DE1643615C3

DE1643615C3 - Cytostatisch wirksames Arzneimittel

Info

Publication number: DE1643615C3
Application number: DE1643615A
Authority: DE
Inventors: Erik Goeteborg Hallgren; Anna Maria Moendal Staellberg
Original assignee: ASTRA NUTRITION MOELNDAL (SCHWEDEN) AB
Current assignee: ASTRA NUTRITION MOELNDAL (SCHWEDEN) AB
Priority date: 1966-12-16
Filing date: 1967-12-14
Publication date: 1979-09-20
Also published as: GB1194238A; DE1643615B2; NL160164C; NL6717165A; SE347433B; FR1583764A; FI52332B; FI52332C; DE1643615A1; JPS4910724B1; NL160164B

Description

worin eine der Gruppen R¹ und R² ein Wasserstoffatom und die andere eine geradkettige gesättigte Alkoxygruppe mit höchstens 7 Kohlenstoffatomen und R³ eine geradkettige gesättigte oder mono- oder polyungesättigte Alkylgruppe mit 4 bis 21 Kohlenstoffatomen bedeutet, in einem pharmazeutischen Trägermaterial.

Beispielsweise aus der FR-PS 14 06 248, der US-PS 33 42 876 und »Journal of Lipid Research«, Januar 1962, Band 3, Nr. 1, Seiten 31 bis 38, ist es bekannt, daß Grjceryläther mit einer höheren geradkettigen Alkyl- oder Alkenylgruppe, die aus Leberölen von Grönlandhaien und Hundshaien isoliert wurden, in bestimmten Konzentrationen und Dosierungen die Leukozytenbildung im Knochenmark und das Krebszellenwachstum bei Brustkrebs von Mäusen fördern. In der FR-PS 3 809 M und dem korrespondierenden Referat in »Chemical Abstracts«, Band 63,1965, Spalte 1667 f sind ähnliche Glyryläther beschrieben, die Sauerstoff in der Form von Ätherbrücken oder Substituenten von ein oder zwei Wasserstoffatomen enthalten können. Als welche chemische Gruppe der Sauerstoffsubstituent vorliegen soll, ist nicht gesagt, und die Beispiele enthalten keine konkreten Verbindungen, aus denen die chemische Konstitution herleitbar wäre. Auch bezüglich dieser Verbindungen ist in der FR-PS 3 809 M gesagt, daß sie die Zahl der Leukozyten und Thrombozyten erhöhen, was in Übereinstimmung mit den Wirkungsangaben bezüglich der in den erstgenannten Druckschriften beschriebenen Glyceryläther steht. Im übrigen fördern die aus den obigen Druckschriften bekannten Glyceryläther das Wachstum bestimmter Bakterien, wie von Lactobacillus lactis.

Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe bestand nun darin, neue Arzneimittel mit zytostatischer Wirksamkeit auf Krebszellen zu bekommen.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel mit cytostatischer Wirksamkeit enthält wenigstens einen AlkyUa= glyceryläther der allgemeinen Formel

CH₂ OCH₂CHR' — CHR² — R¹ CH-OH

CH₂ OH

wo-in eine der Gruppen R¹ und R² ein Wasserstoffatom und die andere eine geradirettige gesättigte Alkoxy-

gruppe mit höchstens 7 Kohlenstoffatomen und R³ eine geradkettige gesättigte oder mono- oder polyungesättigte Alkylgruppe mit 4 bis 21 Kohlenstoffatomen bedeutet, in einem pharmazeutischen Trägermaterial.

Diese erfindungsgemäß verwendeten Glyceryläther sind in einer kleinen Menge von etwa 3 Gewichts-% in Haileberölen enthalten, und deren Fraktion an methoxysubstituierten Glyceryläthern besteht zu etwa 60 Gewichts-% aus (2-Methoxy-4-hexadecenyl)-«-glyceryläther, 15 Gewichts-% (2-Methoxyhexadecyl)-«-gIyceryläther und 20 Gewichts-% (2-Methoxy-4-octadecenyl)-a-glyceryläther. In den Glycerylätnergemischen aus Haileberölen wurden Glyceryläther identifiziert, deren alkoxysubstituierter Ätherrest 14 bis 22 Kohlen-Stoffatome und 0 bis 6 olefinische Bindungen enthält.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel besitzen im Gegensatz zu den vorbekannten, nicht durcl. Alkoxygruppen substituierten Glyceryläthern antibiotische Aktivität gegenüber verschiedenen Bakterientypen, besonders gegen Coryne-Bacterium hofmanni, Diplococcus pneumoniae, Staphylococcus Oxford, pyogenes A und pyogenes H, Streptococcus pyogenes und Streptococcus viridans. Sehr bemerkenswert ist der zytostatische Effekt dieser Arzneimittel, der gegenüber Kulturen von Krebszellen in vitro einerseits und bei Mäusen in vivo andererseits nachgewiesen wurde. Bei den Versuchen in vitro unter Verwendung der Methoxyalkylglyceryläther in einer Konzentration von 100 μg/ml wurden die Zellen insgesamt innerhalb von 72 Stunden abgetötet Auch bei einer Konzentration von 25 μg/ml hatten aus Leberöl des Grönlandhaies isolierte Methoxyalkylglyceryläther wie auch synthetisch hergestellter 2-Methoxyhexadecyl-«-glyceryläther eine deutliche zytostatische Wirkung mit völliger Unterdrückung des Wachstums innerhalb von etwa 8 Tagen bei Verwendung des aus Leberöl isolierten Produktes und innerhalb von etwa 15 Tagen bei Verwendung des synthetischen Produktes.

