DE1745121A1 - Reagenz und Verfahren zur Bestimmung von Kupplungsverbindungen - Google Patents

Reagenz und Verfahren zur Bestimmung von Kupplungsverbindungen

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Description

betreffend
Reagenz und Verfahren zur Bestimmung von Kupplungsverbindungen
Die Erfindung betrifft die Bestimmung von Kupplungsverbindungen, insbesondere betrifft die Erfindung die Bestimmung von aromatischen Hydroxyl- und Aminoverbindungen und anderer Verbindungen, die einer sichtbaren Veränderung bei Kupplungsreaktionen mit Bazoniumsalzen unterliegen.
Eine Anzahl von Verfahren zur Bestimmung von Kupplungsverbindungen sind bekannt. Hierzu gehören sowohl instrumentielle wie chemische Verfahren. Im allgemeinen sind die instrumenteilen Verfahren zu komplex, um von anderen als von besonders in deren Verwendung ausgebildeten Personen angewendet zu werden. Die meisten chemischen Verfahren erfordern ebenfalls eine relativ grosse Übung.
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ORIGINAL INSPECTED
Eines der bekanntesten chemischen Verfahren zur Bestimmung dieser Verbindungsklasse ist das Verfahren der Kupplung eines aromatischen Diazoniumsalzes mit reaktiven Kupplungsverbindungen, wie z.B. Phenolen oder aromatischen Aminen oder Verbindungen, die aktive Methylengruppen oder aktive Methylgruppen enthalten.
Die Anwendung dieses Verfahrens ermöglicht die Bestimmung von Phenolen oder aromatischen Aminen durch einfache colorimtrische Bestimmungsmethoden. Jedoch verläuft die Reaktion mit Diazoniumverbindungen derart, dass sie unter sorgfältig geregelten Bedingungen der Temperatur und der pH-Werte durchgeführt werden muss und erfordert daher eine entsprechend grosse Sorgfalt, wenn man die Reaktion erfolgreich durchführen will.
Es ist dementsprechend Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung reaktiver Kupplungsverbindungen zu schaffen, wobei keine der Nachteile des Standes der Technik auftreten.
Es ist ein anderes Ziel der Erfindung, ein solches Verfahren zu schaffen, das bequem zu handhaben ist und keine grosse Übung oder einen hohen Stand der Ausbildung beim Arbeiten mit analytischen Instrumenten oder bei der Ausführung komplexer chemischer Reaktionen erfordert.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Ausführung der genannten Bestimmung in sehr kurzer Zeit und ohne besondere Ausrüstung.
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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Bestimmung reaktiver Kupplungsverbindungen, wenn diese in sehr niedriger Konzentration anwesend sind.
Andere Ziele und Vorzüge dieser Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
Es wurde gefunden, dass eine geeignete Bestimmungsmethode für reaktive Kupplungsverbindungen durch Verwendung eines unlöslichen Farbentwicklers geschaffen werden kann. Ein solcher Entwickler kann durch diazotieren eines polymeren Materials, welches freie aromatische Aminogruppen enthält, hergestellt werden.
Offenbar ist das geeignetste Verfahren zur Erzeugung freier aromatischer Aminogruppen, die an ein polymeres Gerüst gebunden sind, die Nitrierung von benzolartigen Einheiten, die an ein Polymeres wie Polystyrol gebunüen sind, und folgender Reduktion der erhaltenen Nitrogruppen zu Aminogruppen. Die aromatischen Aminogruppen können dann leicht durch eine Behandlung mit salpetriger Säure oder einem anderen Diazotierungsmittel diazotiert werden, gewöhnlich durch Umsetzung mit einer verdünnten Lösung von Natriumnitrit und einer Säure, wie Salzsäure. Dieses Verfahren ist in der USA-Patentschrift 2 274 551 beschrieben. Jedoch hat dieses Verfahren den Nachteil, dass die Nitrierungsstufe, die die Verwendung eines Oxydationsmittels einschliesst, eine Verfärbung der Produkte verursacht, die nicht vollständig nach der Reduktion und folgender Diazotierung verschwindet.
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Im Gegensatz hierzu wird nach dem erfindungsgemässen Verfahren kein Oxydationsmittel verwendet und es werden daher polymere Diazoniumsalze derselben Farbe erhalten, wie das Amin, von dem sie hergeleitet sind. Diese Salze können als unlösliche Farbentwickler wirksam verwendet werden.
