DE1518059C - Verfahren zur Herstellung von Derivaten von L-Lysin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Derivaten von L-LysinInfo
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Description
Die Aminosäure Lysin ist ein wichtiger Baustein verschiedener natürlicher, physiologisch aktiver Peptide.
Sie kommt z. B. viermal in dem adrenocorticotropen Hormon (ACTH) von Schweinen", Rindern und
. Schafen, und zwar in den Stellungen 11, 15,16 und 21
der Aminosäuresequenz vor (siehe z. B. J. Am. Chem. Spc, 78, S. 5069 [1956]).
Die Aminosäure Lysin enthält drei reaktionsfähige Gruppen, nämlich eine Carboxylgruppe, eine U-NH2-Gruppe
und eine f-NH2-Gruppe. Bei der Synthese lysinhaltiger Peptide, an welcher gewöhnlich nur die
a-Aminogruppe und die Carboxylgruppe teilnehmen, muß die p-Aminogruppe zur Verhinderung von Nebenreaktionen
blockiert werden (siehe z. B. J. P. G r e e nstein
und M. W i η i t ζ in »Chemistry of the Amino Acids II«, S. 1056 bis 1060 [1961]).
Bei der Synthese eines Peptids, worin z. B. Lysin als N-terminale Aminosäure anwesend ist, muß auch
die a-NH2-Gruppe blockiert sein. Wird die Synthese
an dem N-terminalen Lysin fortgesetzt, dann muß man den W-Substituenten unter solchen Bedingungen
abspalten können, daß die das Ne schützende Gruppe nicht angegriffen wird. Ist jedoch in dem zu synthetisierenden
Peptid Lysin als C-terminaler Rest anwesend, dann muß nur die f-NH2-Gruppe geschützt
werden, wenn die Carboxylgruppe nach einem der bei der Synthese von Peptiden üblicherweise verwendeten
Verfahren in üblicher Weise verestert ist.
Bei der Synthese eines Lysin als Baustein enthaltenden Peptids muß man die die e-NH2-Funktion
schützende Gruppe während der letzten Synthesestufe abspalten können, ohne den Rest des entstandenen
Moleküls anzugreifen.
Aus Angew. Chem., 72, S. 915 bis 917 (1960), ist es
bereits bekannt, die t.Butyloxycarbonylgruppe erfolgreich zum Schutz der e-NH2-Gruppe des Lysins bei
der Synthese von Peptidfragmenten des ACTH zu verwenden. Diese schützende Gruppe kann am Ende
der Synthese unter verhältnismäßig milden Bedingungen, d. h. durch Behandlung mit Trifluoressigsäure
bei Raumtemperatur, wieder abgespalten werden. Schwyzer und Mitarbeiter, HeIv. Chim. Acta,
44, S. 159 bis 169 (1961), beschreiben die Einführung der t.Butylcarbonylgruppe in die t-NH2-Gruppe durch ■
Einwirkung von t.Butyloxycarbonylazid als Reagenz auf den Lysin-Kupferkomplex der Formel
H2N(CH2)^CH
COO
NH,
Cu
Nach der Einführung der NM.Butyloxycarbonylgruppe muß noch der Kupferkomplex mit H2S zersetzt
werden. Als wichtiges Produkt für die Synthese biologisch aktiver, Lysin enthaltender Peptide mit
ACTH-Aktivität wird ein Ester von NM.Butyloxycarbonyl-L-lysin
verwendet. Nach der oben zitierten Veröffentlichun'g wird dieser in fünf Reaktionsstüfen
in einer Ausbeute von unter 40%, bezogen auf Lysin · HCI, gewonnen.
