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Verbessertes Fermentationsverfahren zur Herstellung von Lysostaphin
Die Erfindung betrifft Verbesserungen bei der Herstellung von Lysostaphin durch
Fermentation. lysostaphin ist ein Antibiotikumg das die spezielle Fähigkeit besitzt,
Organismen der Gattung Staphylococous zu lysieren. Seine Herstellung durch Fermentation
wird in der USA-Patentschrift 3 278 378 beschrieben.
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In der USA-Patentschrift 3 278 378 wird die Fermentation von
Staphylococcus staphylolytious in Medien offenbartg die stickstoffliefernde proteinhaltige
Nährstoffet wie Pepton# Pankreatin-Verdauungsprodukte von Gaseint Papain-Verdauungsprodukte
von Soyamehl usw.9 enthalten. Dort wird auch beschrieben# daß das Züchtungsmedium
in den ersten Züchtungsstufen dazu neigtp sauer zu werden. Diese Tendenz wird entsprechend
dem Fortschreiten der Züchtung ausgeglichen,
und zwar durch Freisetzung
von basischen Stoffen, vermutlich von Ammoniak, was zu einem ziemlich scharfen pH-Anstieg
in den späteren Stufen führt. Diese beiden Effekte sind für die Erzeugung von Lysostaphin
durch den Nikroorganismus -schädlichy da der diesbezüglich optimale pH-Wert im Bereich
von 793 - 797 liegend angegeben wird.
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Dieser Sachverhalt wird durch die Fig. 1 erläutert, die drei
Kurvenzüge im gleichen rechtwinkligen Koordinatensystem aufweist. Jeder bezieht
sich auf denselben Züchtungsversuch, durchgeführt gemäß der USA-Patentschrift
3 278 378
unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Nährmediums. Die
Züchtung wurde während 13 Stunden bei 37 0 C in einem Fermenter aus
rostfreiem Stahl von 37,9 Liter unter Verwendung von 20 1 Medium durchgeführt.
Die Einsaat bestand aus 0925 Vol.-% einer Kultur von S. staphylolytieue
NRRL B-2628 in der log-Phase. Der pH-Wert des Mediums wurde zu Beginn auf
793 eingestellt. Die Belüftung wurde mit einem Durchsatz von 1 Volumen
Luft pro Volumen des Mediume in der Minute aufrechterhalten.
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Zusammensetzung des Mkiums:
| Enzymatisch hydrolysiertes Casein |
| (NZ Amine E) 4t8 Gew.-% |
| Soyapepton (Phytone) 095 W |
| Natriumchlorid 095 x |
| Dinatriumhydrogenphoophat 0925 m |
| Dextrose 190 m |
in dem
Diagramm gemäß Fig.
1 zeigt die durchgehende
Kurve, die sich auf die rechte Ordinate bezieht# den pH-Wert. Die Abszisse gibt
die Züchtungszeit in Stunden
- links beginnend
- wieder. Der Anfangs-pH-Wert
von
793
fällt im Verlaufe der Züchtung nach
9 Stunden auf einen Minimalwert
von
6,15 ab. Zu diesem Zeitpunkt beginnt ein steiler pH-Anstiegl wobei nach
13 Stunden ein pH-Wert von
795 erreicht wird. Bei anderen Züchtungsversuchen
wurden noch wesentlich höhere pH-Werte als dieser regelmäßig beobachtet.
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Die unterbrochene Kurve in Fig. 1 zeigt die jeweilige Menge
an Lysostaphin, ausgedrückt in Aktivitätseinheiten pro ml Medium. Die angegebenen
Werte wurden nach dem Verfahren bestimmt, das in der oben genannten USA-Patentschrift
3 278 378 beschrieben ist. Es handelt sich um ein photometrisches Verfahreng
bei welchem eine Einheit von Lysostaphin dadurch definiert ist, daß sie sich in
derjenigen Menge der Probe befindet, die in 10 Minuten eine 50%-ige Herabsetzung
der Trübung einer Zell-Suspension von S.aureus FDA 209P bestimmter Konzentration
verursacht, und zwar in Bezug auf eine identische Kontroll-Suspension, die keine
Probe von Lysostaphin enthält. Pk6 Die Maßzahlen für die Lyoostaphinmenge gibt die
linke Ordinate wieder.
