DE1620027A1 - Methobottromycin- und Amethobottromycinamide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

P 16 20 027. 4-44
Neue Unterlagen

MERCK & CO. , INCORPORAIED 126, East Lincoln Avenue, Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.

Methobottromycin- und Amethobottromycinamide und Verfahren zu ihrer Herstellung

Diese Erfindung betrifft Methobottromycin- und Amethobottromycinamide, die neue antibiotisehe Mittel mit hoher Wirksamkeit sind, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Die neuen antlbiotischen Mittel sind zur Behandlung chronischer Erkrankungen der Atmungsorgane von Hühnern und ansteckender Nebenhöhlen-Entzündungen bei Truthühnern nützlich.

Die Entdeckung der bemerkenswerten antibiotischen Eigenschaften von Penicillin und ähnlichen Stoffen hat ein grosses Interesse auf dem Gebiet antibiotischer Verbindungen, wie: Streptomycin, Gramicidin, Subtilin, Bacitracin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Cycloserin, Colistin» Fervenulin, Streptozotooin, Novobiocin und dgl., hervorgerufen. Im allgemeinen sind solche Antibiotika besonders wirksam gegen gewisse grammpositive Bakterien. Andere sind

Unterlagen (Art? J TAb₈, Z Nr. 1 Sate3deeAndtrunDefle3.*.4,fcMia

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gegen grammnegative Bakterien und einige sowohl gegen grammnegative als auoh gegen grammpositive Bakterien wirksam. Die Aktivität dieser bekannten Antibiotika ist jedooh gevuhnlioh auf einige wenige, pathogene Mikroorganis men beschränkt, so daß auf diesem Gebiet Anstrengungen unternommen wurden, um weitere antlbiotische Stoffe aufzufinden, die gegen andere Fathogene wirksam sind«

Außerdem haben viele Bakterien, die einmal von bekannten An tibiotika eingedämmt wurden, im Laufe der Jahre gegenüber diesen antiblotischen Stoffen eine zunehmende Resistenz entwickelt. Als Folge davon zeigte sioh, daß» obgleich eini ge dieser Antibiotika bei der Behandlung von verschiedenen Krankheiten sioh von unschätzbarem Wert erwiesen, gewisse Stämme einiger Fathogene eine Resistenz gegenüber verschiedenen, besonderen Antibiotika entwickeln und daß folglich diese Antibiotika gegenüber solchen pathogenen Stämmen nioht mehr wirksam sind oder daß die Aktivität dieser Antibiotika derart stark herabgesetzt worden ist, daß Ihre Verwendung gegen solche Pathogene nur geringe Wirkung zeigt.

Viele Antibiotika erweisen sioh bei Laboratoriuasvereuohen in vitro und In ovo hoohaktiv, werden aber, wenn si« in den Körper gebracht werden, d.h. wenn sie in vivo verwendet

" - - BAD GP^ !

werden, ferstort oder verlieren viel ihrer Wirksamkeit.

Demgemäß haben die Mängel der bekannten Antibiotika bu weiteren Untersuchungen Anlaß gegeben, ta andere Antibiotika aufzufinden, die gegen einen größeren Bereich von Pathogenen sowie auoh gegen diejenigen StäB&e verschiedener Mikroorganismen hooh wirksam sind, Sie e&oh g@nen an dere Antibiotika resistant verhalten. Bios gilt nloht nur für krankheitserregende Bakterien, die Menschen tefgillen, sondern aweii fte solch© te&s»Mi©its®£T@g©M© Balit®ri®a_t die Tiere, wie Geflügel« befallen«

Die @hronis@lie läpkrsnkuag cfe AtsßMgsOTges© i©^ ©ia© HUhner- und iEruthühnerkraakfeeit, «Si© won els®r g©%fi©@@n Gruppe von Mikroorganismen hervorgerufen wird, di@ als PPLO bsw«, Pleuro pneumonie ähnliche Organismen bekannt sind und als "Myooplas maⁿ klasslfisslert worden sind. In der einschlägigen Technik spricht man von FPLO-Inf ektion. Bei Hühnern kann die Krankheit durch einen sekundären Erreger erschwert werden} die Krankheit ist dann als chronischer Krankheitskomplex der Atmungeorgane bekannt. Bei Truthühnern tritt diese Krankheit in zwei Formen auf. Ansteckende Hebenhuhlen-Entzündung wird sie genannt, wenn sie den oberen Atmungetrakt beeinflußt, und Alveolensäokohen-Krankheit, wenn sie die unteren Atmungsbereioli® beeinflußt. Der Einfachheit halber werden

009623/1867 la iolg^iss. els ansttc^tBAe

Entzündung bezeichnet. _· bad

Bei Hühnern können die Symptome der chronischen Erkrankung der Atmungsorgan ähnlich denjenigen einer anderen Erkrankung der Atmungsorgane, beispielsweise der Ifevoastle-Krankheit, der ansteckenden Bronchitis, der Laryngotreoheitis, der Pillinfektion usw., sein. Die gewöhnlich beobachteten Symptome sind Hasenausfltiß und leiohte Schwellung unterhalb des Auges· Husten, Kiesen und ein heiseres Rasseln bsw« Röoheln in der Qurgel können diese Anseiohen begleiten« Bei Truthühnern treten als Erankheitssymptome oft Schwellungen der Hebenhöhlen mit gelatinöse» Exsudat, wässrige Augen und Husten auf· Die Alreoleneäokohen und Atmungewege sind durch käsige Exsudate verstopft.

Der wirtschaftliche Verlust, der die ohronlsohe Erkrankung der Atmungeorgane begleitet, 1st ein Absinken der Eierproduktion um mindestens 10 bis 40 J* während einiger Wochen oder Monate. Die sohleoht· Bebrütbarkeit der ron angesteckten Hennen gelegten, befruchteten Eier kann sueätsliohe Verluste Terursaohen. Durch Hyooplasma (FFLO) hervorgerufene Ansteckung führt sum Iod eines hohen Prosentsaties an Embryos. Oewiohtsrerlust bei einem großen Prosenteeta von VOgeln liegt ebenfalls auf der Hand. Zusätslloh tritt von einem Alter von etwa 4 Voohen an eine bedeutende Sterbllohkeltsslffer bei den Vögeln auf.