Um solche polymeren Diazoniumsalze zu schaffen, beginnt man mit einem polymeren Material, das saure Gruppen, wie Carboxyl-, SuIfon- oder Phosphorsäuregruppen enthält. Derartige Materialien sind im Handel erhältlich in der Form verschiedener Kationenaustauscherharze. Diese Harze können mit einem Halogeniermittel umgesetzt werden, z.B. einem Thionylhalogenid wie SOCIp, oder einem Phosphorhalogenid wie PCI, oder PCIj-. Wahlweise können die Natrium- oder Kaliumsalze derartige Harze mit POCl, oder SOpCIp umgesetzt werden. Z.B. ergibt die Reaktion eines carboxylgruppenhaltigen sauren Kationenaustauscherharzes bei der Reaktion mit Thionylchlorid das Acylchlorid des Harzes gemäss der folgenden Gleichung
SOCIp
Harz-COOH - > Harz-COCl
Das Harzhalogenid kann dann mit einem aromatischen PoIyamin in Wasser oder in einem wasserfreien organischen lösungsmittel umgesetzt werden, um ein Harzamid zu schaffen, in welchem wenigstens eine aromatische Aminogruppe frei bleibt. Z.B. wird unter Verwendung solcher aromatischer Polyamine wie Benzidin, o-Tolidin , o-Dianisidin, und den Phenylendiaminen (ortho, meta oder para) das Harz-halogenid zu einem" Harz-amid umwandelt, das eine freie aromatische Aminogruppe gemäss der
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folgenden Gleichung enthält
Harz-COCl + NH2-Ar-ITH2 > Harz-C0-NH-Ar-NH2 · HCl
in welcher Ar den aromatischen Kern bedeutet, an den die beiden Aminogruppen gebunden sind. Ein solcher aromatischer Kern kann monocyclisch sein, also benzolartig, oder polycyclisch wie im Pail von Derivaten des Naphthalins, Biphenyls, Anthracene oder Phenanthrene.
Das erhaltene Harz-amid, welches eine freie aromatische Aminogruppe enthält, kann diazotiert werden, wobei Harzdiazoniumsalze erhalten werden, die mit Kupplungskomponenten reagieren können zu gefärbten Azο-Produkten.
Die Diazotierung kann z.B. durch Umsetzen des Harz-amids mit Natriumnitrit in Gegenwart einer Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Fluoborsäure, durchgeführt werden, wobei ein polymeres Diazoniumsalz gebildet wird. Dieses Diazoniumsalz ist in hohem Maße unlöslich wegen seiner polymeren Natur, und stabil wegen der Gegenwart von unreagierten Säuregruppen im Harz. Diese Reaktion kann wie folgt dargestellt werden.
NaNO9 © Q
Harz-CO-NH-Ar-NH» - -> Harz-OO-NH-Ar-ΝΞΝ Bl,
ά HBF 4
Diese polymeren Diazoniumsalze können längere Zeit gelagert werden und in wässriger Lösung verwendet werden, um damit jede Verbindung zu bestimmen, die mit ihnen kuppelt. Insbesondere sind diese polymeren Diazoniumsalze nützlich als unlösliche
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Farbentwickler bei der Analyse von aromatischen Hydroxyl- und Aminoverbindungen und anderer Verbindungen, die mit Diazoniumsalzen kuppeln, wobei stark gefärbte Azoderivate erhalten werden. '
Diese Kupplungsreaktion kann anhand eines a-Naphthols oder ß-Naphthols mittels der folgenden Gleichung erläutert werden:
Harz-CO-NH-Ar-NSN
Die polymeren Diazoniumsalze gemäss der Erfindung reagieren mit einer grossen Zahl Kupplungsverbindung wie den aromatischen Aminen, Phenolen, Naphtholen, Derivaten der Naphthalincarbonsäure, Nitroderivaten von Aminen und Phenolen, Nitroparaffinen, Substanzen mit reaktiven Methylen- und Methylgruppen wie den Acetessigestern, ß-Oxoglutarsaure oder 5-Pyrazolonderivaten, SuIfonsäurederivaten des Phenols und Naphthols und Sulfonsäurederivaten von aromatischen Aminen.
Die Kupplungsreaktion zur Bildung der gefärbten Azverbindung ist im allgemeinen quantitativ, d.h. eine bestimmte Menge des polymeren Diazoniumsalze3 wird mit einer vorgelegten Menge einer Kupplungsverbindung unter geeigneten Bedingungen reagieren. Deswegen können die polymeren Diazoniumsalze gemäss der Erfindung als unlösliche Farbentwickler für die quantitative oder semiquantitative Bestimmung von Kupplungsverbindungen auf verschiedene Weise verwendet werden.
