DE1518059B1

DE1518059B1 - Verfahren zur Herstellung von Derivaten von l-Lysin

Info

Publication number: DE1518059B1
Application number: DE19641518059
Authority: DE
Inventors: Panneman Dr Harm Jan
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1963-04-24
Filing date: 1964-04-24
Publication date: 1969-11-13
Also published as: DK123024B; SE304016B; NL291930A; NL121821C; GB1062052A; CH454894A; US3377338A

Description

Die Aminosäure Lysin ist ein wichtiger Baustein verschiedener natürlicher, physiologisch aktiver Peptide. Sie kommt z. B. viermal in dem adrenocorticotropen Hormon (ACTH) von Schweinen, Rindern und Schafen, und zwar in den Stellungen 11, 15, 16 und 21 der Aminosäuresequenz vor (siehe z. B. J. Am. Chem. Soc, 78, S. 5069 [1956]).

Die Aminosäure Lysin enthält drei reaktionsfähige Gruppen, nämlich eine Carboxylgruppe, eine «-NH₂-Gruppe und eine f-NHj-Gruppe. Bei der Synthese lysinhaltiger Peptide, an welcher gewöhnlich nur die (i-Aminogruppe und die Carboxylgruppe teilnehmen, muß die f -Aminögruppe zur Verhinderung von Nebenreaktionen blockiert werden (siehe z. B. J. P. G r e e nstein und M. W i η i t ζ in »Chemistry of the Amino Acids II«, S. 1056 bis 1060 [1961]).

Bei der Synthese eines Peptids, worin z. B. Lysin als N-terminale Aminosäure anwesend ist, muß auch die u-NH_;-Gruppe blockiert sein. Wird die Synthese an dem N-terminalen Lysin fortgesetzt, dann muß man den N*-Substituenten unter solchen Bedingungen abspalten können, daß die das N^E schützende Gruppe nicht angegriffen wird. Ist jedoch in dem zu synthetisierenden Peptid Lysin als C-terminaler Rest anwesend, dann muß nur die f-NH,-Gruppe geschützt werden, wenn die Carboxylgruppe nach einem der bei der Synthese von Peptiden üblicherweise verwendeten Verfahren in üblicher Weise verestert ist.

Bei der Synthese eines Lysin als Baustein enthaltenden Peptids muß man die die f-NFL-Funktion schützende Gruppe während der letzten Synthesestufe abspalten können, ohne den Rest des entstandenen Moleküls anzugreifen.

Aus Angew. Chem., 72, S. 915 bis 917 (1960), ist es bereits bekannt, die t.Butyloxycarbonylgruppe erfolgreich zum Schutz der f-NH,-Gruppe des Lysins bei der Synthese von Peptidfragmenten des ACTH zu verwenden. Diese schützende Gruppe kann am Ende der Synthese unter verhältnismäßig milden Bedingungen, d. h. durch Behandlung mit Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur, wieder abgespalten werden. S c h vv y ζ e r und Mitarbeiter, HeIv. Chim. Acta, ίο 44, S. 159 bis 169 (1961). beschreiben die Einführung der t.Butylcarbonylgriippe in die f-NH₂-Gruppe durch Einwirkung von t.Butyloxycarbonylazid als Reagenz auf den Lysin-Kupferkomplex der Formel

COO

H₂N(CH₂I₄CH Cu

NH,

Nach der Einführung der N^!-t.Butylo\ycarbon\lgruppe muß noch der Kupferkomplex mit ILS zersetzt werden. Als wichtiges Produkt für die Synthese biologisch aktiver. Lysin enthaltender Peptide mit ACTH-Aktivität wird ein Ester von N'-t.Butyloxycarbon >l-i-lysin verwendet. Nach der oben zitierten Veröffentlichung wird dieser in fünf Reaktionsstufen in einer Ausbeute von unter 40",,. bezogen auf Lysin ■ HCl. gewonnen.

Es wurde jetzt ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten von L-Lv sin der allgemeinen Formel

(CH₂I₄ — NH — COOC(CH₁I., CH — NHX

COOY

gefunden.