BAD OFIlQJNAL

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9714 ζ

Die Ansteckung der Vögel kann auf zahlreichen Wegen erfolgen. Die Vögel können duroli Berührung alt anderen angesteckten Vögeln, gewöhnlich duroh inhalieren des Exsudate* au· der Hase eines niesenden Vogels angesteckt werden* Infieierte Hühner oder Truthühner können sogar erkranken, und sie können zu frggero von Krankheitserregern werden, wobei sie gesund zu sein scheinen, Jedoch, in Wirklichkeit mit pathogenen Stämmen von Myoopla»ma (PHiO) infisiert sind. Weiterhin können die Vögel duroh verunreinigte Streu, Bung» Wasser und futter, brütende Rennen oder verunreinigte Brutanlagen angesteckt werden. Die Übertragung der Krankheit über ein Si mit infiziertem Embryo trägt stark zur Ansteckung einer Gruppe von Vögeln bei·

Die chemotherapeutische Bekämpfung dieser Krankheiten war nur mit sehr wenigen Verbindungen erfolgreich. Hit einer Ausnahme sind die Mittel, die sich als zufriedenstellend erwiesen, bekannte Antibiotika, die klinisch gegen andere Erkrankungen, hauptsächlich Humanerkrankungen, verwendet werden« Die Ausnahme ist das antibiotisohe Tyloein. Obgleich das Tylosin ziemlich breite Verwendung gefunden hat, sind gegen Tyloein resistente PPLO-Stamme gefunden worden, und das Antibiotikum erwies sich bei Truthühnern toxisch.

Andere zur Bekämpfung ohronisoher Erkrankungen der Atmung·- organe von Hühnern und der ansteckenden Nebenhöhlen- Ent-

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sttndung τοη Truthühnern nut ill one Antibiotika sind Erythromycin und Ohlortetraoyolln oder Oxytetraoyolin. Sie für gute Ergebnisse erforderlichen Dosierungsnlveaiie dieser Antibiotika liegen Jedoch sienlioh hoch, was die Verwendung unter de« wirtschaftlichen Gesichtspunkt beschränkt« Andere Antibiotika, von denen bekannt ist, daß sie Anti-PFLO-Aktlvität besitsen» erfordern gewöhnlich ein Doslerungsnlveau, das su dicht bei der toxischen Dosis liegt _/ als daß diese Antibiotika praktischen Wert hätten· Za dieser Gruppe gehuren Neomycin, Kanamycin und Chloramphenicol,

Viele andere antibakterielle Antibiotika, die für andere Infektionen verwendet werden, erwiesen eioh bei PFIiO als wirkungslos· Beispiele dieser Antibiotika sind Penicillin und seine sahlrelohen Derivate, Cycloserin, Novobiocin und viele andere« Vie su erkennen ist, gehören su dieser Gruppe MIttel alt eine» breiten Aktlvitatsspektruttf ihre Inaktivit&t gegen Myooplasaa nacht deasuf olg· deutlich, daß diese Mikroben ein eigenartiger und spesiallsierter Bakterientyp sind·

Ziel der vorliegende Erfindung 1st die Bereitstellung nütalloher antibiotisoher Stoffe, die m Eindanaen de« prialiren, Ktiologisohen Mittels der Ghroniochen Srkrankung der Atttungeorgane von BUhnem und der ansteckenden Ifebenhöhlen-EntiündunÄ voa Trutaühnern hoch vSAAiriUi? _mD --:.;'■·;;-.-'.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung «ines neuen und nütsliohan antIMotischen Stoffes, der ohne ©©fahr von Toxisität in höheres Könsentg'atioßen verwendet Herden kann als die sur Zeit verfügbarem Stoffe·

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist dl· Bereitstellt^ eiEQs &atibiot&ki»Q₀ das eine orale Absorption gfgy die Beätailung der chronischen Erkrankung der Atmungfiofgane von Hühnern und der ansteckenden Kebenhöhlem^^ntzündung von Sruthtlhnera aufweist·

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Antibiotikums, das in verhältnismäßig niedriger Dosierung bei der Behandlung der ohronisohen Erkrankung der Atmungsorgane von Hühnern und der ansteckenden Nebenhöhlen-Entsindung von Truthühnern angewandt werden kann.

Ein weiteres zusätsliohes Ziel der vorliegenden Erfindung 1st die Bereitstellung eines Antibiotikums, das gegen einem breiten Bereich von Myooplasma-St Samen, einschließlich der zur Speoles H, galliseptioum (FFLO) gehörenden, bei der Behandlung der ohronisohen Erkrankung der Atmungeorgane von Hühnern und der ansteckenden Hebenhuhlen-Entsündung von Truthühnern wirksam ist.

«7. 009823/1867 bad original

Bin weiteret Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von antlbiotisehen Stoffen» die nicht nur in vitro und in ovo, sondern auoh in vivo eine betr&ohtliohe antlbiotlsohe AktlvltXt «eigen.

Bin weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Antibiotika« die «führend der Behandlung Benutzende Antikörper entwickeln, die eine spätere WiederInfektion verhindern·

Bin weiteres Ziel der vorlieg ad#n Erfindung ist ein Verfahrenxsum Herstellen dieses neuartigen antlbiotlsehen 8toffee.

Andere zusätzliche Ziele der vorliegenden Erfindung liegen nach der LelctUre der folgenden Beschreibung für den Fachmann auf der Hand.

Oegenstand der Erfindung sind, nun Hethobottromyoln- und Amethobottromyolnamlde der allgemeinen Formel

In der N Deecarbocmthojqrinethobottromycin, Desearbomethoxy amethobottromyoln oder deren Mischungen, R und R* Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyalkyl, Aryl oder Alkaryl bedeuten,

- 8 - ^BÄD

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wobei die Alkylreete 1 bis etwa 12 Kohlenstoff&%öig$ ent halten und R und R* gleiche oder versehiedm* haben können, und ein Verfahren zur Herstellu.*^ Verbindungen« das da&ureh gekennzeichnet ist, dass nan «inen Methobottrosorein« ©te» Smethobottromyelnester »it einer Aminoverblsgfeig $er Formel MHRR¹ unset st» wobei R und R* Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyalkyl, Aryl oder Alkali bedeuten.

Die neuen antibiotisohen Stoffe der vorliegenden Erfindung werden durch Abwandlung dee Moleküle der neuentdeokten Wkroorganismenspezies hergestellt, Oer Mikroorganismus wurde aus der OSrbrUhe eines Bodenstrahlenpilzes, der in Kanada gesammelt wurde, isoliert. Dieser neue Mikroorganismus wurde in der Kulturensammlung von Merck & Co., Ino., Rahway, Hew Jersey, als Streptoroyoes oanadensis (MA-959) bezeichnet.

- 8a -

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97Π If)

Eine Kultur davon wurde bei der fe&nentft&ionsgruppe der Aaerloan Type Culture Oolleetion, 12301 Parklawß SJr&ve* Rookvlll«» Ha^jIeAd₉ hint^le^t und d«r ständigen Kulturell« Sammlung als ATOC 17776 sugefUgt. Die neuen Produkte der neues Specie· von Mikroorganismen, die ale Metbobottromyoln uad als A&ethobottroayoin bekannt sind, werden In den Patenten Hr. ·. (Oase Ro. 971? und OMe Vo* 9819) beanepruoht und sind dort geotfenbart.

morphologischen und Kulturserknale von Streptonyoes oanadenei· MA-959 sind im foleeaden wiedergegeben!