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Die linke Ordinate weist auch eine Skala aufg die das Zelltrockengewicht
der Kultur von S.staphylolytieus, die in dem Züchtungemedium enthalten ist, in mg
pro ml
Medium angibt. Diese Skala bezieht sich auf die dritte Kurve
in Fig. 19 die durch dreieckige Punkte ( A )
wiedergegeben wird und
die Änderung des Zelltrockengewichts (DCW) relativ zur Zeit wiedergibt. Das Zellwachstum
erreicht einen meßbaren Wert nach etwa 4 Stunden. Nach 6 Stunden kann Lysostaphin
im Medium entdeckt werden. Diese beiden Werte nehmen in grober Annäherung etwa parallel
zueinander bis etwa zur achten Züchtungsstunde zu, wo die Produktion des Antibiotikums
zum Stillstand kommt bei einer Konzentration von etwa 6 Einheiten/mlv wenn
der pH-Wert unter 6,3 fällt. Die Antibiotikum-Produktion nimmt nach
10 Stunden entsprechend dem pH-Anstieg dann wieder zu und erreicht nach
13 Stunden 17 Einheiten/mi.
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Das Zellwachstum scheint nach 9 Stunden einen Plateau-Wert
erreicht zu haben; danach beginnt ein graduelles Absinken. Während einer solchen
Züchtung existieren optimale pH-Bedingungpn nur während eines relativ kurzen Zeitraumes.
Man kann natürlich Schritte unternehmen, um den pH-Wert durch kontinuierliche Zugabe
von Säure oder Base während der Züchtung entsprechend einzustellen, dies würde aber
die Verfahrenskosten erheblich heraufsetzen, wenn das Verfahren in großtechnischem
Maßstab durchgeführt werden soll.
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Ziel der Erfindung ist die Herstellung von Lysostaphin-Züchtungsflüssigkeiten
mit höherem Antibiotikum-Gehalt, als bisher erreicht worden ist. Ein weiteres Ziel
der
Erfindung ist ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von Lysostaphin mit herabgesetzten
Anforderungen hinsichtlich der pH-Regulierung während der Züchtungsperiodeg um hohe
Wirtschaftlichkeit bei der großtechnischen Herstellung zu erreichen.
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Die vorstehend genannte Züchtung» die in Fig. 1
erläutert wird,
erfüllt das erste Ziel der Erfindung und stellt in der Tat eine Ausführungsform
derselben dar.
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Es wurde gefunden, daß ein unerwartet hoher Anstieg der Antibiotikum-Ausbeute
erzielbar istl, wenn eine relativ hohe Konzentration an enzymatisch hydrolysiertem
Casein als Stickstoffquelle im Züchtungsmedium verwendet wird. Züchtungemedien,
die mindestens etwa 4% an enzymatisch hydrolysiertem Casein als Stickstoffquelle
enthalten, ergeben regelmäßig außergewöhnlich hohe Gehalte an Antibiotikum bei den
Fermentationenp die ansonsten wie in der USA-Patentschrift 3 278 378 beschrieben
durchgeführt wurden. So ergibt die in Fig. 1 erläuterte Züchtung unter Anwendung
eines Mediums, das 498 Gew.-% enzymatisch hydrolysiertes Casein enthält, einen Antibiotikum-Gehalt
von 17 Einheiten/ ml , wohingegen die im Beispiel 1 der USA-Patentschrift
3 278 378 beschriebene Züchtung, die sich hauptsächlich hinsichtlich der
Konzentration dieses Nährstoffes in dem verwendeten Medium von der ersteren Züchtung
unterscheidet, nur eine Ausbeute von 295 Einheiten/ml liefert.