Es wurde nun festgestellt, daß man zur Herstellung eines N'-t.Butyloxycarbonyl-i.-Iysinesters der vorstehenden Formel, in der X ein Wasserstoffatom ist und Y die vorstehende Bedeutung mit Ausnahme eines Wasserstoffatoms hat, einen i.-Lysinester, dessen Aminogruppen in Salzform vorliegen, in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel suspendiert und in Gegenwart einer organischen Base mit t.Butyl-p-nitrophenylcarbonat oder mit t.Butyloxycarbonylazid umsetzt, und den so erhaltenen Ester für den Fall, daß in der vorstehenden allgemeinen Formel Y ein Wasserstoffatom ist und X eine bekannte Schutzgruppe für die Aminögruppe, in an sich bekannter Weise an der (4-Aminogruppe mit einer bekannten Schutzgruppe blockiert und anschließend diesen Ester in an sich bekannter Weise durch Verseifung in die entsprechende, an beiden Aminogruppen blockierte Säure überführt. o< >

Der erwähnte Ester von N'-t.Butyloxycarbonyli.-lysin wird nach diesem Verfahren in einer wesentlich verbesserten Ausbeule von über 60"',,, bezogen auf Lysin · HCI, gewonnen.

Das Ausgangsprodukt für die erlindiingsgemäße fts Umwandlung, d.h. der i.-Lysinmethylester · 2 HCl, kann auf einfache Weise und in praktisch quantitativer Ausbeute durch Einwirkung von Thionylchlorid auf L-Lysin · HCl in Methanoi erhalten werden. Das Lysinestersalz wird erlindungsgemäß als Suspension in dem wasserfreien, organischen Lösungsmittel zur Umsetzung gebracht, da von dem Erfinder festgestellt wurde, daß bei der Blockierung der ,-NfL-Gruppe eines gelösten Lysinesiers, der durch Einwirkung einer Base auf das Salz hergestellt wurde, infolge der Instabilität des freigesetzten Ljsinesters schlechte Ergebnisse erhalten wurden. Unter den erfindungsgemäß angewendeten Reaktionsbedingungen wird diese Schwierigkeit vollkommen vermieden.

Erfindungsgemäß läßt man das Reagenz t.Butylp-nitrophenylcarbonat oder t.Butyloxycarbonylazid. die in der britischen Patentschrift 872 332 beschrieben sind, auf die bekannten Salze von i.-Lysin-, Alkyl-, Aryl- oder Aralk) !estern einwirken, wobei selektiv die Reaktion mit der ;-NH₂-Gruppe erfolgt. Unter den beiden für diisen Zweck geeigneten Reagenzien wird vorzugsweise das t.Butyl-p-nitrophenylcarbonat verwendet, da bei Anwendung des anderen Reagenz die schädliche Stickstoffwasserstoffsäure freigesetzt wird. Die Reaktion wird vorzugsweise in Äthylacetat durchgeführt. Man verwendet eine zur Freisetzung der r-NIL-Gruppe aus ihrem Salz geeignete organische Base. Bei Anwendung äquivalenter Mengen der Reaktionspartner in Gegenwart von 2 Äquivalenten Triäthylaniin in Älhylacetal als

Lösungsmittel erhält man den gesuchten N^r-t Butyloxycarbonyl-lysinester in Form seines Hydrochlorids in 60- bis 65"_oiger Ausbeute.

Vorzugsweise verwendet man als Alisgangsmaterial einen Lysinester eines niederen aliphatischen Alkohols, z. B. Methanol, Äthanol. Propanol oder t.Butanol. jedoch kann die Umsetzung auch mit einem Aryl- oder Aralkylester. z. B. dem Phenyl- oder dem p-Nitrophenylester oder dem Benzylester durchgeführt werden.

In dem Ausgangsmaterial liegen beide Aminogruppen als Additionssalze mit einer organischen oder anorganischen Säure vor. Meist wird das Dihydrochlorid des Lysinesters verwendet.

Die erfindungsgemäße Blockierung der i-Nll,-Gruppe wird in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, wie Chloroform. Diäthyläther, Dioxan oder Tetrahydrofuran, durchgeführt. Vorzugsweise wird Äthylacetat verwendet. Für die Freisetzung der f-NH,-Gruppe aus ihren Salzen wird eine organische Base, wie Dimethyl- oder Diethylamin. Piperidin, Triäthylainin, Isopropylamin oder n-Butylamin, verwendet.