Streptoayoes oanadeneie MA-959

Morphologle-Bivertioillat, Oerade Ketten von 8-10 Sporen, einige wenige Ketten langer· Sporen: «ylindrisoh (950 χ durohaohnittliohe Größe I₉O μ χ I₉I u) ·

Osapek Dox Agar (Saooharose Nitrat) - VaohetUMt sohwaoh, Ittftmyoelt spÄrlioh, weiß« Vegetatives WaohstuBi farblos. Rüokeeite: farblo·· Kein lösliches Pigment. Sporenbildung ι . gut.

Olycsrin—Aepergiß Agar « Waohe^umi gut, Luft^yo·!« «ittelgfrftvu fegetativei VtolietUÄi toann bis rtftlioabraira. Rüokeel

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te* braun Ms rötllohbraiän. Löelichea Pigment: braun bis röt· liohbraun (Sm frühen WaehstumeetadiUK ros&f eine Woohe). Eel-Sporenbildung beobachtet.

Sematenpa8te--Hafermehl Agar - Vaehstums gut. Sisftiayeelj mittelgrau mit weißen Büsoheln und roe a Exsudat« das nach Woohert auftritt« tT®getätivee Uüehetues braun· Rttekeeitet dunkelbraun. L@@lä@l@© 1?igme%%s braun. Etwas Sporenbildung.

Emerson⁸© Agar » Waohstumg rnäßi«· Luftmjoel: spärlioh, hellgrau. Yegetatives Vaohstüas braun« Rückseites braun. Löiliohes Pigment} hellbrami (im früheren Stadium rosa).

Karteffeipfropfen - Wachsturns gut. Kolonien: glatt, oremlg bis graubraun. Luftmyoels hellgrau (tritt nur im trookneren Teil des Pfropfens auf). Löslichee Pigment: mittelbraun (im frühen Stadium rosa).

Stärke-Agar - Wachstum: gut. Kein Luftmyoel. Tegetatires Vaohstums hellbraun. Büokseitet hellbraun. LÖBliohee Pigment hellbraun (im frühen Vaohetumsstadium rosa). Hydrolyse.

Hährgelatlneplatte - Wachstumt gut. Kein Luftayoel. Vegetati τββ Wachstum ι hellbraun· RÜokseitet hellbraun. Löeliihes Pigmenti hellbraun. Verflüssigung.

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Gelstißeetioh « löelichee Pigment: dunkelgrtinlioh-braun· 1/3 Verflüssigung.

J&gar » Wachstum: gut. Luftmyoelt ep&rlioh, weiß roea. ¥©g@tet£v©s Wachstum: sehr hellbraun. Leichte Bräunung des MeGiOEiE entlang dem Waohetumeetreifen.

- Vaohetums mäpie« Xtuftmyeelt blaßrosa « weiß. Yegef aeiver Waohetuas sehr heli'orauii. Leioiite Bräunung dee

F@pt&n«l£@en«Hefeextraktf eohrätfer Hilirbodest - Waohetma: gut· Kein Luftm^roel. Vegetatives Vaoh6tim$ grau. Lösliches Pigments blamecslwag's mmh 2 Tagen. Mittelbraun naoh 3 Voohen.

Magermileh Agar - Wachs tun: gut. Luftmycels weißroea. Vegetatives Waehstumi iielXTiraim« LtfsrUohes Pigments eehr hellbraun. Seine Hydro!ye«-,

Reduktion t3b Hitratiin « unter Yersuohebedingungen in organieohen uad eynthetisohen Kedienj negativ.

· gutes Vaohstuia hnl 28⁰O* Kein Wachstum bei . HÜcro-ärophiles Wachstum - (Hefee^trakt—Bextroseetieh)

BAD OR!^

009823/186 7

Starke® Qfees^l&ehenwaohetum ©atlang 2/3 der

vel3.s1;gadlg naoh 5 Wochen. Kilns

Waohetunerlsige mit epärlioh@&

Luftmyoal {hellgrau}, £8sllonea Pigment ι aeittelgrau-b^aun. Heaktlon (pH ? 9).

- PepfconieieruBs vollständig naofe 3$ Voohea· Seine Oerinniing. Alicallßohö Reaktion.

"Die vorstehende Beßohreibang der HethoDottromyoin νω& Amethofeottromjoin erzeugenden Mikroorganismen wurde zur Veransohauliohung geelgn@t@r Strepteiasroeeetäimae gegeben, die zur Herstelliang von Methobolitromyoin und Amethofeottremyoin verwendet werden können* Ee versteht eioh jedooh, daß die hier gemachten Angaben nioht auf Organismen beeohränkt werden sollen, die dieser eps^ieilen Besohreibung entspreohen» Pur die vorliegende Erfindung kommen auch andere Streptomyoesarten oder Varianten der beschriebenen Organismen in B@» trsoht, wie solohe, die disroh natUrliohe Auswahl erhalten oder duroh mutierende MIttel, s,B« Röntgenbestrahlung,

, Stioketoff seaiq und dgl·, erseugt wenden»

BIe neuen Antibiotika der vorliegenden Erfindung stellen molekulare Abwandluogm der bailee he η Verbindungen dar,

OÖ8S23/186? BAD ORIGINAL

dia sowohl mit anorganischen ale auch organischen Säuren, wie Ohlorwasserstoffväure, Weinsäure, Salicylsäure usw», und '1-'A^m Verbindungen Salze bilden.

Die freie 3aeenform von Hethobottronyoin und Amethobottromyoin weist folgende physikalischen und chemischen Eigenschaften aufι

Me thobottromyo in

a. Kristallisiert aus Xthylaoetat in form weißer Prismen, die bei einer Temperatur von etwa 166 bis 167⁰O sohmel· zen.

b. Leicht löalioh in Alkoholen, Betern, Xthern, chlorierten Lösungsmitteln und Benzol·

o. Teilweise löslich in Wasser.

d, Unlöslich in Fetroläther, Hexan und dergl.

e. Die spezifische Drehung betragt [oc]£° « -15° in einer 5#igen Lösung von 95^igem Äthanol.

Amethobottromyein

a. Schmilzt im Bereioh von etwa 154 bis etwa 163⁰O.

b. Leicht löslich in Alkoholen, Estern, Äthern, chlorierten Lösungsmitteln und Benzol₀

o. Teilweise löslich in Wasser·

d. Unlöslich in Fetroläther, Hexan und dgl.

e. Die spezifische Drehung beträgt [a]^° - -25⁰C in einer 5üiigen Lösung von 95*igefl jftHf., ^ ₈ g ₇ bad

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Im Gegensatz zu anderen Antibiotika sind Ket_.@bo.ttr®ai3rein und Aroethobottromycin, wie gefunden wurde _v Xeldsr Kufierst komplexe Verbindungen mit einem MolekulargewieM voa 800· Demzufolge ist es bisher auch nicht Bögliofc die genaue, vollständige _usamm®ns©t_ung von, myoin oder Amethöbottrommeln su fesstiismsB.«, Es den, daß diese Verbindungen di® Element© Kofelea@t@ff stoff. Stickstoff, B©hw@f©l «nd San^^stoff enthalten· für diese Elemeat© wurden f@lg

Me t hobot tromyc in
C - 59,50 $
H - 7_S52 $>
N - 13,50 *
S - 3·9Ο ί

0 - 15,58 $ (als Dlfferene .

bestimmt) hmt

Zue.100,00 $ Zusammea 100_e00 fl

Diese Werte lassen auf di© M©l@külstru_tur@^ O₄₀HgQNgO₇S für Methobott_?@myoin b_w. für Anethobottreoiyoiii schließen. Innerhalb der experimentellen Fehlergr©_i_© Bestimmungen sind aber auch ähnliohe Holekularformslsi möglich·

Die Infrarotabsorptionsepektren der Antibiotika bottromycin und Amethobottromycin in Ohlorofoxn unter Verwendung von Natriuraohlorid-prismen werden in anliegenden

- 0 0 9 8 2 3/1 8-6 7

BAD OWGJNAL.