An Mäusen mit transplantiertem Brustkrebs verabreichte Nahrung mit 0,5% methoxysubstituierter Glyceryläther nach der Erfindung ergaben eine Wachstumsverminderung der Tumoren während einer Zeit von 15 Tagen. Dabei wurde die Bildung von Metastasen in den Lungen ebenfalls unterdrückt. Es wurde kein Unterschied in dem Futterverbrauch oder im Körpergewicht zwischen den Versuchstieren und einer Gruppe von Kontrolltieren beobachtet. Die me:'..oxysubstituierten Glyceryläther hatten keinen Einfluß auf die Zahl der M ten und weißen Blutkörperchen in Konzentrationen von 0,25% der verabreichten Nahrung. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel haben somit zytostatische und krebsverlangsamende Wirkung, ohne die Bildung roter und weißer Blutkörperchen zu steigern, selbst bei vergleichsweise hohen Dosierungen, wie 0,25% der Futtermenge.

Arzneimittel nach der Erfindung sollten wenigstens 5, vorzugsweise wenigstens 10 Gewichts-% der Alkyl-«- glyceryläther enthalten. Das pharmazeutische Trägermaterial kann beispielsweise ein Fettöl oder ein wäßriges Lösungsmittel sein. Der Träger kann aber auch aus einem oder mehreren unsubstituierten Alkyl- und/oder Alkenylglyceryläthern bestehen oder diese enthalten. So kann das Arzneimittel aus einem natürlichen Produkt bestehen, das auf wenigstens 5 Gewichts-% der alkoxysubstituierten Glyceryläther konzentriert wurde.

Die in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln enthaltenen Alkyl-öt-glyceryläther kann man durch Gewin-

nung eines Konzentrates von Verbindungen der allgemeinen Formel

CH₂-O-CH₂-CH-CH₂-R⁶ CH — OH OCH₃

CH₂-OH

worin R⁶ eine gesättigte oder ungesättigte Allcylgruppe mit 9 bis 21 Kohlenstoffatomen bedeutet, aus natürlich vorkommenden Upoidprodukten, die a-Glyceryläther enthalten, wie aus Leberölen vom Grönlandhai, Hundshai oder Rattenhai (Shimaera monstrosa) bekommen. Bei diesem Verfahren geht man so vor, daß man das Lipoidprodukt vorzugsweise nach einer Vorreinigung unter Entfernung von Kohlenwasserstoffen und verseifbaren Bestandteilen zwischen zwei Lösungsmitieiphasen aufteilt. Dabei verwendet man zwei wenigstens teilweise nicht miteinander mischbare Flüssigkeiten unterschiedlicher Dichte, wobei eine dieser Flüssigkeiten ein im wesentlichen nicht polares Lösungsmittel, wie Petroläther, Tetrachlorkohlenstoff, ein zyklischer aliphatischer Kohlenwasserstoff, ein aromatischer Kohlenwasserstoff oder ein Gemisch dieser Stoffe ist, und die andere Flüssigkeit ein polares organisches Lösungsmittel, gegebenenfalls im Gemisch mit Wasser, ist, wie ein Alkohol, Keton, Nitril oder ein Gemisch hiervon.

Stattdessen ta ^n man das Lipoidprodukt auch in einem Lösungsmittel auf ein festes Adsorbens aus der Gruppe der Kieselsäuren und entaktivierten Aluminiumoxide aufgeben und so chro'.natoi*raphisch trennen, indem man zunächst mit einem wenig polaren Lösungsmittel, wie einem Gemisch einer kleineren Menge Äther in Petroläther, und anschließend mit einem polareren Lösungsmittel, wie Äther, eluiert.