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Diese unlöslichen Farbentwickler sind besonders brauchbar, wenn sie in Form von Reagenzstreifen verwendet werden. Z.B. kann der unlösliche Farbentwickler auf Blätter von saugfähigen/· Gellulosematerial ,beschichtet werden, wie Filtrierpapier, um Blätter herzustellen, die Zonen des Farbentwicklers enthalten.
iToeh besser als das blosse Beschichten von Celluloseblättern besteht eine besonders geeignete und elegante Methode darin, fasrige Farbentwicklerblätter aus einer wässrigen homogenisierten Mischung von unlöslichen"; Farbentwickler und Fasercellulosematerial herzustellen. Diese fasrigen Farbentwicklerblätter können dann verwendet werden zur Herstellung von Streifen oder Scheiben des Farbentwicklers.
Die unlöslichen Farbentwickler gemäss der Erfindung können auch in der Form von Tabletten verwendet werden, die durch Mischen des unlöslichen Farbentwicklers mit geeigneten Tablettiermaterialien hergestellt werden können, z.B. pulverisierter Cellulose u.dgl.
Die Streifen können entweder als kontinuierliche oder diskontinuierliche Streifen hergestellt werden, d.h. die den Farbentwickler enthaltende Gebiete können kontinuierlich verlaufen oder mit inerten Gebieten abwechseln. Z.B. können kontinuierliche Streifen durch eine ganze reaktive Zone gebildet werden, die auf einer Unterlage wie Papier, Karton, Holz, Glasfaser oder Kunststoff befestigt ist. Skaleneinteilungen, die den Mengen des zu bestimmenden Produkts entsprechen, können auf einen solchen Träger aufgedruckt werden. Beim diskontinuierlichen Typ wechseln die reaktiven Zonen mit nicht reaktiven Zonen ab. * 2098 36/0937
Für die Bestimmung unter Verwendung von Streifen wird eine aufsteigende oder absteigende chomatographisehe Technik angewendet. Eine vorbestimmte Menge der Testlösung für die Kupplungsverbindung wird in die Streifen absorbiert und dann die Streifen mit Wasser gewaschen. Die Kupplungsverbindung erzeugt in Verbindung mit dem unlöslichen Farbentwickler eine Färbung. Da die Kupplungsreaktion quantitativ ist, wird die Farbintensität durch die chemische Zusammensetzung des reaktiven Gebiets bestimmt werden, d.h. durch die Menge an unlöslichem Farbentwickler, der im Streifen vorliegt, während die Ausdehnung des gefärbten Gebietes, gemessen mittels der vorher genannten aufgedruckten Skaleneinteilung, proportional der Menge der Kupplungsverbindung sein wird, die in Berührung & mit der reaktiven Zone kommt.
Die Konzentration des Kupplungsproduktes kann bei den kontinuierlichen, aus einer Zone bestehenden Streifen mittels der bereits genannten aufgedruckten Gradeinteilung bestimmt werden. Bei der diskontinuierlichen Ausführungsform des Streifens mit mehreren Zonen wird die Anzahl der Zonen, bei denen eine Färbung entwickelt wird, die Konzentration der Kupplungsverbindung, die bestimmt werden soll, anw*zeigen. Wenn z.B. eine Reihe von 3 Zonen verwendet wird, die den Farbentwickler auf einem saugfähigen Trägermaterial enthält, ist es möglich, die Menge von Kupplungsverbindungen zu bestimmen durch das Ausmaß, in dem die ankommende lösungsmittelfront des Testmediums die Kupplungsverbindung am Streifen entlang führt. Das heißt, dass eine geringere Konzentration der Kupplungsverbindung mit dem Farbentwickler in der ersten Zone reagieren kann, aber nicht mit dem
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in der zweiten oder dritten Zone. Eine etwas höhere Konzentration kann mit dem Farbentwickler in den ersten beiden Zonen reagieren und eine noch höhere Konzentration mit dem in allen drei Zonen.
Wenn Scheiben verwendet werden, wird eine vorbestimmte Menge zur untersuchenden Flüssigkeit in die Scheibe absorbiert. Die Reaktion zwischen dem Farbentwickler und einer vorhandenen Kupplungsverbindung findet in der Scheibe statt und es wird eine Färbung entwickelt, deren Intensität proportional zur Menge des Kupplungsmittels ist. Die erhaltene Färbung wird mit einer geeigneten Farbkarte verglichen und die Menge der Kupplungsverbindung, die in der Prüflösung vorhanden ist, bestimmt. Tabletten werden in ähnlicher Weise verwendet.