Zeichnungen veranschaulicht. Did ausgeprägteren der charakteristischen Maxima treten bei &mn folgenden, in rocipiokeik Lentiraatoi'ii ausgedrückten Wellenlängen auf: Methobottromyoin - 3300, 2950, 1730, 1630-1650, 1490, 1360, 1300, 1242, 1160, 1132, 1119, 1102, 980, 806| Ae©tfc©fe©ttr@e^©&jr » 3290, 298O, 1759, 1640-1685, 1500, 1440, 1378, 1240, 1181, 1122, 1092, 1061, 995, 980,

eingegebenen Meßwerte der Infraretepelctren n anliegenden Zeichnungen nooh deutlicher eioht-

Se ä®m. ^©ichnungen geigen

I üBB Aßfrarotspektrum von Ajtiethobottromyoin und Figur IX am® Im£r®&Qtepektr\m von MPtbobottro»yoin_e

Methobottromyoin und Amethobottromyoin zeigen in den folgenden Lusungsmitteleystenen csharakteristisohe R^-Werte:

Metho« bottreayoin

_« "Jk.

, gesättigt mit
wässriger Essigsäure 0,85 0,85

Büit
Pyridin 0,84 0,84

gesättigt Kit
wässriger Essigsäure 0_f3T 0,57

Xthyl&oetat, gesättigt mit

0,1 M Phoephatpuffer (pH 7) 0,83 0,83

0 0 9 8 2 3/1867 ^^{0 GRfß}^AL

9714

Benzol s Hexan s 7 7. 6 s IO j S) Benzol s Hexan : Methanol t tigern, wässrigem

(7 i 6 : 10 i 6 BeDjol, gesättigt mit wässriger Essigsäure Benzolf gesättigt alt wässrigem Fyridin Caprylalkohol, gesättigt mit O, IM Fhosphatpuffer (pH 6$ umgekehrte Phase)

Am@tho-

bottromycin

O₀O

0,30

Hetho-

O₉O

0,5	0,5
O9O	0,0
0,5	0,5

0,19

Zur Ohsrakterisiarung der Antibiotika, die erfindungsgemäß molekular abgewandelt werden, kann auch die !Dünnschicht Chromatographie dienen_e Dünnschicht - Chromatograph!* Platten, die Silikagel enthalten, werden in 94^ Chloroform und 65ε Methanol entwickelt, getrocknet und in eine Joddampf-Kammer gebracht. Ein brauner Fleck zeigt die Anwesenheit der erfindungsgemäßen Antibiotika an. Der R^»Vert der Methobottromyoinzone ist 0,64 und derjenige der Amethobottromyoinzone 1st Oj, 60,

Die Methobottromyoin und Amethobottromyoin erzeugende Kultur liefert im allgemeinen zwei Stoff typen: ein Antibiotikum vom Hetropsin-Typ und ein Antibiotikum vom Bottromycin

BAD

nfifliiiHäßi - 16 -

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Typ. Die Bottromyoin-Antibiotika-Gruppe, aus der Methobottromyoln und Amethobottrorayoin extrahiert werden, läßt sloh leicht von der ITetropsin-Gruppe durch Extraktion mit Chloroform aus wässrigen lösungen abtrennen· Der Ohloroform-Extrakt zeigt nach der Reinigung die Anwesenheit von 5 antibiotisohen Stoffen im Papierstreifen-Bioautographen. Bas tür diese Untersuchung verwendete Papierstreif en-System besteht aus einem Papier, das mit Caprylalkohol Imprägniert 1st und stromabwärts mit Puffer entwickelt wird, wobei der Rf-Wert von Hethobottromyoln 0,19 ist und derjenige von Amethobottromyoln 0,50 ist« Die 5 Bestandteile erhielten in der Reihenfolge abnehmender Polarität die Bezeichnungen A bis E. In der untenstehenden Tabelle A sind die Bioaktivitäten aller Bestandteile des Bottromycin« aufgeführt. Die erste Spalte "Staphe MIO⁹ gibt einen Höhrchenverdtinnungsversuoh wieder, bei dem die minimale inhibierende Konzentration des Antibiotikums in einer flüssigen Kultur des untersuchten Mikroorganismus, Myooplasma galliseptioum (PPLO), gemessen wurde,Diβ zweite Spalte "In Ονο HDe₀" gibt einen in 0vo-7ersuoh wieder, bei dem die wirksame Doeis des Antibiotikums für den Sohuts eines einen Embryo enthaltenden Eis vor einer bekannten Mikroorganismen-Injektion, in diesem falle Miooplasma galllseptioum (PPLO), gemessen wurde. Das Modell für diesen Versuch lieferte das von R. Yamamoto und H.B.Adler (Am.J.Vet.Res., Juli 1965)

BAD ORIGINAL

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beschriebene Prüfsystem, mit der Abänderung, dap als meter zur Messung der Wirkeas&eit des Eellmitt@i@ anstelle der Verlängerung der Isebesseseit des Etabryoe am· Se&mta gegen Sterblichkeit verwendet wurde.

Tabelle!

Bestandteil	St&plä,, MO pg/ml
A	35O
B (Ametho- bottromyoin)
ö (Mtothc- bottromycin)	O 9 04
D	Q916
E	0,23

Tabelle B geigt, daß aus den 5 Bestandteilen drolyse Ninhydrin erseugende Stoffe freigesetzt werden, (bestimmt durch Papierohromatographie)·

Tabelle B

	A	( Amethobottromyoin) (Methobottromyoin)	Φ
Stoff		B C	φ
Glycin	+
Prolin.		+ -
Thiasol		+ +
Methyl-	-		BAD Oi
prolin
Valin
		009823/1867
	. - 18 -
RIGttJAL

9714	Tabelle B
Fortsetzung	A
Stoff	♦ ■
unbekannt A	+
unbekannt B
β-Methyl- vhenylelftßii

(Ametho- (Metho* bottromycin) bottromycin)

B 0 D-Ei⁰

fe@semt8ata mm Abtrennung su

&WO @g1°)@12Lg B SlI iet₉ enthält JüaetnobottiO

qM&s?