Sollen die erfindiingsgemäß hergestellten Lysinderivate zur Herstellung von Peptiden mit N-terminalem Lysin verwendet werden, so wird in den wie vorstehend beschrieben hergestellten N'-t.Butylcarbonyl-lysinestern anschließend auch die f/-NH,-Gruppe in an sich bekannter Weise, z. B. mit Hilfe eines Benzyloxycarbonylhalogenids, p. Phenylazobenzyloxy carbonylhalogenids oder Triphenylmethyihalogenids. blockiert. Bezüglich der Verwendung der beiden zuerst genannten Verbindungen zum Blockieren der Aminogruppe wird auf die britischen Palentschriften 872 332 und 895 344 verwiesen. Diese Lysinderivate sind kristalline Verbindungen, die leicht ohne chromatographische Reinigung in reinem Zustand und in höheren Ausbeuten als nach den Verfahren der HeIv. Chim. Acta. 44, S. 159 (1961). erhalten werden können.

Nach dem Blockieren der /-ΝΗ,-Gruppe und der ((-ΝΗ,-Gruppe wird der erhaltene Ester nach seiner Isolierung in an sich bekannter Weise verseift. Die Identifizierung der so erhaltenen Säure wird in einfachster Weise über eines ihrer Salze, z. B. das Dicyclohexylaininsalz, durchgeführt.

Die derart erfindungsgemäß hergestellten Produkte werden hierauf zur Synthese von biologisch aktiven Peptiden. insbesondere ACTH, verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand nachstehender Beispiele näher erläutert:

L-Lysinmethylester · 2 HCl (Ausgangsmaterial)

22 ml Thionylchlorid wurden tropfenweise im Verlaufe von 30 Minuten 150 ml auf —10 C abgekühltem, absolutem Methanol zugegeben. Nach Zusatz von 27,4 g i.-Lysin · 1 HCl wurde das Gemisch auf Raumtemperatur gebracht und bei dieser Temperatur 1 Stunde gerührt. Dann wurde das Gemisch 4 Stunden rücklließend gekocht und hierauf im Vakuum auf etwa 50 ml eingeengt. Nach Zusatz von absolutem Äther und Abkühlen auf 0 C wurde das kristalline Reaktionsprodukt abgesaugt und aus einem Gemisch aus Methanol und Äther umkristallisiert, wobei man 33,7 g (%"„i des Esters, mit dem Fp. 2Π bis 212 C und dem [«] = f 20.8 (c = 1.09, Methanol) erhielt.

B e i s ρ i e 1 1

N'-t.Butyloxycarbonyl-i.-Iysinmethylester · HCl
a) Mit t.Biityloxycarbonylazid

44.8 g i.-Lysinmethylester ■ 2 HCl wurden in 220 ml Äthylacetat suspendiert, auf OC abgekühlt, 80 ml Triäthylainin und hierauf langsam eine Lösung von 22,9 g t.Biityloxycarbonylazid in 220 m! Äthylacetat

ίο zugegeben. Das Gemisch wurde nunmehr in einer Schüttelvorrichtung geschüttelt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Gemisch filtriert, das Filtrat gekühlt und 456 ml einer ätherischen 0.83-n-HCl-Lösung zugegeben. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Äther gewaschen und aus Dioxan und hierauf aus einem Methanol-Äther-Gemisch unikristallisiert. wobei man 22.5 g (47"„ der theoretischen Menue. auf das Azid bezouen) mit dem Fp. 158 bis 159 C und dem [■<] ' = +19.1 ic = 2.46. Methanol) erhielt.

b| Mit Nitrophenyl-t.butylcarbonat

23.3 g i.-Lysinmethylester · 2 HCl wurden in 65 ml Äthylacetat auspendiert. auf 0 C abgekühlt. 28 ml Triäthylainin und hierauf langsam eine Lösung von 23,9 g p-Nitrophenyl-t.butylcarbonat in 65 ml Äthylacetat zugegeben. Das Gemisch wurde hierauf bei Raumtemperatur in einer Schüttelvorrichtung bis zur Beendigung der Reaktion geschüttelt. Man