Noch eine andere Methode besteht darin, das Lipoidprodukt in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methanol, zu lösen und mit einer Einschlußverbindung mit einem Teil des Glyceryläthergemisches bildenden Substanz, wie Harnstoff, zu behandeln. Auch kann man aus einem polaren Lösungsmittel, wie Wasser, mit niedermolekularen aliphatischen Alkoholen, Ketonen oder Mischungen derselben, die in dem polaren Lösungsmittel löslich sind, fraktioniert kristallisieren. Eine weitere Anreicherung der Alkoxyalkylglyceryläther kann gegebenenfalls durch Vakuumdestillation oder präparative Gaschromatographie erfolgen.

Bei der Synthese der erfindungsgemäß verwendeten Alkyl-a-glyceryläther kann man eine Verbindung der allgemeinen Formel

H₂C

CH — CH₂X

\ / R⁷

mit einer Verbindung der allgemeinen Formel Y-CH₂- CHR" — CHR²' — R³'

umsetzen, worin R" die Gruppe R¹ oder ein Atom oder eine Atomgruppe bedeutet, die durch an sich bekannte Methoden in die Gruppe R¹ Oberführbar ist, R²¹ die Gruppe R² oder ein Atom oder eine Atomgruppe bedeutet, die nach an sich bekannten Methoden in die Gruppe R² überführbar ist, R³¹ die Gruppe R³ oder ein Atom oder eine Atomgruppe bedeutet, die nach an sich bekannten Methoden in die Gruppen R³ überführbar ist, R⁷ ein Sauerstoffatom, eine Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung oder die Gruppe

— O

R"

R*

ι ο bedeutet, worin R* ein Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist, R^b eine Alkyl- oder Arylgruppe ist und R* und R⁶ zusammen auch einen Ring bilden können, der ein Hoteroatom enthalten kann, undX und Y ein Atomgruppenpaar bildet, welches aus einem Halogenatom und der Gruppe -OM oder einer Arylsulfonylgruppe und der Gruppe -OM oder einer Alkylsulfonylgnippe und der Gruppe -OM oder zwei Hydroxylgruppen besteht, wobei in diesen Atomgruppenpaaren M ein positiv geladenes Atom oder eine positiv geladene Atoiugrup pe, vorzugsweise K, Na oder Li, bedeutet und das Halogenatom vorzugsweise Cl oder Br ist Bei dieser Umsetzung entsteht eine Verbindung der allgemeinen Formel

H₂

R⁷

C! !R

2l O 31

gegebenenfalls nach Überführung der Gruppen R", R²¹ jo und R³¹ in die Gruppen R¹, R² und R³ wird die Gruppe

CH₂ — CH R⁷

in die Gruppe

OH

CH-

OH

mit Hilfe an sich bekannter Methoden überführt.

Nach einer Ausführungsform ist X die Gruppe — OM oder eine Hydroxylgruppe, Y die p-Toluolsulfonylgruppe und R⁷ die Gruppe

— O

CH,

CH₃

wobei M die obige Bedeutung hat.

Ferner bedeutet X die Gruppe —OK oder die Hydroxylgruppe und R⁷ die Gruppe

— C)

— O

CH₃

und die Spaltung der lsopropylidenverbindung wird durch saure Hydrolyse durchgeführt.

Im weiteren Können X und Y Hydroxylgruppen sein. Wasser wird dabei mit Hilfe eines Wasser entziehenden Mittels, zweckmäßigerweise mit Hilfe eines Dehydratisierungskatalysataors, wie Schwefelsäure, möglicherweise bei niedriger Konzentration, abgespalten.

Nach einer anderen Methode kann zunächst ein Alkyl- oder Alkenylglyceryläther mit einer nicht ausreichenden Kettenlänge hergestellt werden, worauf diese Kette nach an sich bekannten Methoden auf die erwünschte Länge verlängert wird. Hierzu kann das endständige Kohlenstoffatom des Vorproduktes mit einem Halogenatom substituiert sein. Die Kettenverlängerung kann beispielsweise mit Hilfe eines Alkylhalogenids durchgeführt werden, und die Umsetzung kann in an sich bekannter Weise unter Verwendung von Alkalimetall oder unter Verwendung einer metallorganischen Verbindung erfolgen. Wenn das Vorprodukt

Br,

IO eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit einer Doppel- oder Dreifachbindung am endständigen Kohlenstoffatom hat, wird die Verlängerung der Kohlenwasserstoffkette mit Hilfe von metallorganischen Verbindungen durchgeführt

Bei noch einer anderen Methode kann R" bzw. R²' ein Halogenatom, vorzugsweise ein Chloratom, sein, und die gebildete Verbindung wird dann mit einem Alkoholat MR" bzw. MR² umgesetzt, worin M, R¹ und R² die obige Bedeutung haben. Diese Umsetzung wird durch folgendes Reatkionsschema beispielhalber erläutert:

CH₂=CH-R³ ► CH.Br —CHBr-R³ +

CH7OK

CHO CH₃

/ \ CH,O CH₃

CH, O — CH, — CH br — R³

I "

CHO CH₃

CH₂O — CH₂ — CH(OCH₃) — R¹

CH₃OK CHO CH₃

CH, CH₂O CH₃

CH₂C) — CH₂ — CH(OCH₃) — R³ ► CHOH

CH₂OH

Der Schutz der nicht zu veräthernden OH-Gruppen kann auf verschiedene Weise geschehen, wie durch innere Ätherbildung

H₂C

CH-CH₂X

So können als Ausgangsmaterial Glycidol oder Epichlorhydrin, die Epoxide von Glycerin mit einer freien «-Hydroxylgruppe oder mit einem Chloratom anstelle dieser Hydroxylgruppe sind, verwendet werden. Ein anderer Weg ist der, das Glycerin mit einer Carbonylverbindung, wie beispielsweise einem Keton oder Aldehyd, vorzugsweise Aceton, welche mit vicinalen Hydroxylgruppen reagieren, umzusetzen und die Schutzgruppe in an sich bekannter Weise nach Beendigung der Verätherung abzuspalten.

Gesättigte Glyeeryläther kann man auch aus einer Allylverbindung, beispielsweise Allylchlorid oder Al'ylbromid, gewinnen, die unter Bildung eines Allylalkyläthers, CH₂ = CH-CH₂OR, verethert werden. Letzterer wird in an sich bekannter Waise zu einem Glyceryläther oxidiert und weiterbehandelt oder direkt in das erwünschte Glycerylätherderivat überführt

Im folgenden wird die Gewinnung von Alkyl-a-glyceryiäthern für Arzneimittel nach der Erfindung erläutert

A. 4 g unverseifbares Material aus Haileberöl (erhalten aus der Mutterlauge nach der Ausfällung mit Harnstoff) mit ein<*m Gehalt von etwa 10% methoxysubstituierter Glyceryläther wurden in einem Gegenstromverteilungsappaiti verteilt. Der Apparat bestand aus 200 Röhren, von denen jede 50 ml (25 ml

I)O

b^r) feststehende Bodenphase und 25 ml bewegliche obere Phase) umfaßte. Als Bodenphase wurde 80%iges Methanol und als obere Phase η-Hexan verwendet. Die obere und die Bodenphase waren vorher durch Schütteln in einem Scheidetrichter ins Gleichgewicht miteinander gebracht worden. Die Konzentrationen der methoxysubstituierten Glyceryläther wurden mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie beobachtet. Nach 170maligem Schütteln wurden die Lösungen in Röhren, die nur anderes Material als Methoxyglyceryläther enthielten, gegen neue Bodenphase und obere Phase ausgetauscht worauf erneut 170 ml geschüttelt wurden. Die Lösungen in den Röhren, die Materialien ohne Wert enthielten, wurden erneut gegen reine Bodenphase und obere Phase ersetzt Nach weiterem 200maligem Schütteln erhielt man 297 mg eines Materials, das etwa 90% methoxysubstituierte Glyceryläther und lO^ü/o gewöhnliche Glyceryläther enthielt

B. Leberöl vom Grönlandhai wurde von einigen flüchtigen Bestandteilen durch Molekulardestillation befreit Etwa 10% des Öles wurden &bdestilliert Der Rest wurde alkalischer Hydrolyse von 1 π äthanolischem KOH durch Sieden unter Rückfluß während ! Stunde unterzogen. Das unverseifbare Material, das die Glyceryläther enthielt, wurde mit Hilfe von Diäthyläther aus dem Verseifungsgemisch extrahiert.

Das nicht verseifbare Material wurde in einem Gemsich von 5% Diathyläther in Leichtöl (Kp. 60 bis 8O⁰C) gelöst und auf Säulen speziell für die Chromatographie von Lipoklen hergestellter Kieselsäure in Mengen von etwa 15 mg je Gramm Kieselsäure aufgegeben. Eine hauptsächlich aus Kohlenwasserstoffen und Cholesterin bestehende Fraktion wurde mit 5%

Diäthyläthcr in Leichtöl eluicrt. Die Glyceryläther wurden dann mit Diäthyläthcr eluicrt. Die Auslaufe wurden in 20-ml-Kraktionen aufgefangen, wobei die gewöhnlichen Glyceryläther zuerst auftraten, unmittelbar gefolgt von den methoxysubstiuiierten Glyceryläthern.