Zusätzlich zur Verwendung des unlöslichen Farbentwicklers gemäss der Erfindung für die Bestimmung reaktiver Kupplungsverbindungen ist es ebenfalls möglich, Systeme zu bestimmen, welche fähig sind, reaktive Kuppiflungsverbindungen zu bilden. Da viele verschiedene Enzymsysteme dazu fähig sind, die Freisetzung von Kupplungsverbindungen aus ihren Vorläufern zu katalysieren, können diese Systeme leicht bestimmt werden, indem der unlösliche Farbentwickler gemäss der Erfindung zusammen mit dem
geeigneten Vorläufer einer Kupplungsverbindung als Substrat für das Enzym verwendet wird, das bestimmt werden soll. Repräsentative Beispiele dieser enzymatischen Reaktion sind die folgenden:
a. Lipase: Das verwendete Substrat kann Naphthyllaurat, -myristat oder -caprylat sein. Die lipase hydrolysiert das Substrat, wobei das Naphthol freigesetzt wird, das die spezifische Verbindung ist, die bestimmt werden soll.
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- 1ο
b. Acetylesterase: Das verwendete Substrat kann Acetylnaphthol oder Acetylnaphthylamin sein. Die enzymetische Hydrolyse setzt Naphthol oder Naphthylamin frei, welche reaktive Kupplungsverbindungen sind.
c. N-Acetyl-ß-glucosaminidase: Wenn als Substrat Naphthylß-acetylglucosamin verwendet wird, setzt die enzymatische Reaktion Naphthol frei.
d. Transaminase (GrOT): Bei Transaminierungen mit GOT wird I-Glutamat+a-Oxalacetat gebildet aus L-Aspartat+a-Oxoglutarat. Das a-Oxalacetat, das in dieser Reaktion gebildet wird, kann mittels des unlöslichen Farbentwicklers gemäss der Erfindung bestimmt werden, da seine aktive Methylengruppe mit Diazoniumsalzen reagiert.
e. Leucin-aminopeptidase: Bei der Verwendung von L-Leucylß-naphthylamid als Substrat setzt die enzymatische Reaktion ß-Naphthylamin frei.
f. Saure und basische Phosphatesen: Die verschiedenen Phosphatasen katalysieren die Hydrolyse von aromatischen Phosphaten zu den entsprechenden aromatischen Hydroxylverbindungen, die dann leicht mittels des Farbentwicklers gemäss der Erfindung bestimmt werden können.
Viele geeignete Methoden können zur Bestimmung dieser Systeme verwendet werden. Z.B. kann eine Zone des saugfähigen Trägers mit einem geeigneten Substrat für ein solches Enzymsystem imprägniert werden, mit weicher eine Zone des Farbentwicklers
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verbunden wird. Wenn die Substratzone mit einer Lösung, die eine Phosphatase enthält, angefeuchtet wird, tritt die enzymatische Reaktion ein, die in der Freisetzung einer aromatischen Hydroxylverbindung resultiert. Durch Waschen mit Wasser tritt die letztere in Berührung mit dem unlöslichen Farbentwickler in der benachbarten Zone, wobei eine Färbung erhalten wird.
Eine andere geeignete Methode zur Verwendung des unlöslichen Farbentwicklers gemäss der Erfindung zur Bestimmung eines Enzymsystems sieht vor, dass das Enzymsubstrat in Tablettenform gebracht wird, wobei die Tablette zur Lösung zugesetzt werden kann, die auf die Gegenwart des Enzyms untersucht werden soll. Der Farbentwickler in Form eines saugfähigen Streifens oder einer Tablette kann dann mit der erhaltenen Lösung befeuchtet werden, wodurch die gewünschte Farbreaktion auftritt, wenn das Enzym anwesend ist. Ein solches Bestimmungsverfahren ist z.B. zur Untersuchung von Milch auf die Gegenwart von Phosphatasen zur Prüfung der Pasteurisierung geeignet. Es ist bekannt, dass die Pasteurisierung zeitweilig Phosphatase in Milch zerstört und dass die Gegenwart von Phosphatase in pasteurisierter Milch unmittelbar nach der Pasteurisierung ein Anzeichen von ungenügender Pasteurisierungstemperatur oder von der Gegenwart von roher Milch ist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.
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Beispiel 1
Ein Kationenaustauscherharz auf der Basis von PoIymethacrylsäure (Amberlite IRA 64) in der Säureform wurde zu einem feinen Pulver gemahlen (Teilchengröße im Bereich von 20 bis 50 Mikron) und getrocknet. 50 g des erhaltenen Pulvers wurden mit 200 ml Thionylchlorid unter Rühren 6 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert und das erhaltene chlorierte Harz mit wasserfreiem Toiol gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Das so erhaltene chlorierte Harz enthielt 0,98 mAqui— valente -COCl pro Gramm«
Beispiel 2
Die genannte feine Form des Harzes mit einer Partikelgröße von 20 bis 50 Mikron wurde unter denselben Bedingungen 3 Stunden chloriert. Das erhaltene chlorierte Harz enthielt 0,66 mAquivalente pro Gramm.