feel ©ines pH-Kerfe erBßei· als lOfeind m JLEe^aMX. Bei pß 3 bie 9 «in4, äieeo Progtimien lang bei Rauaiteaperatur etabil«

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leiten eioli von Fenaentierunf von Streptoayoes oanage®$gü&$en_f ^^efri^en Medium «r-H@di&n₉ wie ai@ für uifc Hera teilung fexvendet werden^ aintf für die Hentel uM /jrntl^feettpcayoiffi geeignet«

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.„,009823/1867

tier dige

und Sti@l^t@£toi©EL@n Im tor Medium

se, Sa©©2ts3P@£@_s Besfepta m$ %1₉, g©ei<gmet® Quellen für assliBilieiftaren Kohlenstoff· Die genaue !finge d®p Εοΐα«Ώ.» •toffquellö häß^fe teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediales sbj g@%/8nali0h geloht aljer^ wie gefunden wurde» eine Kohlehy&ratmenge zwischen etwa 1 und 6 (lew.^ doa Mediums aus· Diese Kohlenstoff quellen können einsein verwendet oder au mehreren in dem Medium kombiniert werden.

Verschiedene Stickstoff quellen, wie g&seiiihydrolysste, Aminosäuren, wie Asparagin, Glyein, Arginin, Zersetssungsprodukte ("digests'») von Sejafeohneamehl, So^al>ohnemB@hl selbst, lusliohe Stoffe aus der Brennerei und dgl·, werden von Methobottronysin und Amsthobottromyoin erzeugenden Mikroorganiemen leicht assimiliert und kennen in Iersientierufi£pmedien zwt Herstellung dieser Antibiotika Verwendung finden» Im allgemeinen findet ®a&₉ daß organische Stiokstoffquellen, insbesondere Sojabohneimehl, für die Brzeugung des neuen Antibiotikums sehr ntitslioh sind.Diβ yersohiedenen organischen und anorganischen Stiokstoffquellen können ellein oder in Kombination in Mengen von etwa 0,2 bis etwa 6 Gew.£ des wässrigen Mediums verwendet werden. _{BÄD 0RIQWAL}

008023/1867 - 20 -

«ι

Bas folgenAe Beispiel veranschaulicht eine Methode zur Benrtelliutgr $@» Antibiotikums, von dem sich dl· Derivate der vorli®sg®sii®n Erfindung ableiten« Es versteht sich jedoch, daß dieste Beispiel nur sur Veransohauliohung, nicht aber zur Begrenzung der Erfindung gebraoht wird.

Beispiel A. gernentieruag

Ein Medium, das l£ Dextrose, 0,3 $> Fleischextrakt, 1,0 5 mit Trypsin erhaltenes Verdauungeprodukt ron Kasein und Natriumchlorid enthielt, wurde in Wasser aufbereitet und mit Natriumhydroxyd auf pH 7,0 eingestellt, sterilisiert und aseptisch zu einer schrägen Kultur von Streptomyoes oanadenaia MA.959 (ATOO 17776) gegeben, und die Sporen wurden in die Suspension gekratzt, ungefähr 3 ml dieser Sporensuspension wurden aseptisoh in einen zugestöpselten, 2 1 fassenden (mit Stutzen versehenen) Erlenmeyer-Kolben gegeben, der 500 ml eines sterilen, wässrigen Mediums enthielt, das aus 1 f> Dextrose, 0,3 $> ELeisohextrakt, 1,0 # eines mit Trypsin erhaltenen Zersetzungeproduktes von Kasein und 0,5 # Natriumchlorid enthielt« und der pH-Wert wurde wieder auf 7,0 eingestellt. Der Kolben wurde bei 28⁰O auf einem drehenden Schüttler bei einer Geschwindigkeit von 120 Umdrehungen/

0OS823/1867 bad

-. 2i -

Min. und bei einem Auesohlsg von 5,08 om 48 Stimde» lang

Diese vegetative Kultur wurde dann aeeptieoh in einen 189 1 fase enden ^ei-mentierungefceuälter aus rostfreiem Stahl, der etwa 115 bis 150 1 eioee sterilen Mediums enthielt, das 1,5 $> Hefeauf f>lar»at_e 1 £
enthielt wi& äQmm®tk $& ©asf f

S 2.

tea j® f ₀© Φ®ΐ53Μ,©ΧΪ5 wMi etwa 120⁰O 15 Misi©-i5©ia
tur wia^de bei 28^@© isa-fe©^ lüfei®,
s®hwindigkeit von O₉S

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- 22 -

9714 %\

&-gm 1 Έ ämmlaik mit elnwr Geschwindigkeit von _o oM,@a?t. !©fern 18,9 1-B?aktionen wurden abgeg $öüo ws^ä® si% Seiger OhlorwasserstoCXsäure auf pH 7 ffiomfeülisles²*. Bi# Fraktionen wurden untersucht, und die üiiv©® l'gMieiei i$mä®& auf 28,5 1 Wasser eingeengt. Sas : ;, . auf pH S eingestellt und dreimal mit einem iüBom Chloroform extrahiert, und die Extrakte wurden über !©.tidiäiieiilfat getrocknet· Sas reiche Chloroform wurde bei ei&@F BerOhrungs^eit von 10 Minuten durch eine Säule geleitet, Sie eine Mischung aus 7O£ Plorisil, und 30^ Celite 54? enthielt. Der Absorption folgte eine Wäsche mit 37,8 1 Chloroform und anschließend eine ELuierung mit 5θ£ Chloroform-Aceton mit gleicher Geschwindigkeit. Von dem Eluat wurden 1,89 1-Fraktionen abgenommen, und die Traktionen wurden untersucht. Die aktiven Traktionen wurden vereinigt und auf 1,89 1 Chloroform eingeengt. Das Chloroformkonsentrat wurde zu einem Syrup getrocknet und in etwa 160 ml Methanol aufgenommen. 10 Volumina Äthyläther wurden zugegeben, und die unlöslichen Anteile wurden abfiltriert. Eine 1,2 IT methanolische Chlorwaaserstoffeäurelösung wurde unter Rühren so lange zu dem Ätherfiltrat gegeben, bis sich kein weiterer Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet.