Die folgenden methoxysubstituicrten Glyceryläther wurden in den Ausläufen durch Massenspcktrometrie identifiziert:

(2-Methoxy-4-hexadecenyl)di-glyceryläther,
(2-Methoxyhcxadecyl)-rt-glyceryläther und
(2-Methoxy-4-octadecenyl)-(Tc-glyceryläther.

C. Herstellung von
(2 ÄthoxyhexadecyO-iVglyceryläther

Zu CiIiCi Lösung vim Naiiiuiuäirnjxiu im Aihaiiui, hergestellt aus Natrium (1.46 g) und Äthanol (35 ml), wurde eine Lösung von 2-BrompalmitinsäureäthyIester (20,3 g) in Äthanol (25 ml) zugesetzt. Nach dreistündigern Rückflußkochen wurde Wasser zugegeben, und das Produkt wurde in Äther aufgenommen. Nach dem Abdampfen des Äthers und Fraktionierung des Rückstandes erhielt man 10,8 g 2-Äthoxypalmitinsäureäthylester, Kp. 112bisl14°C,n =1,4393.

2-Äthoxyhexadecanol-l wurde durch Reduktion dieses beschriebenen Äthylesters mit Lithiumaluminiumhydrid bereitet. 2-Äthoxypalmitinsäureäthylester (6,56 g), gelöst in trockenem Äther (30 mm), wurde tropfenweise zu einer Lösung von Lithiumaluminiumhydrid (1,00 g) in trockenem Äther (50 ml) unter fortgesetztem Rühren zugegeben. Nach 30minütigem Rückflußkochen und Kühlen wurde das überschüssige Lithiumaluminiumhydrid durch Zugabe von Älhylacetat und dann von Wasser zerstört. Die Lösung wurde mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert und dann mit Äther extrahiert. Man erhielt dabei 5,67 g farbloses öl, das nach der Reinigung durch Chromatographie mit Kieselsäure mit 1% Äther in Leichtöl 4,0 g der Substanz ergab, die nach dem Festwerden einen Schmelzpunkt vnn IS"? hi« 35,7° C besaß.

2-Äthoxyhexadecyl-p-toluolsulfonat wurde durch Behandlung von 2-Äthoxyhexadecanol (1,72 g) mit p-Toluolsulfonylchlorid (1,5 g) in Pyridin (2,3 ml) bei Raumtemperatur über Nacht gewonnen. Man erhielt dabei 2,47 g Rohprodukt, welches sehr kleine Mengen an Verunreinigungen enthielt, wie durch die Dünnschichtchromatographie gezeigt werden konnte.

2,3-Isopropylidenyl-¹ (2-äthoxyhexadecyI)-glyceryläther wurde durch Kondensation von Äthoxyhexydecylp-toluolsulfonat mit 1,2-Isopropylidenylglyceryläther gewonnen. Zu geschmolzenem und granuliertem Kalium (0,25 g) in trockenem, unter Rückfluß siedendem Benzol (20 ml) wurde l^-Isopropylidenylglyceryläther (0,85) zugesetzt. Nachdem alles Kalium umgesetzt war. wurde eine Lösung von 2-Äthoxyhexadecyl-p-toIuolsulfonat (2,20 g) in trockenem Benzol (10 ml) zugegeben. Nach Rückflußkochen über Nacht und Extraktion mit

ÄtiicT cFiiicit ΓΠαΠ t-rJi g cm6S i\GiiprG\jüiCt€S, ua5 iiaCii

Chromatographie mit Kieselsäure und mit Leichtöl mit wenigen Prozenten Äther als Eluierungsmittel 0,90 g reinen 23-Isopropylidenyl-1 -(2-äthoxy hexadecyl)-

glyceryläther ergab.

Die isopropyiidenverbindung (0,Sö g) wurde mit einer Lösung von 4 η HCI (1,3 ml) und Äthanol (4 ml) bei 85° C während 24 Stunden behandelt Der Glyceryläther wurde mit Äther extrahiert und durch Chromatographie mit Kieselsäure gereinigt. Die weniger polaren Verunrcinigungcn wurden durch Linieren mit 5% Diäthyläthcr in Leichtöl entfernt, und der freie Glyceryläther wurde dann mit Äther eluiert. 90% des Rohproduktes bestanden aus (2-Äthoxyhexadecyl)-rx-glyceryläther.

Mittel nach der Erfindung wurden hinsichtlich ihrer antibiotischen und zytostatischen Wirksamkeiten unter sucht, wie nachfolgend im einzelnen beschrieben ist. Diese Untersuchungen wurden mit den folgenden Verbindungen durchgeführt:

(2-Mcthoxyhcxadecyl)-ix-glycery lather (2-Äthoxy hex adecyl)-fc-glycery lather 2-(Butoxy hcxadecylj-rvglyceryläther (2-Methoxy-4-hexadecenyl)-A-glyceryläther (2-Methoxy-4-octadecenyl)-(X-glyceryläther

rtiic uiiici Mici'iici'i vciOinuÜMgcM LfcääucM eine iich'i-

mende Wirkung auf das Wachstum von HeLa-Zellen.

