wird, unter Freisetzung von Angiotenain II, das exne Pressorwirkung besitzt»

Die Tetrapeptide gemass der Erfindung sind ausserdem su Ernähr«ngszwecken beispielsweise anstelle von Proteinhydrolysafcen brauchbar. Sie erlauben die Verabreichung genau definierter und spezifischer Peptide zur Behandlung bestimmter Arainosäuremangeleracheinungen und sind wegen der Möglichkeit einer richtigen und genauen Dosierung den Proteinhydrolysaten überlegen.

Die Erfindung wird dtirch di.e folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Zu einem Uemisch aus 25 g N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin, 150 ml Tetrahydrofuran und 9»54 g Triäthylamin, das auf -20⁰G gekühlt ist, wird tropfenweise 10,2 g Chlorameisensäureäthylester zugegeben. Nach 15 Minuten Rühren wird ein Gemisch aus 20,5 g L-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid, 200 ml Tetrahydrofuran und 9154 g Triäthylamin tropfenweise zugegeben und das erhaltene Gemisch 2 1/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser vermischt und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit 5 7&iger Salzsäure und anschliessend mit Wasser,

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. verdünnter Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird aus einem Gemisch aus Äthylacetat und Hexan umkristallisiert und N-Benzyloxycarboinyl-L-leucyl-L-phenylalfiain-iaethylester (28,0 g) vom F. 84,5 -87⁰C, ßjV" -27* (0 ■ 1 ia Methanol) erhalten.19»2 g des N-Benzyloxyearbonyl-L-leueyl-L-phenylalanin-methylesters werden mit 30 ml einer 42 jCigen Lösung von Salzsäure in Methanol, 2,2 g Katalysator aus 10 i» Palladium auf Kohle, 200 ml Methanol und 50 ml Eisessig vermischt und bei Raumtemperatur unter Ätmosphärendruck 3 1/2 Stunden Wasserstoff eingeleitet. Das Reakjionsgemisch wird filtriert und das Piltrat unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird aus einem Methanol-Äther-Geznisch umkristaXlisiert und ergibt L-Leucyl-L-phenylalanin-methylester-hydrochlorid (11,05 g) vom P. 193 195⁰O, Ä^f¹ +13,3° (C - 1 in Methanol).

Zu einem Gemisch aus 5,5g N-Benzyloxycarbonyl-L~leuoyl-L-leucin-hydraaid, 25 ωΐ Dioxan, 70 ml Tetrahydrofuran und

9.4 ml 4,5 n-Salssäure-Dioxan, das auf -14 bis -18⁰O gekühlt war, wird eine Lösung von 1,07 g Natriumnitrit in

2.5 ml Wasser unter Rühren innerhalb 5 Minuten zugegeben. Das erhaltene Gemisch wird 20 Minuten gerührt und an-BChliessend auf -35 bis -38⁰C gekühlt und 4,6 g Triäthylamin tropfenweise zugegeben. Nach 15 Minuten Rühren wird zu dem Gemisch ein Gemisch aus 4,61 g L-Leuoyl-L-phenyl- ■ alanixi-raethylester-hydrochlorid, 2,84 g friäthylamin und 40 ml Dimethylformamid zugegeben. Ee wird 1 Stunde bei -20⁰C und 1 Stunde bei -10⁰C und ansohlieesend 19 Stunden bei RaumtempRratur gerührt. Das unlösliohe Material wird abfiltriert, das Filtrat mit Wasser vermieoht und alt Chloroform extrahiert. Der gesammelte Filterrückstend wird mit Wasser gowaochen und in Chloroform gelöst. Chloroformextrakt und Chloroformlösung werden vereinigt, gewaschen,

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getrocknet und eingeengt. Dei* Rückstand wird aus Methanol umkristallisiert und ergibt N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-phenylalanin-fiiethylester (8,03 g) vom F. 187 bis 188⁰C, ßj^ -54,2° (C * 1 in Dimethylformamid). 3,26 g des N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-phenylalanin-raethylesters werden mit 5 ml Methanol mit 42 $ Salzsäure, 0,5 g Katalysator aus 10 # Palladium auf Kohle, 200 ml Methanol und 70 ml Eisessig vermischt und bei Raumtemperatur unter Atmosphärendruck 4 Stunden lang Wasserstoff eingeleitet. Nach dem Abfiltrxeren des Katalysators wird das Filtrat eingeengt und der Rückstand aus einem Gemisch aus Aceton und Hexan umkristallisiert und L-Leucyl-L-leucyl-L-leueyl-L-phenylalanin-methylesterhydrochlorid (2,09 g) vom F. 215⁰C, ßj ^⁰ -13,3° (C » 1 in Dime thylf ο imamid) erhalten. Der L-Leucyl-L-leucyl-L-leucyl-l-phenylalanin-methylester wird mit n-Natriumhydroxidlbsung behandelt und L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-phenylalanin erhalten.