Es wurde jetzt ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten von L-Lysin der allgemeinen Formel
(CH2J4 — NH — COOC(CH3J3
CH-NHX
COOY
gefunden. - -
Es wurde nun festgestellt, daß man zur Herstellung eines N£-t.Butyloxycarbonyl-L-lysinesters der vorstehenden
Formel, in der X ein Wasserstoffatom ist und Y die vorstehende Bedeutung mit Ausnahme eines
Wasserstoffatoms hat, einen L-Lysinester, dessen Aminogruppen in Salzform vorliegen, in einem wasserfreien
organischen Lösungsmittel suspendiert und in Gegenwart einer organischen Base mit t.Butyl-p-nitrophenylcarbonat
oder mit t.Butyloxycarbonylazid umsetzt, und den so erhaltenen Ester für den Fall, daß
in der vorstehenden allgemeinen Formel Y ein Wasserstoffatom ist und X eine bekannte Schutzgruppe für
die Aminogruppe, in an sich bekannter Weise an der u-Aminogruppe mit einer bekannten Schutzgruppe
blockiert und anschließend diesen Ester in an sich bekannter Weise durch Verseifung in die entsprechende,
an beiden Aminogruppen blockierte Säure überführt.
Der erwähnte Ester von NM.Butyloxycarbonyl-L-Iysin
wird nach diesem Verfahren in einer wesentlich verbesserten Ausbeute von über 60%, bezogen auf
Lysin ■ HCl, gewonnen.
Das Ausgangsprodukt für die erfindungsgemäße Umwandlung, d. h. der L-Lysinmethylester · 2 HCI,
kann auf einfache Weise und in praktisch quantitativer Ausbeute durch Einwirkung von Thionylchlorid auf
L-Lysin ■ HCl in Methanol erhalten werden. Das Lysinestersalz wird erfindungsgemäß als Suspension
in dem wasserfreien, organischen Lösungsmittel zur Umsetzung gebracht, da von dem Erfinder festgestellt
wurde, daß bei der Blockierung der t-NH2-Gruppe
eines gelösten Lysinesters, der durch Einwirkung einer Base auf das Salz hergestellt wurde, infolge der In- .
Stabilität des freigesetzten Lysinesters schlechte Ergebnisse erhalten wurden. Unter den erfindungsgemäß
angewendeten Reaktionsbedingungen wird diese Schwierigkeit vollkommen vermieden.
Erfindungsgemäß läßt man das Reagenz t.Butylp-nitrophenylcarbonat
oder t.Butyloxycarbonylazid, die in der britischen Patentschrift 872 332 beschrieben
sind, auf die bekannten Salze von L-Lysinalkyl-,
-aryl- oder -aralkylestern einwirken, wobei selektiv die Reaktion.mit der f-NH2-Gruppe erfolgt.
Unter den beiden für diesen Zweck geeigneten Reagenzien wird vorzugsweise das t.Butyl-p-nitrophenylcarbonat
verwendet, da bei Anwendung des anderen Reagenz die schädliche Stickstoffwasserstoffsäure
freigesetzt wird. Die Reaktion wird vorzugsweise in Äthylacetat durchgeführt. Man verwendet
eine zur Freisetzung der f-NH2-Gruppe aus ihrem
Salz geeignete organische Base. Bei Anwendung äquivalenter Mengen der Reaktionspartner in Gegenwart
von 2Äquivalenten Triäthylamin in Äthylacetat· als
Lösungsmittel erhält man den gesuchten NM.Butyloxycarbonyl-lysinester
in Form seines Hydrochloric^ in 60- bis 65%iger Ausbeute.'
Vorzugsweise verwendet man als Ausgangsmaterial einen Lysinester eines niederen aliphatischen Alkohols,
z. B. Methanol, Äthanol, Propanol oder t.Butanol, jedoch kann die Umsetzung auch mit einem Aryl- oder
Aralkylester, z. B. dem Phenyl- oder dem p-Nitrophenylester oder dem Benzy lester durchgerührt werden.
In dem Ausgangsmaterial liegen beide Aminogruppen als Additionssalze mit einer organischen oder
anorganischen Säure vor. Meist wird das Dihydrochlorid des Lysinesters verwendet.
Die erfindungsgemäße Blockierung der *-NH2-Gruppe
wird in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Diäthyläther, Dioxan
oder Tetrahydrofuran, durchgeführt. Vorzugsweise wird Äthylacetat verwendet. Für die Freisetzung der
f-NH2-Gruppe aus ihren Salzen wird eine organische
Base, wie Dimethyl- oder Diäthylamin, Piperidin, Triäthylamin, Isopropylamin oder n-Butylamin, verwendet.
