DE1620797A1 - Verfahren zur Herstellung von Kollagenverbindungen - Google Patents

Description

_V er f ahr en_ zur _He r s te 11 ung_von_Ko llag env e ±- b indung en

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, zur Herstellung einer mikrokristallinen Form einer Kollagenverbindung, die dispergierbar ist, einschließlich Gelen, die stabiler sind als bekannte Gele, die aus Kollagenabkömmlingen hergestellt .,erden. Die Erfindung bezieht sich ferner u\xl die nach dem Verfahren hergestellten Zusammensetzungen«,

Der Grundbaustein eines Kollagens ist das sogenannte Tropokollagen. Die Tropolollagenmakromoleküle bestehen aus drei Ketxen von Polypeptiden, die sehr ubenförmig umeinander verwunden sind und dabei einen Durchmesser von etwa 10-15 2. und eine länge von etwa 3ooo £ haben. >'ie sein Degrationsprodukt Gel tine ist "Jropokollagen in angesäuertem V/asser vollständig löslich. Da es der iiaturbaustein bei der üerntellung von Ko.lagenfibrillen, ist, wurde es umfassend für die Herstellung von wiederaufgebauten, f^sri_t.,en Sollagenerzeug_oniüsen benutzt (siehe beinpiel..jweise USA-Patent I»"r. ^ 157 r>24). i>6i' nüch:-t höher oi'ganiaiex-te Zustand, in uc.ni Kollagen in diesem

■Zusammenhang bekannt iat, sind KolLagenfasem, die ...us langen, dünnen Jträiif.en aus tausenden einzelnen Tropokollugeneinheiten bestehen«, je Fasern halben Durchmesser von IOO-I000 k und variieren in der

da. ZehaUel einen Wyj laiig. In dieser

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Län_f;e. 3ie aind im

Form mst das Kollagen wasserunlöslich. Diese Fasern schließen sich zusammen, bzw. sind einander zugeordnet, um die mikroskopischen Fasern zu bilden, wie sie in natürlichen Substanzen vorkommen, in denen sie wieder zu tausenden zusammengeschlossen Faerverbände bilden.

Die vorliegende Erfindung beruht darauf, daß es möglich ist, eine Form eines Kollagenzwischengliedes herzustellen und zwar aus Kollagenfibrillen und aus· Tropokollagen, das nützliche Eigenschaften hat, die darin- bestehen, daß -es in Yfasser zu Gelen gequollen werden kann, die ihre ursprüngliche Viskosität im wesentlichen beibehalten, wenn sie eine oder mehrere »ochen stehen, una die zu geeigneten Produkten aufgearbeitet weden können. Diese neue Form des Kollagens ist wasserunlöslich, mikrokristallin und kolloidal, bie besteht aus Bündeln von Tropokollageneinheiten, die in der Liin₅e variieren und zwar von der Länge einer -ropokollageneinheit herab bis unter ein my und im Durchmesser von etwa 25 α bis zu einigen hundert 2. Köm-

ositionen enthalten verschiedene Formen von Kollagenen und zwar enthalten mindestens 10/j (j-ewiciitsprozent) von ihnen mikrokristalline, kolloidale Kollagenpartikel, die im wesentlichen frei von Tropokollagen und Abkömmlingen davon sina und die viskositütsstabile vorteilhafte wässrige Gele mit niedrigen Konzentrationen in der Größenordnung von etwa 1p bilden.

Dies steht in scharfem Gegensatz zum Typ -,vässriger Gele aus Tropokollagen und abgebauten Kollagenen, wie Gelatine. JIe Gele, die aus diesen wasserlöslichen Substanzen bestehen, veraici-cen sich beim jtelien und bilden gum .i-rti_öe Las., en und iare Gebrauchsfi-higkeit ist aurcii diesen ütabilii;,a.tsraangel st^rk eingeschränkt. Die v/asserune l."sliche Komposition nach dieser Erfindung bildet viele mit wesentlich geringerem irozentsatz von Feststoffen, wenn die v/ässrige Dispersion einen pH-./ert von 2.6 bis 3.8, vorzugsweise voix ^.2 h..--t.