Zur Untersuchung der antibiotischen Aktivität wurde eine Depotlösung der Glyceryläther durch Auflösen derselben in Sorensens Phosphatpuffer pH 6,5 mit einem Gehalt von 10% Dimethylsulfoxid hergestellt. Die Aktivität wurde als kleinste hemmende Konzentration in mcg/ml gemessen.

Zur Züchtung der HeLa-Zellen wurde Hanks Lösung verwendet, c'.v 0,5% Lactalbuminhydrolysat und 7% Kälberserum enthielt und je 100 ml mit 7 ml 0.15%iger Natriumbicarbonatlösung und 20 000 bis 40 000 IE an Penicillin und Streptomycin versetzt war. Das Medium wurde zweimal je Woche gewechselt. Die Glyceryläther wurden in dem Medium in einer Konzentration von 1, 5, 25 und 100μg/ml gelöst. 1,5 ml Zellensuspension mit einem Gehalt von 10⁶ Zellen je Milliliter wurden zu 18.5 rnl Medium zugegeben. Das Wachstum wurde durch Auszählen der Zellen in einer Bürkerkammer aufgezeichnet.

C3H-Mäuse oder deren FI-Bastarde wurden für die Studien über die Wirksamkeit der Glyceryläther auf transplantierte Brustcarcinome verwendet. Suspensionen vnn Tnmnr7ellen wurden durch Homoeenisierune von Tumorgewebe mit einem kleinmaschigen Sieb und Verdünnen des Homogenisates mit Hanks Lösung gewonnen. Etwa 50 000 Zellen wurden intramuskulär in eines der Hinterbeine eingespritzt. Nach etwa einer Woche hatte sich ein Tumor von der Größe einer Erbse an der Einspritzstelle entwickelt, und die Tiere wurden in eine Testgruppe und in eine Kontrollgruppe unterteilt. Zwei Experimente wurden ausgeführt. In dem ersten erhielten die Tiere der Experimentengruppe ei. granuliertes Futter mit 1% Glyceryläthern aus dem Leberöl des Grönlandhaies. Bei dem zweiten Experiment wurden der Nahrung 5% synthetisierte methoxysubstituierte Glyceryläther zugesetzt.

In der Nahrung der Kontrollgruppe wurden die Glyceryiäther durch Sojaöl ersetzt. Bei dem ersten Experiment wurden die Tiere nach 12 Tagen, bei dem zweiten Experiment nach 15 Tagen getötet, und die Beintumoren wurden zerschnitten und gewogen. Die Meiastascnzah! in den Lungen wurde in einem Seziermikroskop bestimmt. Männliche Spraque-Dave-Iy-Ratten wurden für die Studien an Blutkörperchen verwendet. Die Ratten erhielten eine Nahrung von 20% Protein als Fischproteinkonzentrat, 10% Erdnußöl mit 2UOOOOiF. Vitamin A, 18 25OiE Vitamin D, 2,1g Tocopherol und 1 g Tocopherolacetat je Kilogramm öl, 614% Saccharose, 3% Cellulosepulver, 4,5% Salzgemisch und 1% Vitamingemisch. Die Ratten hausten in einzelnen Käfigen und konnten nach Belieben fressen.

Ihr Durchschnittsgewicht bei Beginn des Experimentes betrug etwa 50 g. Die Tiere wurden zweimal je Woche gewogen. Nacn 4 Wochen wurden die roten und weißen Blutkörperchen in einem Blutkörperchenzähler ausgezählt.

Die methoxysubstituierten filyceryläther zeigten zr> !tzlich eine an'.ibiotische Aktivität gegen verschiedene Typen von Bakterien, speziell gegen Coryne-Bacterium hofmanni, Diplococcus pneumoniae, Staphylococcus Oxford, pyogenes A und pyogenes H, Streptococcus pyogenes und Streptococcus viridans. Die antibiotische Wirksamkeit der Methoxyglyceryläther wurde durch Zugabe von Serum gehemmt.