Sollen die erfindungsgemäß hergestellten Lysinderivate zur Herstellung von Peptiden mit N-terminalem
Lysin verwendet werden, so wird in den wie vorstehend beschrieben hergestellten Nc-t.Butylcarbonyl-lysinestern
anschließend auch die u-NH2-Gruppe in an sich bekannter Weise, z. B. mit Hilfe eines
Benzyloxycarbonylhalogenids, p. Phenylazobenzyloxycarbonylhalogenids
oder Triphenyl'methylhalogenids, blockiert. Bezüglich der Verwendung der beiden
zuerst genannten Verbindungen zum Blockieren der Aminogruppe wird auf die britischen Patentschriften
872 332 und 895 344 verwiesen. Diese Lysinderivate sind kristalline Verbindungen, die leicht ohne chromatographische
Reinigung in reinem Zustand und in höheren Ausbeuten als nach den Verfahren der
HeIv. Chim. Acta, 44, S. 159 (1961), erhalten werden
können.
Nach dem Blockieren der f-NH2-Gruppe und der
a-NH2-Gruppe wird der erhaltene Ester nach seiner
Isolierung in an sich bekannter Weise verseift. Die Identifizierung der so erhaltenen Säure wird in einfachster
Weise über eines ihrer Salze, z. B. das Dicyclohexylaminsalz, durchgeführt.
Die derart erfindungsgemäß hergestellten Produkte werden hierauf zur Synthese von biologisch aktiven
Peptiden, insbesondere ACTH, verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand nachstehender Beispiele näher erläutert:
L-Lysinmethylester · 2 HCl (Ausgangsmaterial)
22 ml Thionylchlorid wurden tropfenweise im Verlaufe
von 30 Minuten 150 ml auf -10° C abgekühltem,
absolutem Methanol zugegeben. Nach Zusatz von 27,4 g L-Lysin · 1 HCl wurde das Gemisch auf Raumtemperatur
gebracht und bei dieser Temperatur 1 Stunde gerührt. Dann wurde das Gemisch 4 Stunden
rückfließend gekocht und hierauf im Vakuum auf etwa 50 ml eingeengt. Nach Zusatz von absolutem
Äther und Abkühlen auf O0C wurde das kristalline
Reaktionsprodukt abgesaugt und aus einem Gemisch aus Methanol und Äther umkristallisiert, wobei man
33,7 g (96%) des Esters, mit dem Fp. 211 bis 21T C
und dem [u]?,5 = +20,8° (c = 1,09, Methanol) erhielt.
B e i s ρ i e 1 1
NM.Butyloxycarbonyl-L-lysinmethylester · HCl
a) Mit t.Butyloxycarbonylazid
44,8 g L-Lysinmethylester · 2 HCl wurden in 220 ml Äthylacetat suspendiert, auf 00C abgekühlt, 80 ml
Triäthylamin und hierauf langsam eine Lösung von 22,9 g t.Butyloxycarbonylazid in 220 ml Äthylacetat
zugegeben. Das Gemisch wurde nunmehr in einer Schüttelvorrichtung geschüttelt. Nach Beendigung
der Reaktion wurde das Gemisch filtriert, das Filtrat gekühlt und 456 ml einer ätherischen 0,83-n-HCl-Lösung
zugegeben. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Äther gewaschen und aus Dioxan und
hierauf aus einem Methanol-Äther-Gemisch umkristallisiert, wobei man 22,5 g (47% der theoretischen
Menge, auf das Azid bezogen) mit dem Fp. 158 bis 159°C und dem [«]? = +19,1° (c = 2,46, Methanol)
erhielt.
b) Mit Nitrophenyl-t.butylcarbonat
23,3 g L-Lysinmethylester · 2 HCl wurden in 65 ml Äthylacetat auspendiert, auf 0° C abgekühlt, 28 ml
Triäthylamin und hierauf langsam eine Lösung von 23,9 g p-Nitrophenyl-t.butylcarbonat in 65 ml Äthylacetat
zugegeben? Das Gemisch wurde hierauf bei Raumtemperatur in einer Schüttelvorrichtung bis
zur Beendigung der Reaktion geschüttelt. Man filtrierte, kühlte das Filtrat und fügte 250 ml einer
ätherischen 0,4-n-HCl-Lösung hinzu. Der Niederschlag
wurde abgesaugt und mit Äther gewaschen. Das Produkt wurde aus Dioxan und hierauf aus
einem Methanol-Äther-Gemisch umkristallisiert, wobei man 18,2 g (61%) des Endproduktes mit dem
Fp. 157,5 bis 1590C und [h]? = +19,0° (c =1,34,
Methanol) erhielt.