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Beim vorliegenden Verfahren kann jedes nicht denatuiertes Kollagen im natürlichen Zustand, entweder in Form von Hautstücken, xiingev/eidestücken oder aus anderen quellen vorzugsweise im getrockneten Zustand benutzt «erden, wobei die Trocknung unter nicht denatuierten Bedingungen erfolgt ui.d mit Rücksicht auf eine einfachere Behandlung im zerschnittenen Zustand. Eine stark verdünnte, wässrige Lösung einer Säure mit einen pH-Wert zwischen etwa 1,7 und 2,6 wird einem nicht denatuierten, fasrigem, natürlichen Kollagen zugeführt j wonach die sich ergebende Masse naß bei Gegenwart der verdünnten Säure zerkleinert wird, bis mindestens 1O> des Materials t-uf eine Größe reduziert ist, die unter einem my liegt.

Es ist wesentlich, daß das Äusgan^smaterial nieh denatuiert ist. Gebrauchsfähiges Material stellen frische Kuh- und Kalrshäue, ausgesalzene Kuhhäute, feuchte Elehhäute und in der Sonne getrocknete Schweinehäute, ferner Schaf- und Ziejenhäuxe, wie sie gewöhnlich für die Lederherstellung verwendet '.verden, a^r, .weiterhin ist ein spezielles, technisches Hautkollagen geeignet, das aus Huuxabfallen mit einer minimal reduzierten 3akterienanzahl (ca. 30.-625 Bakterien pro cm ) hergestellt ist. Wenn eine Haut in einer, solche zustand ist, aaß sie für die Benutzung in der Gerberei zur Herstellung'von zufriedenstellendem Le-ier wiederbefeuchtet werden kann, so ist sie ganz allgemein brauchbar für die Herstellung von mikrokristallinem, kolloidalen Kollagen und für die stabilen Dispersionen davon. Mit Rücksicht auf seine Verfügbarkeit und die niedrigen Kosten sind Kuhhäute oder technische Stufen von Kollagen ...us Kuhhäuten das bevorzugte Aüsgangsmateriäl. Bei der Vorbereitung der rohen Kuhhäute für die hier beschriebenen Zwecke ist es natürlich wünschenswert, Haar und Pleisch zu entfernen, so daß dadurch keine Verunreinigungen auftreten können, die später entfernt werden mü.^en. I»ie Verwendung von granulierter H-ut ist besonders vorteilhaft, wenn reine, stabile"

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Dispersionen gewünscht werden, da durch die Granulierung sehr fest gebundene Verunreinigungen aufgeschlossen und entfernt werden.

Wenn, die Verarbeitung in der Nähe eines Schlachthofes erfolgt, kann die Behandlung im frischen Zustand vor sich gehen. Es ist jedoch ' wünschenswert, mit Rücksicht, auf eine bessere Behandlungskontfolle " getroeknet.e Haut zu verwenden. Die Flüssigkeitsextraktion: kann ·- '. in bekannter Weise durchgeführt werden. ,Vorzugsweise wird die Ge- , friertrocknung angewendet. Das Wasser wird dann unter Vakuum verdampft Diese Sehandlunguv/eise hat bemerkenswerte .Vorteile hinsichtlich der Gewährleistung eines gleichförmigen .Rohmaterials, wie hinsichtlich einer bequemen und stabilen Lagerung und Behandlung. Die Häutsubstariz' wird vörzugweise zwecks leichter Handhabung vor * ■ der '.Yeiterverarbeitung zerkleinert." 'i'ie Zerkleinerung wird bis zu. ^; einer eritspreche-nderi Feinheit durchgeführt, um eine gleichförmige Reaktion und um weniger Arbeitsaufwand bei der" Zerkleinerung auf Sndfeinheit zu haben. ' "'