Das Wachstum von HeLa-Zellen wurde für verschiedene Zeiträume mit Methoxyverbindungen untersucht, die zu dem Medium zugesetzt wurden (Tabellen Il bis V). In dem ersten Experiment wurden Methoxyglyceryl-

iinr/ml

Gruppe	Zellenauszählung	3 Tage	6 Tage
	ITag	122	186
Kontrolle	54	alle Zellen	alle Zellen
'AI α	65	abgestorben	abgestorben
		115	168
AI 6	172	89	212
AIf	175	alle Zellen	alle Zellen
"AUa	157	abgestorben	abgestorben
		91	148
AUb	206	137	225
AIIf	201

Al = Methoxyglyceryläther, isoliert aus Grönlandhaileberöl. All = Synthetischer 2-Methoxyhexadecyl-a-glyceryläther.
a = 100 !ig/ml.
b = 25 ,LLg/ml.
c=S μ.ΐ/ml.
d = 1 ug/ml.

Tabelle Il

Wirksamkeit von Methoxyglyceryläthem in Konzentrationen von 25 und 5 v.g/ml Medium au!" das Wachstum von HeLa-Zellen. Inkubation 10 Tage

zugesetzt, und das Experiment wurde über 6 Tage fortgeführt. Die Zellenauszählung zeigte, daß in der höchsten verwendeten Konzentration, IO<^g/ml), alle Zellen nach 3 Tagen abgestorben waren. In einer Konzentration von 25 ng/ml war die Zahl der Zellen vermindert. Bei diesen kurzzeitigen Experimenten schienen die Methoxyverbindungen in einer Konzentration von 5 μg/ml das Zellwachstum etwas anzuregen. Bei einer Konzentration von 25 μg/ml wurden morphologische Veränderungen beobachtet. Einige Zellen waren riesengroß, und außerdem wurden auch kleine, r.nde, degenerierte Zellen gefunden. Die riesengroßen Zellen sind üblicherweise Zellen, die ihre Mitoreaktivität verloren haben. Bei 5 μg/ml bestand vom dritten Tage an eine geringe Tendenz zur Bildung von Riesenzellen. Etwa die gleichen Ergebnisse erhielt man bei Verbindungen, die aus Grönlandhaileberöl isoliert wurden und bei dem synthetischen 2-Methoxyhexadecyl-a-glyceryläther.

Tabelle I

Wirkung von Methoxyg'ycerylathern in Konzentrationen von 100, 25 und 5 ;ig/ml Medium auf das Wachstum von HeLa-Zellen. Inkubation 6 Tage

(im p pe	/.cllcniiiis/iihlung	2 Tage	(i lage	IO Tage
	I Tug	98	228	359
Kontrolle	78	97	240	32
AI Λ	75	138	231	279
Al <	67	154	160	272
All Λ	64	113	205	407
AIIf	63

Tabelle III

Wirkung vcn Methoxyglycerylüthern in Konzentrationen von 25, 5 und 1 ag/nil Medium auf das Wachstum von HeLa-Zellen. Inkubation 14 Tage

Gruppe	2 Tage	5 Tage	8 Tage	11 Tage	14 Tage
Kontrolle	138	172	520	757	649
AI/)	81	70	0	0	0
AIf	118	195	533	502	791
AI (/	130	199	517	460	651
All ft	107	107	241	112	0
AIIf	113	200	488	546	637
AIIf/	121	27	598	546	557

Wenn die Experimente mit 25 und 5 μg/ml Methoxyglyceryläthem wiederholt und eine längere Zeit (nämlich 10 Tage, Tabelle II) fortgesetzt wurden, besaßen die Methoxyglyceryläther in einer Konzentration von 25μg/r.l eine beachtlich vermindernde Wirkung auf das Zeil wachstum von 6. bis zum 10. Tag. Bei einer Konzentration von 5 μg/ml besaßen ^ie Methoxyglyceryläther eine leicht stimulierende Wirkung aut das Zellwachstum während aer ersten Tage, hemmten das Wachstum aber, wenn die Inkubation fortgesetzt wurde. Das synthetische Produkt besaß eine ähnliche Wirkung, aber in geringerem Grade.

Bei dem nächsten Experiment wurden die Methoxyglyceryläther in Konzentrationen von 25, 5 und 1 μg/ml verwendet, und die Inkubation wurde 14 Tage bei 37°C fortgesetzt. Bei einer Konzentration von 25 μg/ml besaßen sowohl die Methoxyglyceryläther, die aus Grönlandhaileberöl isoliert waren, wie auch der cimtKoti^ha '5_Mi»tk*\vi/ii.»vaHpr>vt-/Y-o'lvrprvläthpr pinp

JJlUlIbIlJb₁IV *- ..ι w»..v«J ..*-"—-—j · _O'j j

wachstumshemmende und später eine tötende Wirkung auf Zellen (Tabelle III). Bei den niedrigeren Konzentrationen wurde ein geringer wachstumsstimulierender Effekt bei Beginn des Experimentes beobachtet.