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Das zweite Ziel der Erfindung wird erfüllt durch Verwendung
eines
wässrigen Nährmediums, das Glycerin, Mannose oder Galaktose als assimilierbare Kohlenstoffquelle
anstelle von Dextrose oder einem ähnlichen Kohlenhydrat-Nährstoff enthält. Es wurde
überraschenderweise,gefundeng daß durch -Verwendung einer dieser assimilierbaren
Kohlenstoffquellen die Notwendigkeit für eine pH-Regulierung während der Züchtungsdauer
entfällt und daß noch weitere Verbesserungen bezüglich der Ausbeute an Antibiotikum
erzielbar sind.
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Fig. 2 stellt eine Gruppe von Kurven ähnlich wie in Fig.
1 dar, die den günstigen Effekt der Anwendung von 1,0 Gew.-% Glycerin
als assimilierbare Kohlenstoffquelle auf den pH-Wert erläutern. Diese Züchtung war
sonst identisch mit derjenigen gemäß Fig. 1. Es ist ersichtlich, daß der
Anfangs-pH-Wert von 7,3 während etwa der ersten 6 Stunden relativ
konstant blieb und daß dann ein Anstieg auf 7,75 erfolgt, wonach der pH-Wert
wieder abnimmt, und zwar bis 7,35 nach 12 Stunden. Auch hier beginnt das
Wachstum der Mikroorganismen nach etwa 4 Stundeng wobei die Antibiotikum-Produktion
nach etwa 6 Stunden in Erscheinung tritt; die beiden entsprechenden Kurven
steigen etwa parallel zueinander an. Jedoch wesentlich stärkeres Wachstum und größere
Antibiotikum-Produktion tritt dann ein, wobei die maximale Antibiotikum-Konzentration
bei diesen speziellen Versuch etwa 35 Einheiten/ml nach 12 Stunden beträgt.
Es ist festzustellen, daß diese Züchtung sich wesentlich von der mit Dextrose vorgenommenen
Züchtung unterscheidet, und
zwar hinsichtlich des engen und erwünschten
beobachteten pH-Bereiches sowie der wesentlich höheren Konzentration des im Medium
gebildeten Antibiotikums.
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Die beiden grundlegenden Gesichtspunkte der Erfindung, wie sie sich
aus Fig. 1 und 2 ergeben, werden in etwas unterschiedlicher Weise durch eine
Reihe von Versuchen erläutert, die eä:eh auf dem Beispiel 1 der USA-Patentschrift
3 278 378 basieren. Der erste Versuch stellt eine Wiederholung dieses Beispiels
unter Verwendung eines Züchtungsmediums dar, das 197% Pankreatin-Verdauungsprodukt
von Casein (Trypticase, Baltimore Biologieal Laboratories)9 0t3% Papain-Verdauungsprodukt
von Soyamehl (Phtytone, Baltimore Biologieal Laboratories), 095% Natriumehlorid,
0925% Dikaliumhydrogenphoaphat und 0.25% Dextrose enthielt. Das Medium
wurde auf einem pH-Wert von 7,3 eingestellt, mit S. staphylolytieus
NRRL B-2628 beimpft und 17 Stunden bei 370 C in einem Schüttelkolben
inkubiert. Nach Abschluß der Züchtung wurde die Züchtungsflüssigkeit hinsichtlich
der Lysostaphin-Aktivität analysiert und der pH-Wert gemessen.
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In der ersten Versuchsreihe wurde die Menge an Pankreatin-Verdauungsprodukt
von Casein auf
39 59 7 und
10% erhöht und der Effekt auf den Antibiotikum-Gehalt
sowie auf den pH-Wert des Mediums untersucht. Hiermit wurden zwei identische Versuchsreihen