Beispiel 3
Die bereits genannte fein verteilte Harzform mit einer Partikelgröße von 20 bis 50 Mikron wurde unter den gleichen Bedingungen 9 Stunden chloriert. Das Harz enthielt 1,4 mÄquivalente -COCl pro Gramm.
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Beispiel 4
Ein Kationenaustauscherharz auf Basis von Polymethacrylsäure (Amberlite IRA 64) in der Säureform, wurde zu einem feinen Pulver gemahlen (Partikelgröße 1 bis 5 Mikron) und dann getrocknet. Die Chlorwsierung fand gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 während 3 Stunden statt. Das erhaltene chlorierte Harz enthielt 0,84 rnlquivalente pro Gramm.
Beispiel 5
Ein Kationenaustauscherharz auf Polymethacrylsäure-"basis (Amberlite IRA 64) wurde in das Matriumsalz umgewandelt und zu einem feinen Pulver zermahlen9 (Partikelgröße zwischen 50 bis 70 Mikron) und dann getrocknet. Eine Menge von 50 g des Natrimsalzes des Harzes wurde 6 Stunden in 100 ml wasserfreiem Tetrachlorkohlenstoff und 100 ml Sulfurylchlorid unter Rück&ehluß erwärmt. Das Harz wurde filtriert und mit Tetrachlorkohlenstoff gewaschen und dann getrocknet. Das erhaltene chlorierte Harz enthielt 0,56 mlquivalente -COCl pro Gramm.
Beispiel 6
Eine Menge von 10 g chloriertes Harz, das gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt war, wurde in eine Lösung von o-Dianisidin (3,3 g) in 75 ml trockenem Toluol
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gegossen. Die erhaltene Suspension wurde auf 85 C 5 Stunden unter Rühren erhitzt. Das Gemisch wurde filtriert und
das Harz in Absätzen mit Äthanol (100 ml) gewaschen, aus dem es möglich war, den Überschuß an Amin
wieder zu gewinnen» Das Harz wurde dann in eine ch^romatographische Säule eingefüllt und mit 2n-HBF, (200 ml) gewaschen und dann mit Wasser bis zum Neutralpunkt der abfließenden Flüssigkeit. Das erhaltene acylierte Aminharz zeigt nach der Analyse auf diazotierbaren Stickstoff 47 mg an Harz einfach gebundenes o-Dianisidin, pro Gramm.
Beispiel 7
Eine Menge von 10 g des chlorierten Harzes, das gemäß Beispiel 1 hergestellt war, wurde in eineLösung von o-Dianisidin (3»3 g) und Triäthylamin (10 g) in 75 ml
trockenem Toluol gegossen. Die erhaltene Suspension wurde auf 850C 6 Stunden unter Rühren erhitzt. Das Harz wurde
gemäß Beispiel 6 gewaschen und dann getrocknet. Im erhaltenen acylierten Aminharz waren aufgrund der Analyse auf
η
diazotierbare;r Stickstoff 61 mg o-Dianisidin, das am
Harz einfach gebunden war, pro Gramm anwesend.
Beispiel 8 '
Eine Lösung von o-Dianisidin-dihydrochlorid (4,3 g) in 200 ml Wasser wurde auf eine Temperatur von 0 bis 50C abgekühlt. Dieser Lösung wurde eine Menge von 10 g des
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chlorierten Harzes aus Beispiel 1 zugegeben. Das Rühren und Abkühlen wurde forgeführt, während 30 ml 20^-iges RaOH langsam zugegeben wurden bis zu einem pH-Wert von 11-12. Nach 14—stündigem Eühren und Abkühlen wurde die Suspension zentrifugiert und der Niederschlag mit Methanol gewascheno Die Waschflüssigkeiten wurden für die folgende Wiedergewinnung von unreagiertem Amin aufgehoben. Das Harz wurde dann mit HBF, gewaschen und gemäß Beispiel 6 getrocknet. Das erhaltene aeylierte Aminharz zeigte nach der Analyse auf diazotierbarejn Stickstoff eine Menge von 7,20 mg von am Harz einfach gebundenem o-Dianisidin pro Gramm *
Beispiel 9
Eine Lösung von m-Phenylendiamin χ 2HCl (1,8 g) in 50 ml Wasser wurde auf eine Temperatur von 0 bis 5°C abgekühlt. Dieser Lösung wurde einer Menge von 10g des chlorierten Harzes, das gemäß Beispiel 1 hergestellt war, zugegeben und 24 ml 20^-iger NaOH langsam zugegeben bis zu einem pH-Wert von 11-12, während die Mischung geführt und gekühlt wurde. Nach 14 Stunden wurde das Harz abfil— triert und gemäß Beispiel 8 gewaschene Nach der Analyse zeigte des erhaltene aeylierte Aminharz 15,9 mg m-Phenylendiamin, das an das Harz einfach gebunden war, pro Gramm.