Methobottromyoin und Amethobottromyoin wurden durch Teilungs-Chromatographie mit O,1M pH 6,0 Phosphatpuffer als E_nt-

009823/1867

_BAD original

9714

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des pH 6,0-Puffers gelöst nad in Sie Säul©

Säule wurde mit pH 6,0-Ριιᣩ2» entwickelt, und ©s wurden

18,9 1-lraktionea ©ntnosaiiiia«, Jed@ Sraktioa 4© S 2 1

Einengen aui ©twa 1/5 ibr©s gepslift uad ₀ liastellen

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BAD ORSGiNAL

9724 -

lamm mit folgernden Ergebnissen getrocknet:

Antibiotika Fraktion Menge

29-38 4,1 g

39-60 13₉4 β

Die ®@nes_t s^fiadirngsgeniäßen antiblotischen Stoffe werden äwc®h überführung wqu Methobottromycin und Amethobottroraycin in Amid® der allgemeinen Formel

OE

MO-K

in der M Oes-oarbomethoxy-methobottromyoin, Dea-carboraeth-O3:y-amethobottromyoin oder M5,sohungen davonj H ixnd R' Wasserstoffs einen AUcylre»£„ einen Arylreet oder eine». Alkarylrest bedeuten, wobei die Alkylreete 1 bis etwa 12 Kohlenstoff atome enthalten, und H und R* gleioh oder verschieden sein können_c Die Herstellung der erfindungsgemäßen Derivat© kann durch Umsetzung von Methobottromyoin und Amethob@ttx*omyoin mit verschiedenen Aminen gemäß folgendem Reaktioüssetam erfolgens

BAD ORiGSNAL

H₅ 1

g i-A®

üos-

l⁰

M-O-IRB¹ * 2H0

glei@h© Bedeutung uie ©ben_e

Sie folgenden lalüfiQl© verensohaulichen Methoden zur Herstellung der esrfiMuogsgemäßen Antitiotikaderivate, Es versteht sicli jedoch, daß die Beispiele nur zum Zweoke der Veranschaulichung der Erfindung angeführt werden, die Erfindung jedoch nicht begrenzen sollen.

BAD

- 26 -

00S823/1867

9714 Beispiel 2 .

Herstellung von Methobottromyclnmethylamld 1,0 g Methobottromyolnmethylester wird in 10 ml einer methanolisohen Lösung, die 20 Gev.£ Methylamin enthält, gelöst. Sie Mischung wird 18 Stunden lang in einem verschlossenen Rohr auf 50⁰C erhitzt. Das entstandene Methobottromyoiomethylamid wird durch Verteilungschromatographie unter Verwendung ▼on C apryl alkohol, Celite und Puffer, wie unter ⁿB.Gewinnung" in Beispiel 1 beschrieben, in einer Ausbeute von etwa 30 Gew.# isoliertο

Beispiel 3

Herstellung von Amethobottromyoinmethylamld 1,0 g Amethobottromyeinmethylester wird in 10 ml einer mcthanollashem Lösung, die 20 Gew.£ Methylamin enthält, g@13st. Di© Miaotaag wird 18 Stunden lang in einem verschlossenen Roiir @isf 30®Q erhitzt. Das entstandene Amethobottromyd^& durch V@rtellung8Ohromatographle unter Oaprylalkohol, Celite und Puffer, wie unter Beispiel 1 beschrieben, in einer Auebeute

BAD

00^323/1867

1820027

S ^Jk_-JLJjJUtJL 4 Herstellung einer Mischung aus Methobottromycin und

1,0 g einer 70s3O#igen Mischung aus Methobottromycin und Amethobottromycinmethylester wird in 10 1 einer methanolischen Lösung, die 20 Gew.^ Methylamin enthält, gelöst. Die Mischung wird 18 Stünden lang in einem verschlossenett Rohr auf 5O⁰C erhitzt. Sie erhaltene Mischung aus Methobott romyc in und Amethobottromyoinmethylamid wird durch Verteilungschromatographie und Verwendung von Caprylalkohol, Gelite und Puffer, wie unter "B. Gewinnung·¹ M Beispiel 1 beschrieben, in einer Ausbeute von etwa 47 Gew.56 isoliert.

iiilj 1 JtA. 1 ' - '

Herstellung von Methobottromycinäthylamld

1,0 g Methobottromyoinmethylester wird in 10 ml einer methanolischen Lösung, die 20 Gew.# Äthylamin enthält* gelöst. Die Mischung wird in einem versohlossenen Rohr 18 Stunden lang auf 50°Ö erhitst. Das entstandene Methobottromycinäthylaraid wird durch Verteilungschroaiatographie und Verwendung von Caprylallcohol, Celite und Puffer, wie unter ⁿB. Gewinnung*¹ in Beispiel 1 beschrieben, in einer Auebeute von etwa 48 öew·^ isoliert, BAD

009823/1887

9714

B eis ρ i 6,1

air

Herstellung von Amethobottromyeinäthylamid

1,0 g Amethobottromyoinmethylester wird in 10 ml einer methanclischen Lösung, die 20 Gew. ^ Äthylamin enthält, gelöst. Die Mischung wird 18 Stunden lang in einem verschlossenen Rohr auf 30⁰C erhitzt. Das entstandene Amethobottromycinäthyl amid wird durch Verteilungschromatographie und Verwendung von Cerylalkohol, Gelite und Puffer, wie unter "B. Gewinnung¹¹ in Beispiel 1 beschrieben, in einer Ausbeute von etwa 48 Gew. isoliert.

Bei spie 1 T

Herstellung einer Mischung aus Methobottromycin- und Amethobottromycin-n-propylamiden

1,0 g einer 8Ö:20£igen Mischung aus Hethobottromyoln und Amethobottromycinmethylester wird in 10 ml einer methanolisohen Lösung , die 20 Gew.£ n-Propylamin enthält, gelöst. Die Mischung wird 18 Stunden lang in einem verschlossenen Rohr auf 50⁰C erhitzt. Die Mischung aus dem Methobottromyoin- und Amethobottromyoln-n-propylamid wird durch Verteilungsohromatogä.*apM# ümäer Verwendung von CaprylaikahoX, Gellte und Puffer, wie unter ⁿB. Gewinnung" In Beispiel 1 beschrieben, isoliert. 00S623/1867 ^BAD

162

Beispiel 8

Herstellung von Methobottromyoin-ß~phenylamid

1,0 g Methobottronyoinmethylester wird in 10 ml einer methanolischen Lösung, die 20 Gew.# ß-Phenyiäthylamin enthält, gelöst. Sie Mischung wird 18 Stunden lang in einem verschlossenen Rohr auf 50⁰C erhitzt. Das entstandene Methobottromycin-ß-phenyläthylamid wird durch Verteilungechromatographie unter Verwendung von Capr;!alkohol, Celite und Puffer, wie unter ^MB. Gewinnung" in Beispiel 1 beschrieben₉ in einer Auebeute von etwa 42 Gew.ίέ isoliert.

Beispiel 9

Herstellung von Aaethobottroiaygin-l-naphtfojlittethjlaiaid

1,0 g Amethob©tte©mj©lximetfe3rlest©r wird in 10 blL methanolisete®, !AiHBg₀ die 1© Gew_e^ l-Wapii,tiayXm@tfe,sflea hält, gelöst. Di© Mischung wird 18" Stmaieii issg -im eIs schlosseneiä Rsfe m*& 5ö®0 ^ciii^ste Das -©ntstsadeia©

chromatogrsphi© ^smt®!³ ¥en#eis,tiaag

und Puffer, wie wm%®T? ^ΜΒ. ©©wisaiasäg«¹, _:&n Beispiel 1' in einer AmsfeQnt® worn,

³⁰~ 009Ö23/1S67

9714 «vV

Beispiel 10

Herstellung τοη Methobottroinyoin-cyolohexylamld

1,0 g Methobottromyelnmethylester wird in 10 ml einer methanollschen Lösung, die 20 Gew.56 Cyolohexylamin enthält, gelöst· Die Mischung wird 18 Stunden lang in einem verschlossenen Bohr auf 50⁰O erhitzt. Bas entstandene Methobottroayoin-oyclohexylamid wird durch Yerteilungschromatographle, unter Verwendung von Caprylalkohol, Gelite und Puffer, wie unter "B₀ Gewinnung" in Beispiel 1 beschrieben, in einer Ausbeute τοη etwa 44 Gew,£ isoliert.