Die Säurekönzenträtibn variiert mit /.rt und Stärke der verwendeten Säure. Bei der'Verwendung-von-Salzsäure' sollte die Lösung einen pH-'iTe'ft von nicht großer als etwa-"- 2,'b bis 2,7 für die Herstellung eines mikrokristallinen,- kolloidalen Kollagens aus gefrorener, vakuumgetröc^neter Kuhhaut Ilaben. Optimale Ergebnisse v/erden mit einer Salzsäurelösung· mit einem pii-Wert in" der Größenordnung von 2 erreicht. Sei Lösungen mit etwas darüber hinausgehenden Y/ertden wird das erzielte^; I-rodukt nicht-ganz so gut und v;enn der ρίϊ-7/ert unter 1,6 liegt,, tritt'eine Absenkung des Molekulargewichtes ein, diebegleitet ist .vonaer Bildung eines -'lösbaren iropokollagens. Die gewünschtena-eleigensciisfteii gehen-dabei Verloren. "; " ' "· '* ' ■"" '" Die Haupts üb s tan ζ j,, aie^die ..:^*ve auf ge so ten¹'hat, v;ird in irgendeiner" der, bekannten Einrichtimgen,* wie Ώι?β'Άΐα1ί&^^^οάέτ Seii^rBlatVv-_c v₍„r<₉ " - " gerieben^ Hia^;- unfibrilliartei v.mikr-ökr-£s4ä!lM:ste^ kölio'idaf^ i-ärtikel " '""' zu erhalten,, die sehr fein unterteilt *&H&ai>~iMd zwar "solange gerieben bis dieser ^nteil mindestens IO7O des meciianisch aufgeschlossenen

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"Produktes ausmacht, vorzugsweise von etwa 15 - 20$v In diesem Zustand ist das feuchte Produlct gebrauchsfertig. ,

Beispiels

Gefrorene und vakuumgetrocknete Kuhhaut wurde in Salzsäurelösung mit einem pH-Wert von2 eingeweicht (2g vakuumgetrocknete Haut, 200 ml verdünnte Säure) und zwar 15 Minuten lang bei Raumtemperatur· Danach folgte eine 25-minütige Behandlung bei nicht höherer Temperatur als 25⁰C in einem Mischer. Etwa 16$ des !,Iaterilas waren danach feinstaufgeschlossen. Das sich ergebende Gel hatte einen pH-Wert von 3, ο und eine Viskosität von 42.9oo CentipOisse. Die Viskosität wurde bei 25⁰C auf einem HBT Brookfield-Vikosimeter mit TB-Spindel gemessen. ( 10 RPM).

Bei Behutzungeiner Säurelösung mit einem pH-Wert von 5, ergab sich ein Produkt mit einem pH-Wert von 5,4» das eine körperbildende Tendenz zeigte und mit nicht zerteilten Fasei-n angefüllt war» Die Viskosität betrug 4.600 cps. Eine stabile Dispersion ergab sich selbst ' dann nicht, als die mechanische Zerteilung verlängertewurden Bei einem pH-Wert von 2,6 wurde eine Viskosität von 30.000 cps erhalten. Die Viskositäten der Produkte erreichten einen Gipfel, wenn der pH-Wert der benuteten Säurelösungen in der Größenordnung von 2in3 bis 2 lagen und fielen schnell derart ab, daß bei pH-Verten unter 1,7 die Viskositäten wieder unter.30.000 _Cps lagen, worin sich der Abbau des Kollagens und die Bildung lösbarer Köm^Onenten mit niedrigem -Molekülargewicht spiegelt. Bei Benutzung einer wässrigen Salzsäurelösung mit einem pH-Wert von 1,3 wird ein großer Teil des Hautmäterials zu Material mit sehr niedrigem Molekulargewicht abgebaut. Das zerfallene Produkt, hatte" einen pH--Wert von i,5 und eine Viskosität von weniger .als T.000 cps. - ^: . __^ .—— *

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Die Menge, wie sie im oben genannten Beispi-1 festgesetzt ist, basiert auf der Beh.Lnd.lung bei einer 1$igen Peststoffkonzentration. 3s liegt auf der Hand, daO mit der Erhöhung der Kollagenfj§ststoffkonzentration eine Erhöhung der Säuremenge erforderlich ist, um den bevorzugten pH-Wert der Dispersion zu erreichen.