ϊο filtrierte, kühlte das Filtrat und fügte 250 ml einer ätherischen 0,4-n-rICI-Lösung hinzu. Der Niederschlag wurde abgesaugt und mit Äther gewaschen. Das Produkt wurde aus Dioxan und hierauf aus einem Methanol-Äther-Gemisch umkristallisiert, wobei man 18.2 g (61" „) des Endproduktes mit dem Fp. 157.5 bis 159 C und [-<]:-* = +19.0 fr = 1,34. Methanol) erhielt.

Beispiel 2 a

NMknzyloxycarbonyl-N'-t.butyloxycarbonyli.-lysinmethy !ester

118.7,7 N'-i.Butyloxyearbonyl-i-lysinmethylester ■ HCl wurden in 800 ml einer 50" „igen Kaliumcarbonatlösung bei 0 C gelöst und die wäßrige Lösung mit Äther extrahiert. Der Ätherextrakt wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand mit 8(K) ml eines Dioxan-Wasser-Gemisches im Verhältnis 1 : I aufgenommen. Nach Zusatz von 32 g MgC) und Abkühlen der Lösung wurden langsam 75 g Benzyloxy-

5" carbonylchlorid in 600 ml Dioxan hinzugefügt, nach einiger Zeit das Gemisch bei Raumtemperatur gerührt und hierauf filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und die so erhaltene wäßrige Lösung mit Allylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer 5" „igen Zitronensäurelösung und mit 1 n-NH₄0H-Lösung gewaschen und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei das Reaktionsprodukt kristallisierte. Die Ausbeute betrug 154 g (97" „). Das Produkt schmolz bei 58 bis 60 C. Nach dem Um-

<·ο kristallisieren aus einem Äthylacetat-Petroläther-Gemisch wurde ein Schmelzpunkt von 62,5 bis 63,5 C und JV]? = -11,2 [c = 1. Aceton) gefunden.

Beispiel 2b

N'-Benzyloxycarbonyl-N'-t.butyioxycarbonyl-i.-lysin

13,55 g N¹-Benzy loxy carbonyl-N'-t.butyloxycarbonyl-i -lysinmethylester wurden in einem Gemisch aus

445 ml Dioxan und 133 ml Wasser gelöst, auf 0 C abgekühlt, 38 ml einer 1 n-NaOH-Lösung zugegeben und das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit Kohlendioxyd auf 7 eingestellt und das Dioxan im Vakuum abgedampft. Die so erhaltene wäßrige Lösung wurde einige Male mit Äthylacelat extrahiert und hierauf unter Eiskühlung mit Zitronensäure angesäuert und das Reaktionsprodukt durch Extraktion mit Äthylacetat gewonnen.

Nach Eindampfen dieses Extraktes im Vakuum blieben 12.98 g (99",,) des öligen Reaklionsproduktes zurück. Zur Identifizierung wurde eine kleine Probe des öligen Reaktionsproduktes in Äthanol gelöst und mit Dicyclohexylamin in das Dicyclohexylaminsalz übergeführt. Für dieses wurde der Fp. 147 bis 148 C und [«]? = +4.4 C (c = 1.013. Methanol) gefunden.

Beispiel 3a

N^-p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl-N'-t.butyloxycarbonyl-i.-lysinmethylester