B e i s ρ i e 1 2a
N^Benzyloxycarbonyl-NM.butyloxycarbonyl-L-lysinmethylester
118,7g NM.Butyloxycarbonyl-L-lysinmethylester ·
HCl wurden in 800 ml einer 50%igen Kaliumcarbonatlösung bei O0C gelöst und die wäßrige Lösung
mit Äther extrariiert. Der Ätherextrakt wurde: zur
Trockene eingedampft und der Rückstand mit 800 ml eines Dioxan-Wasser-Gemisches im Verhältnis 1 :1
aufgenommen. Nach Zusatz von 32 g MgO und Abkühlen der Lösung wurden langsam 75 g Benzyloxycarbonylchlorid
in 600 ml Dioxan hinzugefügt, nach einiger Zeit das Gemisch bei Raumtemperatur gerührt
und hierauf filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und die so erhaltene wäßrige
Lösung mit Äthyiacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer 5%'gen Zitronensäurelösung und mit
1 n-NH+OH-Lösung gewaschen und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei das Reaktionsprodukt
kristallisierte. Die Ausbeute betrug 154 g (97%). Das Produkt schmolz bei 58 bis 6O0C. Nach dem Umkristallisieren
aus einem Äthylacetat-Petroläther-Gemisch
wurde ein Schmelzpunkt von 62,5 bis 63,5JC.
und [«]os = —11,23 (c= 1, Aceton) gefunden.
• B e i s ρ i e 1 2b N^-Benzyloxycarbonyl-N'-t.butyloxycarbonyl-L-lysin
13,55 g N^-Benzyloxycarbonyl-NM.butyloxycarbonyl-L-lysinmethyiester
wurden in einem Gemisch aus
445 ml Dioxan und 133 ml Wasser gelöst, auf 0°C
abgekühlt, 38 ml einer 1 n-NaOH-Lösung zugegeben und das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Hierauf wurde der pH-Wert des Reaktionsgefhisches
mit Kohlendioxyd auf 7 eingestellt und das Dioxan im Vakuum abgedampft. Die so erhaltene
wäßrige Lösung wurde einige Male mit Äthylacetat extrahiert und hierauf unter Eiskühlung mit Zitronensäure
angesäuert und das Reaktionsprodukt durch Extraktion mit Äthylacetat gewonnen.
Nach Eindampfen dieses Extraktes im Vakuum blieben 12,98 g (99%) des öligen Reaktionsproduktes
zurück.. Zur Identifizierung wurde eine kleine Probe des öligen Reaktionsproduktes in Äthanol gelöst
und mit Dicyclohexylamin in das Dicyclohexylaminsalz übergeführt. Für dieses wurde der Fp. J 47 bis
1480C und [«]" = +4,4° (c = 1,013, Methanol) gefunden.
N'-p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl-NM.butyloxycarbonyl-L-lysinmethylester
59,4 g N'-t.Butyloxycarbonyl-L-lysinmethylester ·
HCl wurden in 400 ml einer 50%igen Kaliumcarbonatlösung bei O0C gelöst und die wäßrige Lösung
mit Äther extrahiert. Der Ätherextrakt wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 400 ml
Dioxan—Wasser (1:1) aufgenommen. Die Lösung
wurde abgekühlt und 16 g MgO und hierauf langsam tropfenweise eine Lösung von 57,7 g p-Phenylazobenzyloxycarbonylchlorid
in 300 ml Dioxan' zugegeben. Das Gemisch wurde kurze Zeit bei +50C und
hierauf bei Raumtemperatur bis zur Beendigung der Reaktion gerührt. Nach dem Absaugen des Niederschlages
wurde das Dioxan im Vakuum abgedampft und das gefärbte Reaktionsprodukt mit Äthylacetat
•extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser und mit einer 5%igen Zitronensäurelösung gewaschen und
zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus einem Äthylacctat-Pctroläther-Gemisch kristallisiert,
wobei man 82,5 g (83%) des Produktes mit dem Fp. 90 bis 910C erhielt. Dieses Produkt konnte
als solches zur weiteren Umwandlung in die entsprechende Säure verwendet werden. Zur Durchr
führung einer Mikroanalyse wurde das Produkt aus Äthylacetat—Petroläther umkristallisiert und zeigte
dann den Fp. 93 bis 94° C und (Vp0' = -5.6°
(c =.1,01, Aceton).