Gewöhnliche Glyceryläther aus dem Leberöl von Grönlandhaien regten das Wachstum von transplantierten Brustcarcinomen bei C3H-Mäusen an, wenn sie in einer Menge von 1% der Nahrung zugesetzt wurden. Andererseits besaßen die methoxysubstituierten Glyceryläther, wenn sie der Nahrung in einem Prozentsatz von 0,5% zugesetzt wurden, eine hemmende Wirkung auf das Wachstum der Tumoren während einer 15tätiger. Periode (Tabeiie UVy Es gab keinen Unterschied im Körpergewicht zwischen den Experimentiergruppen und den Kontrollgruppen. Der Futterverbrauch war höher bei der Gruppe, die die gewöhnlichen

Il

Glyceryläther erhielt, als bei den Kontrolltieren. Aber bei dem /weiten Experiment mit methoxysubstituierten Glycerylathern war der Futterverbrauch der gleiche in der Testgruppe und in der Kontrollgruppe. Tiere mit nur wenigen Metastasen in den Lungen waren zahlreicher in der Gruppe, die konzentrierte methoxysubstituierte Glyceryläther ei '.alten hatte, als in der Kontrollgruppe.

Tabelle IV

Wirkung von Glyeerylälhern auf das Wachstum von transplanticrten Brustcarcinomen bei C311-iVläuscn Experiment I:
Gewöhnliche Glyceryläther.
Periode: 12 Tage

Testgruppe Kontrollgruppe

Zahl der Tiere
Tumorgewicht, g (im
Durchschnitt ± Standardabweichung)
Futterverbrauch
(g/Tier/Tag)

40 40

5,63 ±0,11 4,76 ±0,24

3,85

3,12

Experiment 2:

Methoxysubstituierte Glyceryläther.
Periode: 15 Tage

	Testgruppe	Kontroll
		gruppe
Zahl der Tiere	24	25
Tumorgewicht, g (im	3,4 ±0.11	4,2 ±0,16
Durchschnitt ± Stan
dardabweichung)
Futterverbrauch	3,41	3.57
(g/Tier/Tag)

Gewöhnliche Glyceryläther und methoxysubstituierte Glyceryläther, beide in einer Konzentration von 0.25% der Nahrung, besaßen keine Wirkung auf das Wachstum von normalen Ratten. Der Futterverbrauch war auch der gleiche in diesen Gruppen wie in den Kontrollgruppen (Tabelle V). Auch wurden keine statistischen Unterschiede bei der Auszählung der roten Blutkörperchen zwischen der Testgruppe und der Kontrollgruppe beobachtet. Es gab keine Tendenz zu einer erhöhten Zahl von weißen Blutkörperchen bei den Gruppen, die gewöhnliche Glyceryläther erhalten hatten, aber zwischen der Testgruppe und den Kontrolltieren konnten keine statistischen Unterschiede ermittelt werden.

Tabelle V

Wirkung von gewöhnlichen Glycerylathern und von methoxysubstituierten Glycerylathern auf die Gewichtszunahme, den Futterverbrauch sowie die roten und weiüen Blutkörperchen bei wachsenden Ratten.

Die Verbindungen wurden in der Nahrung in einer Konzentration von 0.25 % während vier Wochen verabreicht

	Gewöhnliche Glyceryl	Gewichts	Futter	Rote Blut	Weiße Blut
	äther	zunahme	verbrauch	körperchen	körperchen
	Methoxysubstituierte			ivitiimiii-iif n:tii	/„;,;;,■,„■,■,'
	Glyceryläther	lg>	(g)	M + SE	M + SE
1.	Kontrollproben	175	363	6.36 ±0.139	16 898 ±861

2.	176	369	6,19 ±0.153	13 370 ±644

3.	180	360	6.04 ±0.206	14 739 ±920

Die methoxysubstituierten Glyceryläther besaßen bei der hohen Dosierung von 0,25% der Nahrung keinen Einfluß auf die Zahl der roten und weißen Blutkörperchen. Dies ist von besonderem Interesse, da sie das Wachstum von HeLa-Zellen in vitro hemmten und auch das Wachstum von transplantierten BrüStcarcinornen bei Mäusen verminderten. Demnach besitzen die methoxysubstituierten Glyceryläther einen zytostatischen Effekt auf Tumorzellen, ohne das normale Wachstum oder die Bildung von roten oder weißen Blutkörperchen zu beeinflussen, selbst wenn man die Äther in solch hohen Dosierungen, wie 0,25% der Nahrung verabreicht.

Claims

Patentanspruch:

Arzneimittel mit cytostatischer Wirksamkeit, enthaltend wenigstens einen Alkyl-at-glyceryläther der allgemeinen Formel

CH₂ — OCH₂ — CHR¹ — CHR² — R³

i CH-OH

i CH₂ — OH