Um eine stabile Dispersion zu erhalten, muß die wässrige Dispersion sauer bleiben und zwar mit einem pH-Wert von etwa 2,6 bis 3,8 vorzugsweise 3,2.

jJie Menge des auf unter 1 my aufgeschlossenen Materials kann durch ,Sedimentation nach Verdünnung zu einer aureichend niedrigen Konzentration gemessen werden, die es zuläßt, daß sich die schweren Teilchen absetzen können. Beispielsweise wurde ein I^iges Gel wie oben ausgeführt, vorbereitet und mindestens uu das Zehnfache verdünnt. Diese Zubereitung blieb sechs Stunden stehen. Danach wurde der Feststmffgehalt des oberen Fünftels gemessen. Dieses Material zeigte die Brown¹sehe Bewegung und war kolloidal verteilt. Eine Betrachtung mit dem Mikroskop ergab, daß diese Teilchen iia wesentlichen alle eine Größe unter einem my hatten· Der Prozentsatz des feinstaufgeschlossenen Materials im ganzen Versuchsansatz wurde errechnet, indem man von der im oberen Fünftel vorhandenen Menge ausging. Die Gele nach dieser Erfindung haben eine Eigenschaft, die sie von den Gelen unterscheidet, welche aus Tropokollagen und niedrig molekulargewichtigen Abkönj;ilingen oder Abbauprodukten, wie Gelatine, hergestellt werden: Sie zeigen nur ein geringes Ansteigen der Viskosität sofort nach ihrer Herstellung und danach bleiben sie tagelang stabil. Beispielsweise zeigte das 1$ Gel gemäß Beispiel sofort nach seiner Herstellung eine Viskosität von etwa 3*fäOO cps, die sich in einer Stunde auf 4.100 cps änderte. Diese Viskosität blieb während einer Lagerdauer von sechs Tagen im wesentlichen in dieser Große erhalten*

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Bei Konzentrationen unter 0,5$ sind die wässrigen Dispersionen zu dünn, um tatsächlich, als Gele betrachtet werden zu können. Ein 5#iges Gel des Produktes gemäß Beispiel ist extrem dick, aber es kann mit hohem Druck noch aus einer Öffnung extrudiert werden. Gele können mit höheren Feststoff gehalten, angesetzt v/erden, aber ihre Behanaiung wird dann schwierig, wenn man andere Mischer als solche mit hohen Scherkraft, wie beispielsweise die sogenannte Banbury-Mühle, verwenden will.

■üie nach der Erfindung hergestellten Gele haben noch eine weitere bemerkenswerte Eigenschaft: Ihre Viskosität ist auffällig abhängig vom Schergrad, d.h., das 1>ige.-Gel gemäß Beispiel zeigt eine Viskosität, die in der Größenordnung von etwa 400.000 cps bei 0,5 HPM bis zu 3.600 cps bei 100 RPM in einer geraden Linie bei logarithmischen Koordinaten lag» Biese Heduktion der Viskosität mit WcLChse Scherkraft mach dieses Material besoaders geeignet als Trägersubstanz für auf Wasser basierende F: rben₅ -um ligrvsncsuspension?.η ohne Verlust der Streichfähigkeit einbringen zu können. Diese SeIe Böigen in auffallender "iVeise kein liewton¹ sches Flie^verhalten und kaum thixotropische Erseheiaungen,. und zwar durch die stabellenförmige Struktur der in ihnen dispergierten, wasserunlöslichen, mikrokristallinen,* koiio'ifialen Teilchen. V/emi .weiterhin die " tatsächliche Visko'sitat'""dieser Gele ^emessen wird, so haben sich Maximalwerte von'9 "ergeb'erij die ein bemerkenswert hohes-llolekui-rgewiciat v/ieder-'sp regelten/ ve .glichen 'mit 'Trbpo'koliagen, bei den sich. Werte von nur 1 oder'^ bei gleichen -ife^methoden ergäben«' ".Vie In'der ÜSÄ-Pateh'tschrif t 5 15t* 524 be se „rieb en/, führt die -Trocknung d^r' 'besOllriebeneii 'sauren G*eIe z^vu einem Produkt, das wieder in

ein 3-el^ iim'ächlägt "und in Wasser löslich; und'.von geringerem Wert ist.