durchgeführt, und zwar unter-Verwendung von
190 G#ew.-#; Dextrose oder von
190 Gew.-u"o' Glycerin anstelle von
0925 Gew.-% Dextrose im Züchtungsmedium.
| Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammen- |
| gestellt. |
| T a b e 1 1 e I |
| Effekt der Caseinhydrolysat-Kohzentration |
| Nährstoff Dextrosemenge 0.25% Dextrosemenge
190% Glycerin 1,0% |
| Casein- - |
| hydrol. Antibio- pH Antibio- PH Antibio- PR |
| tikum- tikum- tikum- |
| Gew.-% Gehalt Gehalt Gehalt |
| 6197 296 8p45 192 5900 095 6p80 |
| 390 498 8955 397 5915 1194 6995 |
| 590 11.,2 8960 995 5v55 179,8 7970 |
| 7p0 1798 8960 1695 6925 4095 7980 |
| 1090 1793 8950 2298 7930 4493 7995 |
Ein wesentlicher Anstieg des Antibiotikum-Gehalte wurde bei denjenigen Versuchen
beobachtet, bei denen
5 Gew.-% des Pankreatin-Verdauungsproduktes von Casein
als Stickstoffquelle verwendet wurde, und zwar im Vergleich zu denjenigen mit Konzentrationen
von
3% oder weniger an diesem Bestandteil. Weitere Zunahmen des Antibiotikum-Gehaltes
wurden beobachtet, als die Gew.-% -Menge des enzymatisch hydrolysierten Caseins
im Züchtungsinedium auf etwa
10%
erhöht wurde. Die vorliegende Erfindung bezieht
sich daher in ihrem breitesten Bereich auf die Herstellung von Lysostaphin durch
Fermentation von S.staphylolytieue in Medienp die 4
- 10 Gew.-% enzymatisch
hydrolysiertes Casein als
Stickstoffquelle enthalten. Es können
höhere Konzentrationen an enzymatisch hydrolysiertem Casein verwendet werden, aber
es ergibt sich kein weiterer Vorteil aus der Verwendung von mehr als
10%
davon.
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Der weitere Vorteil der Verwendung von Glycerin anstatt von Dextrose
als Kohlenstoffquelle geht aus den Ergebnissen gemäß Tabelle I hervor. Die End-pH-Werte
in dieser Reihe liegen in jedem Falle in oder dicht bei dem optimalen pH-Bereich,
wie er in der USA-Patentschrift 3 278 378 angegeben ist. Wesentlich höhere
Antibiotikum-Gehalte werden bei diesem Versuch erzielt und Werte von 40,5 und 4493
Einheiten/ml sind festgestellt worden.
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Eine Reihe von Vergleichsversuchen wurde durchgeführt, um zu bestimmen,
ob sich andere Mono- oder Disaccharide in einer ähnlichen Weise, wie sie für Dextrose
beschrieben wurdeg verhalten oder nicht und weiterhin, um festzustellen, ob andere
Polyole, wie Sorbit oder Mannitg das Glycerin ersetzen können. Diese Versuche wurden
in Schüttelkolben durchgeführt unter Verwendung von
10 ml Medium, das in
einem
250 ml Erlenmeyerkolben enthalten war# der auf einer rotierenden Schüttelmaschine
befestigt war, die mit
250 - 300 rpm und bei einer Temperatur von
37 Oc betrieben wurde. Die Eineaat bestand aus 0,02 Vol.-% einer Kultur von
8. staphylolyticus NRRL
B-2628 in der log-Phaae. Ein Medlum der folgenden
Zusammensetzung, eingestellt auf
| einen Anfangs-pH-Wert von 7,3 , wurde verwendet: |
| enzymatisch hydrolysiertes Casein 4,82 Gew.-% |
| Natriumehlorid 095 n |
| Dikaliumhydrogenphosphat 0925 ff |
| Soyapepton 095 n |
| Kohlenstoffquelle verschiedene Mengen wie in |
| der Tabelle angegeben. |
Die nachfolgende Tabelle gibt die pH-Werte und die Lysostaphin-Konzentrationen der
Medien für die verschiedenen Kohlenstoff-Nährquellen bei unterschiedlichen Konzentrationen
nach 17-stündiger Züchtungszeit wieder. Die Lysostaphin-Konzentration wird in Aktivitätseinheiten
pro ml Medium angegeben» wie sie gemäß dem in der USA-Patentschrift
3 278 378
beschriebenen Analyseverfahren bestimmt wurden.