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Beispiel 10
Eine Menge von 10 g chloriertes Harz, das gemäß Beispiel 3 hergestellt war, wurde in eine Lösung von oöDianisidin (5,25 g) in 75 ml trockenem auf 800C erhitztem Toluol gegossen. Die erhaltene Suspension wurde H Stunden auf 800C erhitzt. Nach dieser Zeit wurde die Suspension filtriert und das erhaltene Harz wie in Beispiel 8 gewaschen. Das acylierte Aminharz, das so erhalten wurde, zeigte eine Menge von 63 mg einfach gebundenes o-Dianisidin»
Beispiel 11
Eine Menge von 10 g chloriertes Harz, das gemäß Beispiel 3 erhalten war, und eine Menge von 5»95 g o-Tolidindihydrochlorid wurden gemäß der Bedingungen von Beispiel 9 umgesetzt. Das erhaltene acylierte Aminharz enthielt 11,8 mg einfach gebundenes of o-Tolidin pro Gramm.
Beispiel 12
Eine Menge von 10 g chloriertes Harz, das gemäß Beispiel 3 erhalten war, und eine Menge von 5»3 g Benzidindihydrochlorid wurden gemäß den Bedingungen von Beispiel 9 umgesetzt. Das erhaltene acylierte Aminharz enthilet 45 mg einfach gebundenes o—Tolidin pro Gramm.
Beispiel 13
• Eine Menge von 3 g des acylierten Aminharzes gemäß Beispiel 6 wurde in 10 ml 3n-HBF^ suspendiert und auf eine
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Temperatur von 0 bis 5°C abgekühlt. Die erhaltene Suspension wurde gerührt, während tropfenweise 10 ml von In-NaNO zugefügt wurden. Das Rühren wurde fortgesetzt und die Temperatur 4 Stunden gehalten. Die Mischung wurde dann zentrifugiert und das isolierte Diazoniumsalz des acylierten Aminharzes Harz-G0-WH-Ar-N=I BP- getrocknet im Vakuum. Dieses Verfahren konnte auf alle acylierten Aminharze ausgedehnt werden, die gemäß den Beispielen 6-12 hergestellt worden waren.
Beispiel 14
Diazoniumsalze von acyliertem Aminharz wurden mit a-Eaphthol umgesetzt zur Bestimmung der Kupplungsaktivität und zur Beobachtung der entwickelten Färbung. Die Ergebnisse unter Verwendung von Diazoniumsalzen von acylierten Aminharzen, die von jedem Harz der Beispiele 6-12 hergestellt waren, sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle I
Aminharz
des a		 fixiertes
a-Naphthol in
Bg/g Diazo-
2y¥¥ifxlnHarzes		 entwickelte
Färbung
Beispiel Harz-o-Dianisidin 27.21 Mittelpurpurrot
6 Harz-o-Dianisidin 36.00 Tiefpurpurrot
7 Harz-o-Dianisidin 4.25 Hellpurpur
8 Harz-m-Phenylen-
damin		 21.4 Orange
9
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Beispiel
fixiertes a-Haphthol in
Aminharz mg/g Dianzoniumsalz des acylierten Harzes
entwickelte Färbung
1Q
11 12
Harz-o-Dianisidin
Harz-o-Tolidin Harz-Benzidin
29.2 8.1
35.6
Mittelpurpurrot
Rot
Ziegelrot
Beispiel 15
Ein Gemisch von 8 g Cellulosefasern (auf eine Länge
von etwa 3 mm geschnitten) und 2 g Harz-CO-HH-Ar-ϊίΞΝ: BP.
aus Beispiel 13 wurden homogenisiert in 5 1 Wasser bei einem pH-Wert von 3-4. Die homogenisierte Mischung wurde absitzen gelassen und die Cellulose-Harzschicht, die sich bildete, zu einem Blatt von 25 cm gepresst, welches eine Diazo-Kupplungsaktivität gleich 1/5 derjenigen des Diazoniumsalzes des urspünglichen acylierten Aminharzes besaß,
Beispiel 16
Ein Blattmaterial gemäß Beispiel 15 wurde in Streifen von 0,5 cm Breite geschnitten und in gleicher Weise nicht reaktive Streifen derselben Größe von Eaton-Dikeman 627-65 Filterpapier vorbereitet. Die Streifen der beiden verschiedenen Papierarten wurden mit Klebstoff auf eine wasserfeste Grundlage aus Kunststoff aufgeklebt und ein Blatt mit 3 reaktiven Zonen erhalten, die sich mit zwei nicht reaktiven Zonen abwechselten, wobei der obere und untere
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Teil des Blattes aus zwei Streifen von Filterpapier von 3 cm Breite gebildet wurde. Das erhaltene Blatt wurde in Streifen von je 0,5 cm Breite geschnitten.