Beispiel 11 Herstellung τοη Methobottromyoin-benzylamld

1,0 g Methobottronyoinmethylester wird in 10 ml einer methanol is ohen Lösung, die 20 Gew.£ Bensylanin enthält, gelöst. Die Mischung wird 18 Stunden lang in einem Tersohlossenen Bohr auf 50°0 erhitzt. Sas entstandene Methobottromyoin-bensylamid wird durch Yertellungsohromatographie unter Terwendung τοη Oaprylalkohol, Gellte und Puffer, wie unter ⁿB. Gewinnung¹* in Beispiel 1 beschrieben, in einer Ausbeute τοη etwa 46 Gew.£ isoliert.

BAD ORIGINAL - 31 -

008823/1867

9714 . 33

Beispiel 12

Heratelliing von Methobottromyoin-2«5-propandiol-l-ajpld

1,0 g Methobottromycinmethyiester wird in 10 ml einer methanol! sehen Lösung, die 20 Gew.# 2,3~Propandiol-l-amin enthalt, gelöst. EiQ Mischung wird 18 Stunden lang in einem verschlossenen Rohr auf 50⁰O erhitzt. Das entstandene Methobottromyoin-2,3-propandiol-l-amid wird durch Verteilungeohromatographie unter Verwendung von Caprylallcohol, Celite und Puffer, wie unter "B. Gewinnung" in Beispiel 1 beschrieben, in einer Ausbeute von etwa 50 Gew.56 isoliert«

Beispiel 13 Herstellung von Methobottromyoin-äthanolamid

1,0 g Methobottromyoinraethylester wird in 10 ml einer methanolischen Lösung, die 20 Gew.^ Ethanolamin enthält, gelöst. Die Mischung wird 18 Stunden lang in einem verschlossenen Rohr auf SO⁰C erhitzt. Das entstandene Methobottronyoin« äthanolairdd wird durch Yerteilungsohromatographie unter Verwendung von Capryl&lkohol, Celite und Puffer, wie unter ⁿB. Gewinnung" in Beispiel 1 beschrieben, in einer Auebeute von etwa 50 Gew.i> isoliert.

000*23/186 - 32 -

9714 Beispiel 14

Herstellung von Methobottromyein-anilinamid

1,0 g. Methobottromyoinmethylester wird in 30 ml Aoeton gelöst und mit 50 ml 0,1-N-Natriumhydroxyd versetzt. Die Mischung bleibt 2 Stunden bei 6⁰C stehen. Mit Chlorwasserstoffsäure wird der pH-Wert auf 6,2 eingestellt, und die Lösung wird auf das halbe Volumen eingeengt und bleibt zum Abkühlen stehen. Aus dieser Lösung kristallisieren etwa 0,8 g der freien Methobottromycinsäure aus. 80 mg der freien Säure werden in 2 ml Dimethylformamid gelöst und mit 40 mg bis-2,4-Dinitrophenyloarbonat versetzt. Dann werden IO mg Triäthylamin zugegeben, und die Mischung bleibt 30 Minuten' lang stehen. Sann werden 10 mg Anilin zugegeben, und die Mischung bleibt über Nacht stehen. Diese Mischung wird mit 10 ml Methylenohlorid versetzt, mit Wasser gewaschen, und die Waschwasser werden verworfen· Das Methylenohlorid wird verdampft, und das Methobottromyoin-anilinamid wird in einer Ausbeute von etwa 70 $> isoliert.

BAD ORfQlMAL

009823/1867

33 -

9714 35"

Beispiel 15

Herstellung von Methobottromyoin-p-fluoranilinamid

IO g Methobottromycinmethylester werden in 50 ml Aceton gelöst und mit 50 ml 0,1 N Hatriuahydroxyd versetsfce Die Mischung bleibt 2 Stunden lang bei 6⁰O stehen. Hit Chlorwasserstoff säure wird der pH-Wert auf 6„2 eingestellt_s und die Lösung wirä auf ihr halbes ToXumen eingeengt sa&ct bleibt zum Äblcülalen stehen« Aus dieser Lösung kristallisieren etwa 0,8 g der freien Methobottromycinsäure aus. 80 Big der freien Säure werden in 2 ml Bimethjlf©:m@mi€i gelöst vmä rait 40 mg bie-2_t4-Dinitroplienylcarbonai° ^ersetst· ®@si® ws^iQja 10 mg Triäthylamin zugegeben, und die Mischung bleibt p: WL@mt®n lang stehen. Dann werden IO jag p-Huorenilin su.g©goli©a₈ und die Mischung bleibt über Nacht stehen. Dies® M£@@h*äS!g wird mit 10 ml Methylenohlorid versetzt, mit Wasser gewaschen, und die Waschwasser werden verworfen. Das M©thylea©blorid wird verdampft, und das Nethobottromyoin-p-fluormiilinamid wird in einer Ausbeute von etwa 60 i> isolierte

0 0 0'8 2 3/1867

Beispiel 16

Herstellung von Methobottronycin-S.N-diinethylamid

1,0 g Methobottromyolnmethylester wird In 50 ml Aceton gelöst und mit 50 ml 0,1 N Natriutnhydroxyd versetzt und bleibt 2 Stunden lang stehen. Mit Chlorwasserstoffsäure wird der pH-Wert auf 6,2 eingestellt« und die Lösung wird auf Ihr halbes Volumen eingeengt und bleibt zum Abkühlen stehen. Aus dieser Lösung kristallisieren etwa 0,8 g der freien Methobottromycinsäure aus. 80 mg der freien Säure werden in 2 al Dimethylformamid gelöst und mit 40 mg bi8«2,4-Dlnitrophenylcarbonat versetzt. Dann werden 10 mg Triethylamin zugegeben, und die Mischung bleibt 30 Minuten, lang stehen. Dann werden 10 mg Dimethylamin zugegeben und die Mischung bleibt über Macht stehen. Diese Mischung wird mit 10 ml Methylenchlorid versetzt, mit Wasser gewaschen, und die Waschwasser werden verworfen. Das Methylenohlorid wird verdampft, und das Methobottromycin-I^li-dimethylamld wird in einer Ausbeute von etwa 56 % isoliert.