Höhere Antibiotikum-Gehalte werden regelmäßig bei Verwendung von
0,5 % oder mehr an Glycerin oder von
190 % oder mehr an Mannoseg oder
Galaktose als Kohlenstoffquelle im Vergleich zu Dextro«se erzielt. Daß sich weder
relativ übermäßig saure noch basische Züchtungsflüssigkeiten bildeng ist ebenfalls
augenscheinlich. Bestimmte andere Nährstoffe, wie Sorbit, Mannitg Arabinose und
Maltose, die zwar kein saures Züchtungsmedium hervorrufen, sind dennoch nicht imstande,
hohe Antibiotikum-Konzentrationen zu liefern.
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Wenn man nun die in Tabelle II gezeigten Dextrose-Züchtungen bei niedrigen
Konzentrationen in der Größenordnung von 0,25 und 095 Gew.-% betrachtet,
dann ist die Neigung zur Bildung eines sauren Züchtungsmediums weniger ausgeprägt.
Wenn aber die Dextrosekonzentration erhöht wird mit dem Zielg größere Mengen an
Antibiotikum pro Volumen Züchtungsmedium zu produzieren# tritt eine erhebliche Säurekonzentration
auf, die den Antibiotikum-Gehalt stark herabsetzt.
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Der bevorzugte Konzentrationsbereich für die ausgewählten assimilierbaren
Kohlenstoffquellen der Erfindung, Glycering Mannose und Galaktose, beträgt
0,5 - 5 Gew.-%, bezogen auf das Medium. Es können höhere Konzentrationen
angewendet werden, aber ein ersichtlicher Vorteil hinsichtlich des Antibiotikum-Gehalts
ergibt sich nicht. Bei Konzentrationen von weniger als 095 Gew.-% an Glycerin,
Galaktose
oder Mannose scheint die Menge an angebotenem assimilierbarem
Kohlenstoff der begrenzende Faktor bezüglich der Ausbeute zu sein.
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. Es wurden verschiedene organische Stickstoffquellen bewertet,
um festzustellen, ob der bei Glycerin, Mannose und Galaktose in dem Caseinhydrolysat-Medium
festgestellte günstige Effekt auch mit anderen verwandten Stickstoff-Nährstoffen
auftritt. Es wurden Medien.der folgenden Zusammensetzung hergestellt: organische
Stickstoffquelle 5%
Soyapepton 095%
Natriumehlorid 095%
.Dikaliumhydrogenphosphat
0925%
Glycering Galaktose oder Dextrose igo% Das Medium wurde auf einen pH-Wert
von 793 eingestelltg beimpft und wie bei den vorhergehenden Versuchen, bei
denen verschiedene Kohlenstoffquellen miteinander verglichen worden waren, beschrieben
wurde, inkubiert. Für jede Stickstoffquelle wurden parallele Züchtungen durchgeführt
unter Verwendung von Glycering Galaktose und Dextrose als Hauptkohlenstoffquelle.
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Die Ergebnisse dieser Versuche sind nachfolgenclw aufgeführty wobei
der pH-Wert des Mediums und die mit demselben durchgeführte Bestimmung des Lyoostaphins
am Ende der Züchtungezeit aufgeführt werdens
| Enzymatisches Verdauungsprodukt von tierischem Gewebe |
| (Medo Peptone, Wilson): Glycerin. pH 7.10, Lysostaphin, |
| 20 Einheiten/ml; Dextrosey PR 59609 lysostaphing |
| 13,6 Einheiten/ml; Galaktose, pH 7.85,
Lysostaphing |
| 28 Einheiten/ki. |
| Panereatin-Verdauungsprodukt von Herzmuskel (Myosateg |
| Baltimore Biological Laboratories): Glycering |
| pH 79509 lysostaphing 21,5 Einheiten/ki;
Dextrose, |
| pH 5,65, Lysostaphin, 4,8 Einheiten/ml; Galaktose, |
| pH 8,05, Lysostaphin, 19,2 Einheiten/Ini. |
| Pancreatin-Verdauungsprodukt von Gelatine (Gelatone.Difeo): |
| Glycerin, pH 5950t Lysostaphing 2,4 Einheiten/Ml; |
| Dextrose, pH 59009 lysostaphint 1,1 Einheiten/ini; |
| Galaktoseg pH 7980, Lysostaphin, 4,4 Einheiten/mi. |
| Peptisches Verdauungsprodukt von tierischem Gewebe |
| (Thiotone, Baltimore Biologieal Laboratories): |
| Glycerini pH 79659 Lysostaphing 14,9 Einheiteniml; |
| Dextrose, pH 5j409 Lysostaphing < 0,2
Einheiten/mi; |
| Galaktose, pH 89009 Ly-sostaphing 1690
Einheiten/ini. |
| Lösliches tierisches Protein (Swift, SSAP): |
| Glycering pH 6940p Lysostaphing 5,2 Einheiten/Ml; |
| Dextrose, pH 49709 Lysostaphin..Z0,4 Einheiten/mi; |
| Galaktose, pH 79309 Lysostaphing 0,7 Einheiten/ki. |
| Bei jeder Züchtung trat ein kräftiges Wachstum der |
| Eineaat von S. staphylolytieue auf. Obwohl eine Variabili- |
| tät hinsichtlich der Güte der organischen Stickstoff- |
| quellen bezüglich der Antibiotikum-Produktion augenschein- |
lieh ist, belegen diese Versuche dennochp daß gleichmäßig überlegene
Ergebnisse mit den vorliegenden Kohlenstoffquellen gegenüber Dextrose erzielt worden
sind.