Beispiel 17
Das gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 15 hergestellte Blatt wurde in Streifen von 3 mm χ 30 mm geschnitten. Diese wurden auf eine wasserfeste Grundlage aus Kunststoff mit einer Gradeinteilung geklebt. An der Spitze und am Boden der Unterlage wurden zwei Streifen von 3 mm χ 30 mm aus Filterpapier befestigt.
Beispiel 18
Es wurden gemäß den Beispielen 16 und 17 Streifen hergestellt, außer daß einer der Filterpapierendstreifen von 3 cm durch ein Glasfaserpapier ersetzt wurde. Dieses Glasfaserendstück wurde in eine Lösung getaucht der Zusammensetzung gemäß Tabelle 2 (pro ml wässriger Lösung)
Tabelle II
Bestandteil Gewicht, mg
Tris(hydroxymethyl)amino-
methan		 200
ß- oder a-Naphthylph08phat 20
Magnesiumsulfat 0.5
PH = 1
10.3
Die nassen Streifen wurden im Vakuum getrocknet,
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Beispiel 19
Das Verfahren von Beispiel 18 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Zusammensetzung gemäß Tabelle verwendet wurde.
Tabelle III
Bestandteil Gewicht, mg
Natriumfumarat 100
ß- oder a-Naphthyl-
phosphat		 20
Magnesiumsulfat 0.5
pH = 5.05
Beispiel 20
Das Blatt, das gemäß Beispiel 12 hergestellt worden war, wurde auf eine'Kunststoffunterlage geklebt und in Scheibenform geschnittene
Beispiel 21
Es wurden Tabletten hergestellt mit den Bestandteilen, die in Tabelle 4 aufgeführt sind»
folgt Tabelle IV
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Tabelle Bestandteile IY
Tris(hydroxymethyl)
aminomethan
Stärke Gewicht, mg
ß- oder a-Naphthyl-
phosphat		 18
Polyoxyäthylenglycol 2
Magnesiumsulfat 0.2
2.8
0o05
Die Tabletten wogen zwischen 22 und 25 mg.
Beispiel 22 /
Es wurden Tabletten hergestellt mit den Bestana teilen, die in Tabelle 5 angegeben sind.
Tabelle V Bestandteile Gewicht, mg.
Natriumfumarat 10
Stärke 1
ß- oder a-Haphthylphos-
phat		 0.2
PoIy oxyäthylenglyc ol 1
Die Tabletten wogen zwischen 12 und 14 mg.
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Beispiel 23
In ein geeignetes Reagenzglas wurde eine Tablette, die gemäß Beispiel 21 hergestellt war, und zwei Tropfen Wasser eingegeben. Die Tabletten zerfiaLen innerhalb von 10-15 min zu einer trüben Lösung. Ein verdächtiges pathologisches Serum, das analysiert werden sollte, wurde dann zu der lösung im Reagenzglas in einer Menge von 0,1 ml gegeben und das Glas geschüttelte Nach einer Inkubation von 10 min bei einer Temperatur von 370C wurde ein Tropfen 10-#igerOrthophosphorsäurelösung zugegeben.
Ein Versuchsstreifen aus drei Zonen, der gemäß Beispiel 16 hergestellt war, wurde in die lösung eingetaucht und nach 5 min die entwickelte Färbung als purpurrote Färbung erkannt. Alle drei Zonen wurden von der Färbung ergriffen, was anzeigte, daß das Serum einen Wert der Phosphataseaktivität des höchsten Grades besaß, für den der Dreizonen-Versuchsstreifen ausgelegt war, d.h. einen pathologischen Wert. Ein normales Serum, daß in gleicher Weise behandelt wurde, gab nur der ersten der drei Zonen eine Färbung. Wenn ein unbekanntes Serum der ersten und zweiten Zone eine Färbung gegeben hätte, würde es als Grenzfall zu bezeichnen sein.
Beispiel 24-
Der kontinuierliche gemäß Beispiel 17 hergestellte
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Streifen wurde in die Versuchslösung des Beispiels 23 eingetaucht. 5 Minuten später wurde die Aasdehnung des gefärbten Gebietes beobachtet und die Zahl, die dem höchsten Grad der gefärbten Gebiete auf dem kalibrierten Streifen angab, notiert. Werte von 1-3 zeigten einen normalen Wert an, von 3-5 einen Grenzwert und höhere Zahlen zeigten pathologische Werte an.