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Dieses Patent lehrt, daß es notwendig ist, die saure Komponente des Geis zu neutralisieren und das sich bei der Neutralisation ergebende Salz zu entfernen, um ein in Wasser stabiles Produkt zu erhalten.

■"in Gel nach der Erfindung, beispielsweise ein solches gemäß Beispiel, kann als Mantelschicht auf einem metallischen Träger aufgebracht werden, und wenn es getrocknet ist, bildet es eine selbsthaftende, wasserunlösliche Umhüllung, Dies zeigt, daß die natürliche Bindung, die ursprünglich die Kollagenmoleküle im ursprünglichen Verband zusammenhalt, noch in dem Produkt gemäß Beispiel wirksam sind, d.h., der ursprünglich Makromolekulare Aufbau der mikrokristallinen, kolloidalen Partikel vird in einem Grade aufrechterhalten, der notwendig ist, um eine Zersetzung zu einer tatsächlich molekularen Dispersion des Tropokollagens auszuschließen.

Offensichtlich kann das mikrokristalline, kolloidale Kollagen nach der Erfindung durch bekannte Gerbereitechniken kreuzweise verkettet werden» um lederartige Produkte zu erhalten. Andere Verkettungsagentien, die für polymere Systeme üblicher sind, solche wie Zellulose, sind auch für die Stabilisierung mikrokristalliner, kolloidaler Kollagene geeignet.

Anstelle von Salzsäure können bei dem oben beschriebenen Verfahren auch andere Säuren benutzt werden, wobei natürlich die Konzentrationen und Mengen entsprechend variiert werden müssen. Beim Ansatz eines Gels zeigt die Viskosität, die bei einer »Yasseratoifkonzentration in einer sauren Lösung erhalten /«erden kann ( die mit anderen Säuren erreichbaren Haximawerte können schräfer sein), eine viel engere nutzbare Konzentration an, was bedeutet, daß größere Schwierigkeiten für die.Verhinderung einer Zersetzung und den Aufbau von lösbaren'Tropokollagen bestehen.

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Schwefelsäure gibt einen derart niedrigen Maximalwert, daß dessen Kontrolle viel zu schwierig ist. Essigsäure* Bromwasserstoffsäure und Zyanessigsäure geben hohe Ilaximalwerte, die aber wesentlich schmaler-sind als die der Salzsäure, so daß auch bei diesen Säuren besondere Sorgfalt erforderlich ist. Selbst wenn sie zu einer ge~ wünschten Gelviskosität führen, können Variationen lokaler Konzentrationen bei der Behandlung tatsächlich zu einem ausreichenden Umschlag zu TropokolltVgen führen, um die ausgetrockneten Gele in Wasser dispergierbar zu machen.

Mit Rücksicht "auf die niedrigen Kosten und das fehlen von Komplikationen bei der Benutzung, wird vorzugsweise Salzsäure benutzt.

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Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE

   1» Verfahren zur Herstellung einer wasserunlöslichen Kollagenverbindung, die eine stabile wässrige Dispersion bildet, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lö- · sung einer Säure, vorzugsweise Salzsäure, mit einem pH-Wert -zwischen etwa 1,7 und 2,6 gleichförmig über einen Ansatz von nicht denatuierten, natürlichen, fasrigen Kollagen, wie Kuhhaut o. dgl., verteilt wird, wonach die sich ergebende feuchte Masse

   soweit zerkleinert wird, daß mindestens 10/ό der Partikel auf eine Teilchengröße reduzi.rt werden, die in jeder Richtung kleiner als.ein my ist.

   .,'asserunlösliche Kollagenverbindung nach ünspruch 1, dadurch gekennze i c h η e t, daß sie einen pH-'.7ert zwischen 2,6 und 3,8 vorzugsweise 3,2 hat und eine Viskosität bei 1$ Feststoffanteil, die bei konstanter Temperatur über eine Voche stabil bleibt.

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