Be i s ρ i e 1 3b ~
N'-p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl-N'-t.butyloxycarbonyl-L-lysin
82 g N'-p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl-N'-t.butyloxycarbonyl-L-lysinmethylester
wurden in 1200 ml Dioxan gelöst, auf +5 C abgekühlt und 665 ml Wasser und 98 ml einer 2,0n-NaOH-Lösung zugegeben.
Das Gemisch wurde 2 Stunden bei + 5 C gerührt, hierauf mit 1 1 Wasser verdünnt, der pH-Wert
der Lösung mit Kohlendioxyd auf 7 eingestellt und das Dioxan im Vakuum entfernt. Nun wurde der
pH-Wert der Lösung mit einer verdünnten NaOH-Lösung auf 8,5 eingestellt, die wäßrige Lösung mit
Äther extrahiert und der Extrakt unter Kühlung mit einer verdünnten HCI-Lösung angesäuert. Das ausgefällte
Reaktionsprodukt wurde mit Äther extrahiert, der Ätherextrakt mit Wasser neutral gewaschen, über
MgSO4 getrocknet und auf etwa 100 ml eingeengt. Nach Zusatz von Petroläther schied sich ein öl aus,
welches rasch kristallisierte. Die Ausbeute betrug 75,5 g (94%)· Die Substanz schmolz bei 102 bis 1040C.
Dieses Produkt kann als solches zur weiteren Umwandlung verwendet werden. Zur Herstellung eines
Analysenmusters wurde das Produkt aus einem Äther-Petroläther-Gemisch umkristallisiert, wobei
man eine Verbindung mit dem Fp. 105 bis 1060C
und [α]? = — 1° (c = 1, Methanol) erhielt. Aus dem
Reaktionsprodukt konnte man ein kristallines Dicyclohexylaminsalz mit dem Fp. 182 bis 183° C erhalten.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von Derivaten von L-Lysin der allgemeinen Formel
(CH2)4NHCOOC(CH3)3
CHNHX
COOY
CHNHX
COOY
worin X ein Wasserstoffatom oder eine bekannte Gruppe zum Schutz der NH2-Gruppe und Y ein
Wasserstoffatom, ein Alkyl-, Aryl- oder Aralkylrest ist, wobei X und Y nicht gleichzeitig Wasserstoffatome
bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung eines
NE-t.Butyloxycarbonyl-L-lysinesters der vorstehenden
Formel, in der X ein Wasserstoffatom ist und Y die vorstehende Bedeutung mit Ausnahme
eines Wasserstoffatoms hat, einen L-Lysinester, dessen Aminogruppen in Salzform vorliegen, in
einem wasserfreien organischen Lösungsmittel suspendiert und in Gegenwart einer organischen
Base mit t.Butyl-p-nitrophenylcarbonat oder mit
t.Butyloxycarbonylazid umsetzt und den so erhaltenen Ester für den Fall, daß in der vorstehenden
allgemeinen Formel Y ein Wasserstoffatom ist und X eine bekannte Schutzgruppe Tür
die Aminogruppe, in an sich bekannter Weise an der u-Aminogruppe mit einer bekannten Schutzgruppe
blockiert und anschließend diesen Ester in an sich bekannter Weise durch Verseifung in
die entsprechende, an beiden Aminogruppen blokkierte Säure überführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Äthylacetat
durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart
von Triäthylamin als organischer Base durchführt.
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