Beispiel 25
In einem Reagenzglas wurde eine Tablette, die gemäß Beispiel 21 hergestellt war, und drei Tropfen zu untersuchender Milch eingegebene Nach 10 Minuten wurde ein Versuchsstreifen aus einer Zone, der gemäß Beispiel 17 hergestellt war, in die erhaltene Lösung eingetauchte 5 Minuten später wurde die Phosphatase-Konzentration anhand der Färbungsentwicklung der Streifen abgelesen. Die Färbungsentwicklung in richtig pasteurisierter Milch sollte beispielsweise auf die Zahl 1 der Skala beschränkt sein» Höhere Werte zeigen eine nicht ausreichende Pasteurisierung oder die Gegenwart von alternder roher Milch an.
Beispiel 26
Ein Streifen mit drei Zonen, der nach Beispiel 10 hergestellt worden war, wurde an seinem Ende, das das Substrat enthielt, mit 0,05 ml des zu untersuchenden
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Serums "befeuchtet. Nach 10 min wurde der Streifen mit Wasser gewaschen, so daß das freigesetzte Naphthol die Entwicklerzone erreichte. Nach 5 Minuten wurde die Konzentration an Phosphatase wie in Beispiel 23 abgefsen.
Beispiel 27
Ein Streifen mit einer Zone, der gemäß Beispiel hergestellt worden war, wurde an dem das Substrat enthaltenden Ende mit 0,05 ml der zu untersuchenden Milch befeuchtet. Nach 10 Minuten wurde der Streifen mit Wasser gewaschen, so daß das freigesetzte Naphthol die Entwicklerzone erreichte. Nach 5 Minuten wurde die Konzentration an Phosphatase wie in Beispiel 25 abgelesene
Zusammenfassend schafft die Erfindung einen unlöslichen Farbentwickler aus einem polymeren Diazoniumsalz, der zur Bestimmung von Kupplungsverbindungen und verwandten Enzymsystemen verwendet werden kanne
Patentansprüche
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Claims (1)

  1. Pat entansprüche
    1 ο Ein unlösliches polymeres Diazoniumsalz als Farbentwickler aus einem diazotierten! aromatischen Polyamin, welches durch eine Amidbindung an ein Kationenaustauscherharz gebunden ist.
    2 ο Polymeres Diazoniumsalz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , das Kationenaustauscherharz Carboxylgruppen enthält.
    3β Polymeres Diazoniumsalz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, das Kationenaustauscherharz Sulfonsäuregruppen enthält.
    4. Polymeres Diazoniumsalz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , das Kationenaustauscherharz Phosphorsäuregruppen enthält.
    5ο Verfahren zur Herstellung eines unlöslichen polymeren Diazoniumsalz gemäß Ansprüchen 1-4-, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Kationenaustauscherharz,
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    welches saure Gruppen enthält, mit einem Halogeniermittel unter Bedingungen umsetzt, bei denen wenigstens einige der Säuregruppen des Harzes in Acylhalogenidgruppen umgewandelt werden, die Acylhalogenidgruppen mit einem aromatischen Polyamin umsetzt und das freie aromatische Aminogruppen und Amidbindungen enthaltende Harz diazotiert.
    6. Verwendung des unlöslichen polymeren Diazoniumsalzes, gemäß den Ansprüchen 1-4 für die Bestimmung von Kupplungsverbindungen in einem zugesetzten Substrat als Farbentwickler»
    7ο Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man als Substrat ein Enzymsystem verwendet, welches die Freisetzung einer Kupplungsverbindung aus einem Enzymsubstrat katalysiert,
    8e Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß man als Enzymsystem lipase, Acetylesterase, N-Acetyl-ß-glucosaminidase, Transaminase, Leucinaminopeptidase, saure Phosphatase und basische Phosphatase verwendet«
    9β Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß man als Enzymsubstrat ein aromatisches Phosphat verwendet.
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    1Oe Vorrichtung zur Bestimmung einer Kupplungsverbindung mittels des unlöslichen Farbentwickler aus einem polymeren Diazoniumsalz gemäß den Ansprüchen 1-4 gekenn zeichnet durch ein saugfähiges Trägermaterial, welches das;äiazotierte aromatische Polyamin, das über eine Amidbindung an einen Kationenaustauscherharz gebunden ist, enthält.
    11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß zur Bestimmung eines Enzymsystems, welches die Freisetzung einer Kupplungsverbindung aus einem Substrat katalysiert, der saugfähige Träger in eine Mehrzahl von einer nicht aneinander grenzenden Zonen aufgeteilt wird, von denen wenigstens eine ein geeignetes Substrat für das Enzymsystem enthält und wenigstens eine der restlichen Zonen den unlöslichen Farbentwickler auf der Basis des polymeren Diazoniumsalzes enthalte
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