Beispiel 2

In ein Gemisch aus 7,53 g N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-tyrosin-methylester, 10 ml Eisessig, 14,6 ml Methanol mit 42 i» Salzsäure und 1 g Katalysator aus 10 $> Palladium auf Kohle sowie 100-ml Methanol wird bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck 3 Stunden WasserstoffEingeleitet. Das Reaktionsgemisch wird fxltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther versetzt und der gebildete Niederschlag gesammelt, in Wasser gelöst, mit Kaliumcarbonatlösung alkalisch gemacht und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und trockenes Chlorwasserstoffgas in die Lösung eingeleitet und in form amorpher Kristalle L-Leucyl-L-tyroBinHaethylester-hydroohlorid (2,51 g) erhalten, ψ +9,33° (C » 1 in Methanol).

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Zu einem Gemisch aus 2,83 g N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucin~hydrazid, 20 ml Dioxan, 50 al Tetrahydrofuran und 5 ml 4,5 η-Salzsäure in Dioxan, das auf -45⁰O gekühlt war, wurde eine Lösung von 0,55 g Natriumnitrit in 1,3 ml WasBer zugegeben und das erhaltene Gemisch mit 2,5 g Triäthylamin neutralisierte Ein Gemisch aus dem wie oben hergestellten L-Leucyl-L-tyrosin-methylester-hydroohlorid (2,51 g), 30 ml Dimethylformamid und 1,46 g Triethylamin wird dazu gegeben und die Umsetzung gemäss Beispiel 1 durchgeführt■ Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand mit 300 ml Wasser vermischt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, mit V/asser gewaschen, getrocknet und aus Methanol umkristallisiert und N-fienzyloxycarbonyl-L-leuoyl-L-leucyl-L-leucyl-L~tyrosin-methylester (2,67 g) vom F. 198 bis 200⁰C, Ä7d⁵ -55,6° (C a 1 in Methanol} erhalten. Der N-Benzyloxyearbonyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leueyl-L-tyroBin-aethylester (2,01 g) wird mit 100 ml Methanol, 30 ml Eisessig und 0,3 g Katalysator aus 10 $> Palladium auf Kohle vermischt und bei Raumtemperatur und Atmoephärendruok 3 Stunden Wasserstoff eingeleitet. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird in Methanol gelöst, 42 # Salzsäure in Methanol (1 ml) zugesetzt und das erhaltene Gemisch unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther gewaschen und aus einem Gemisch aus Methanol und Äther umkristallisiert und L-Leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-tyrosin-methylester-hydrochlorid (0,56 g) vom P. 234° C (Zersetzung) erhalten, ßj^- 24,3° (C - 1 in Methanol). Das L-Leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-tyrosin-aiethyleBter-hydrochlorid wi-d mit n-Natriumhydroxidlöeung vermisoht und ergibt L-Leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-tyrosin·