59.4 g N^r-t.Butyloxycarbonyl-t-lysinmelhjfester ■ HCI wurden in 4(K) ml einer 50" „igen Kaliumcarbonatlösung bei t) C gelöst und die wäßrige Lösung mit Äther extrahiert. Der Ätherextrakt wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 4(K) ml Dioxan Wasser (1:1) aufgenommen. Die Lösung wurde abgekühlt und 16 g MgO und hierauf langsam tropfenweise eine Lösung von 57.7 g p-Phenylazobenzyloxycarbonylchlorid in 3(K) ml Dioxan zugegeben. Das Gemisch wurde kurze Zeit bei +5 C und hierauf bei Raumtemperatur bis zur Beendigung der Reaktion gerührt. Nach dem Absaugen des Niederschlages wurde das Dioxan im Vakuum abgedampft und das gefärbte Reaklionsprodukt mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser und mit einer 5° „igen Zitronensäurelösung gewaschen und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus einem Athylacelat-Pelroläther-Gernisch kristallisiert. wobei man 82.5 g (83",,) des Produktes mit dem Fp. 90 bis 91 C erhielt. Dieses Produkt konnte als solches /ur weiteren Umwandlung in die entsprechende Säure verwendet werden. Zur Durchführung einer Mikroanalyse wurde das Produkt aus 4^ Äthylacetat Petrolälher umkrislallisiert und /eiule dann den Fp. 93 bis 94 C und [,*]■' = - .<6 (<· = LOI. Aceton).

B e i s ρ i e I 3 b >o

N^a-p-Phenylazo-benzylox\carbon_\ l-N'-t.but\ 1-oxycarbom I-i -lysin

82 g N'-p-Phenylazo-ben/yloxycarboinl-N'-t.butyloxycarhonyl-i-l)sinmeth\ !ester wurden in 12(K) ml Dioxan gelöst, auf + 5 C abgekühlt und 665 ml Wasser und 98 ml einer 2.0n-NaOH-Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei + 5 C gerührt, hierauf mit 1 1 Wasser verdünnt, der pH-Wert der Lösung mit Kohlendioxyd auf 7 eingestellt und '·<> das Dioxan im Vakuum entfernt. Nun wurde der pH-Wert der Lösung mit einer verdünnten NaOH-Lösung auf 8,5 eingestellt, die wäßrige Lösung mit Äther extrahiert und der Extrakt unter Kühlung mit einer verdünnten HCl-Lösung angesäuert. Das ausgefällte Reaktionsprodukt w urde mit Äther extrahiert, der Ätherextrakt mit Wasser neutral gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und auf etwa 100 ml eingeengt. Nach Zusatz von Petroläther schied sich ein öl aus, welches rasch kristallisierte. Die Ausbeute betrug 75,5 g(94"₀). Die Substanz schmolz bei 102 bis 104X. Dieses Produkt kann als solches zur weiteren Umwandlung verwendet werden. Zur Herstellung eines Analysenmusters wurde das Produkt aus einem Äther-Petroläther-Gemisch umkristallisiert, wobei man eine Verbindung mit dem Fp. 105 bis 106 C und [«J? = — 1 (c = 1. Methanol) erhielt. Aus dem Reaktionsprodukt konnte man ein kristallines Dicyclohcxylaminsalz mit dem Fp. 182 bis 183 C erhalten.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Derivaten von i.-Lysin der allgemeinen Formel

(CH₂I₄NHCOOC(CH₃).,

CHNHX

I
COOY

worin X ein Wasserstoffatom oder eine bekannte Gruppe zum Schutz der ΝΗ,-Gruppe und Y ein Wasserstoflatom, ein Alk\l-, Aryl- oder Aralkylrest ist. wobei X und Y nicht gleichzeitig Wasserstoffatome bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung eines N^f-t.Butylox\carboinl-i-lvsinesters der vorstehenden Formel, in der X ein Wasserstoffatom ist und Y die vorstehende Bedeutung mit Ausnahme eines Wasserstoflatoms hat. einen i.-L\sinesler. dessen Aminogruppen in Salzform vorliegen, in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel suspendiert und in Gegenwart einer organischen Base mit l.Butyl-p-nitrophenylcarbonat oder mit t.Butyloxycarbonylazid umsetzt und den so erhaltenen Ester für den Fall, daß in der vorstehenden allgemeinen Formel Y ein Wasserstoffatom ist und X eine bekannte Schutzgruppe für die Aminogruppe. in an sich bekannter Weise an der n-Aminogruppe mit einer bekannten Schutzgruppe blockiert und anschließend diesen Ester in an sich bekannter Weise durch Verseifung in die entsprechende, an beiden Aminogruppen blokkierte Säure überfuhrt.

2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Ätlnlacetat durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart von Triäthylamin als organischer Base durchrührt.