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Eine Reihe von Versuchen wurde durchgefü hrt, um den optimalen pH-Wert
für die Lysostaphin-Produktion mit
S. staphylolytieus bei Anwendung von Glycerin
als assimilierbare Kohlenstoffquelle festzustellen. Ein Fermenter aus rostfreiem
Stahl, ausgestattet mit automatischer pH-Regulierung des Züchtungsmediums durch
Zusatz entweder eines sauren oder alkalischen Neutralisationsmittels während des
Züchtungszeitraumes, der 20 Liter Medium der folgenden Zusammensetzung enthielt,
wurde verwendet:
| enzymatisch hydrolysiertes Casein 4,82 Gew.-% |
| Soyapepton 095 tl |
| Natriumehlorid 095 |
| Dikaliumhydrogenphosphat 0925 |
| Glycerin 190 |
Die folgenden Ergebnisse wurden in getrennten Versuchen, bei denen der pH auf die
nachstehend angegebenen Werte eingestellt und gehalten wurde, erzielt: Beobachtete
maximale Lysostaphin-Anreicherung:
| pH-Wert Zeit Einheiten/ml |
| 590 17 Stunden < 092 |
| 59-5 13 Stunden < 092 |
| 690 13 Stunden 297 |
| 695 13 Stunden 792 |
| 790 13 Stunden 1990 |
| 7.95 15 Stunden 1798 |
| 890 12 Stunden 1992 |
| 895 12 Stunden 1090 |
| 990 18 Stunden < 092 |
Es wurde gefundeng daß der pH-Bereich von
6,5 - 895
vorteilhaft
war. Der bevorzugteste Bereich jedoch, und zwar aufgrund der wesentlich höheren
Antibiotikum-Ausbeute, liegt zwischen
7,0 und 8,0; Bein ähnlichen Auswahlversuchen
wurde gefunden, daß man bei demselben pH-Bereich mit Dextrose arbeiten kann, wenn
man 4,0
- 10 Gew.-% enzymatisch hydrolysiertes Casein als Stickstoffquelle
benutzt.
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Die hier verwendeten Ausdrücke Stickstoffquelle und Kohlenstoffquelle
beziehen sich auf Bestandteile des Züchtungsmediums, die von dem Mikroorganismus
S.staphylolytieus assimilierbar sind und zum Wachstum desselben führen, was sich
durch den Anstieg des Gesamt-Zellengewichtes und der Produktion des Antibiotikums
Lysostaphin zeigt. Dies ist die übliche dem Fachmann geläufige Bedeutung dieser
Ausdrücke.
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Obwohl verschiedene Ausführungsformen der Erfindung oben gezeigt wurden,
wird darauf hingewiesen, daß die Erfindung nicht hierauf beschränkt ist, da zahlreiche
Modifikationen vorgenommen werden können.- Deshalb sollen alle solche Modifikationen
in den Geltungebereich der nachfolgenden Patentansprüche fallen.