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Beispiel 3

Zu einem Gemisch aus 3 »93 8 N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucin~hydrazid, 20 ml Tetrahydrofuran, 20 ml Chloroform, und 10 ml konz. Salzsäure, das auf -1O⁰C gekühlt war, wird tropfenweise eine Lösung von 0,76 g Natriumnitrit in 3 ml Wasser zugegeben und das erhaltene Gemisch 15 Minuten gerührt ο Das Reaktionsgeinisch wird mit Chloroform extrahiert, der Extrakt mit Natriurabicarbonatlösung gewaschen und getrocknet. Die erhaLtene Lösung wird au einem Gemisch aus 2,16 g L-Fhenylalanin-Kiethylenter-hyilrochlorid, 20 ml Chloroform und 1,01 g Triethylamin gegeben und 2 Tage bei 5⁰O sfc-jhen gelaasen. Di3 Ciil.oroformschicht wird abgetrennt, mit Wasser, 5 $Lger Salzsäure, gesättigter Natriunibicarbonafclcteung und Wasser hintereinander gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Eüokstond wird aus 60 j£igem Äthanol umkriBtalüBi ert und N~Ben:ay.l.oxycarbonyl«L~leucyl-~L~ ißuu.yl-L-phenylalanin-mathylenter (3iO2 g) vom F. 150 bis 151⁰C erhalten. Der N-Benzyloxycarbonyl -L-leuoyl-L-leucyl-L-phenylalanin-methylester (5,40 g) wird mit 1,1 n-Bromwasserstoff in Eisessig fl5 ml) vermischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgeraiaoh wird unter verirtindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther vermischt und der gebildete Niederschlag abfiltriert und mit Äther gewaschen und rohes L-Leucyl-L~leucyl~L-phenylalanin-methylester-hydrobromid erhalten.

Das in dieser Welse horgeabellte L-Leucyl-L-leucyl-L-phenylalanin-methylester-hydrobroraid wird in 50 ml Dimöthy!formamid gelöBt und L,01 g Triethylamin und 2,G5 g N-Btmayloxycarbonyl-L-leuoln zugegeben. Zu diesora Geraioch wird unter RUhren und Eiökühiung eine Löoung von 2,1 g

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-XQ-

Dicyclohejcylcarbodiiraid in 20 ml Dimethylformamid tropfenweise innerhalb 20 minufcen zugegeben. Es .wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und ansehliessead das Heakbionsgemisch filtriert. Das gesammelte Material wird mit Dimethylformamid gewaschen. Die Waschflüssigkeit und daa FiIbrat werden vereinigt und mit einer grossen Menge kalben Wassers vermischt» Der gebxldete Niederschlag wird gesammelt, in Chloroform geälöst, mit 5 $iger Salzsäure, Wasser, verdünnter Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der. Rückstand wird aus «lo than al umkriatallisiert und ergibt N-BenzyloÄycarbonyl-L-.leucy.l-Ii-leucyl-L-leuoyl-L-phenylalanin-iuethyleater (4,18 g.' vom J?, 186 bis 188° C.

Patsnfcansprüche -

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Claims (1)

1. -ii- 17S3413

   Patentansprüche

   1. L-Leucyl-L-leueyl-L-leucyl-L-aminosäuren, deren Aminosäureres t ein Tyrosin- oder Phenyl al aninre et ist, und deren gegebenenfalls am Aminoende geschützte Alkylester.

   2. L-Leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-tyrosin nach Anspruch 1.

   3. L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-tyrosin-alkylester nach Anspruch 1.

   4· N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-

   L-tyrosin-iaethylester nach Anspruch 1.

   5. L-Leucyl-L-leucyl-L-leucyl-L-phenylalanin nach Anspruch 1.

   6. L-Leuc yl-L-leucyl-L-leucyl-L-phenylalanin-alkylester nach Anspruch 1·

   7· N-Benzyloxycarbonyl-L-Ieucyl-L-leucyl-L-leucyl-

   L-phenylalanin-aethyleeter nach Anspruch 1.

   8, Verfahren sur Herstellung der L-Leucyl-L-leucyl-L-

   leuoyl-L-aminoeäuren und deren gegebenenfalls am Aminoende geschützte Alkyleeter nach Anspruch 1, dadurch gekennz eichnet, dass man L-Leucin, L-Leucyl-L-leucin oder L-Leuoyl-L-leucyl-L-leucin, das am Aminoende geschützt und aa Carboxylende frei oder aktiviert ist, mit L-Leucyl-L-leucyl-L-tyrosin oder

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   -phenylalanin, mit L-Leucyl-L-tyrosin oder -phenylalanin oder mit L-Tyrosin oder L-Phenylalanin mit einem geschützten Carboxylende und einem freien oder aktivierten Aminoende kondensiert, wobei man im Fall der Verwendung einer Leucinverbindung mit freiem Carboxylende und eines Tyrosine- bzw. Phenylalanine mit einem freien Aminoende in Gegenwart eines Kondensationsmittels arbeitet und gegebenenfalls die Schutzgruppe(n) im erhaltenen Peptid in an sich bekannter Weise abspaltet.

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