Beispiel 17 Herstellung von Amethobottromyoin-2-amlnobenglinidazolJUDld

1,0 g Amethobottromyclnmethylester wird in 50 ml Aceton gelöst und mit 50 ml 0,1 Il Natriumhydroxyd versetzt und bleibt 2 Stunde:: ''r.i ■; gt©hen. Mit chlorwasserstoffsäure wird der

BAD ORIGINAL

,. 009823/1867

- 55 -

pH-Wert auf 6₉2 eingestellt , und die Lösung wird auf das halbe Volumen eingeengt und bleibt zum Abkühlen stehen. Aus dieser Lösung kristallisieren ungefähr O,8g der freien Amethobottromyeinsäure aus« 80 mg der freien Säure werden in 2 ml Dimethylformamid gelöst und mit 40 rag bie-2,4-Din±trophenylcarbonat versetzt, Dann werden IO mg friäthylamin zugegeben, und die Mischung bleibt 30 Hinuten lang stehen. Dann werden 10 mg 2~Amisooenz±mida2ül zugegeben* und die Mlsohung bleibt über Nacht stehen, Biese HisolKmig wirS mit 10 au. Methylenenlorld versetzt, mit Wuaer g#was©iien_e and Si@ Waschwasser werden verworfen. Das Metäylenoftlorid wird verdampft, und das Amethobottromycin-S-aminobenssimidasolamiS wirS in einer Ausbeute von etwa 50$ isoliert»

Beispiel 18 Herstellung von

1,0 g Kethobottromyoinmethylester wird in 50 ml Aceton gelöst und mit 50 ml O₉I H Nateitasihydrosyd versetzt und bleibt 2 Stunden lang stehen. Mit Ghlorwasserstoffegur.e wird der pH- ¥©rt anas 6₉2 eiasgeetelltg maä äiQ Isüsiaag wird saf um lisllbe Volumen eijsg©@s^t vmä "bleibt zvm ÄMsi&S.©® st3fe@a_o Mm äieser Lösung lixistallisleren ©twa
säure aus« 80 mg &®τ fr@£©a
formamid gelöst un€ mit

BÖSi23/iSi7 BAD ORIGINAL

Mischung bleibt 30 Minuten lang stehen. Dann werden 10 mg Morpholin zugegeben, und die Mischung bleibt über Nacht stehen. Diese Mischung wird mit 10 ml Methylenohlorid versetzt, mit Wasser gewaschen, und die Vasehwasser werden verworfen. Das Methylene&Lorid wird verdampft, und das Methobottromyein wird in einer Ausbeute von etwa 62 f> isoliert.

Beispiel 19

Herstellung voa lfethob@ttrom^oin«g.sr»diäa»thylaminoäthylamid

,ayoin

1*0 g MethQh®iit?emmthj±mt®T wird ia, 50 sü Aoyton gelöst und mit 50 ml O₉I If l&triualaydroxyd vereatat und bleibt 2 Stunden lang steuern«, Hit QMlQTweaaQ7F®tQi£t®&m><a) wird der pH-Wert auf 6,2 eingestellt, mit di@ Lösung wild auf das halbe Tolumen eingeengt vmä, bleibt sum Abkühlen ettehen. ius dieser Lösung

₁Sg i@r freien Methsbottrosycineaure der f^ei^n Säure werd©E in 2 al Dimethylformamid gelbat xm& mit 40 isg bia-2^r,4->Binitr@plii9nyloarbonat -versetst. Dank weri@a IO mg friätliylamin sug«£eben₉ und die Mischung bleibt 50 Mnmt©iä lang stehen« Bann. <*¥i2'aen 10 mg !!,If-Bimitthyl

e'liem_s ^ani die KUeAhu&eT liliiibt über Naoht Biee© Ansehung wird mit 10 v£k Hethylenohlorid ver-

d die Wesclwraaser w^den ver-. wird ^s^iaapft^ und das MethoyäylgL^r;2i^fl w±fu Iie eise-2* Ausbeute

von etwa 60 ^ ieotteari;. ·

009823/1867

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s tea en. Biese Miscftmig \dx& Kit 10 ssl setzt ₉ mit Waeeer gewssofe©3S₉ imä die worfen· Bas MethylencfalorM wird vei*äejEpft ester von Methobottroia Ausbeute von etwa 58 fl

Beispiel

ver

ait 50 süL 0,1 I

BAD ORIGINAL

Stunden lang stehen. Hit Chlorwasserstoff säure wird der pH-Wert auf 6,2 eingestellt, und die Lösung wird auf das halbe Volumen eingeengt und bleibt sum Abkühlen stehen· Aus dieser Lösung kristallisieren etwa 0,8 g der freien Methobottromyoinsfture aus. 80 mg der freien Säure werden in 2 ml Dimethylformamid gelöst und mit 40 mg bis-2,4-Dinitrophenylcarbonat versetzt» Bann werden 10 ng Trläthylamln zugegeben, und die Mischung bleibt 30 Minuten lang stehen. Bann werden 10 mg DodecylaiaiE Zugegeben, und die Mischung bleibt über Naoht stehen« M©©© Mischung wird mit 10 ml Methylenohlorid versetzt, Wasser gewaschen, und die VaSchwasser werden verworfen.

wird verdampft, und das Methobottromyoineiner Ausbeute von etwa 62 f> isoliert·

₅O Q, /iss^lMaiaoisfeGE^i^eifi^feflester mIM in 5^ sslÄ©eton gelöst £ &£& m di H₀I H le^s'iiiÄ.yiysxjä vereetst wad bleibt 2 <sun2iiMi^ 2,QHhQ B\5<SjhGE,o Is OMorMasserst^ff »ftyre wird der pH- !^■ö csi? '5_ΰS Gi-^ccfeolH'öo i2aS äi® IsSEPtüSg wiru auf das halbe :.j ^;::L CL^j^e-i^i pse(E ^2.edM sm £l*lil?I@a stebefi· Au» dieser 3uis·,^ :'::^^·^ίΗ^1.Γ^·,.1ΰΞ=£;ι 5-S":?g ®_S6 ig β©Σ? freien üngtl ^ir-ii ;:.!■?::: ο iV £j ^-.^2? fiPOL-s^ Suhsp© "j^SPäea i:i 2 a£L

Bi-aitropht: lylosrbonat 0-323/1867 bad original

versetzt. Bann werden 10 mg Triäthylamin zugegeben, und die Mischung bleibt 20 Minuten lang stehen« Bann werden 10 mg Iraidazol zugesetzt, und die Mischung bleibt über Nacht stehen. Biese Mischung wird mit 10 ml Methylenchlorid versetzt, dann mit Wasser gewaschen, und die Wasohwasser werden verworfen. Bas Methylenchlorid wird verdampft, und das Amethobottromyoin-imidazolaraid wird in einer Ausbeute von etwa 59 £ isoliert.

Beispiel 23

Herstellung von Methobottromycin-t-butylamid 1,0 g Methobottromyoinmethylester wird in 50 ml Aceton gelöst und mit 50 ml 0_vl N Natriumhydroxyd versetzt und bleibt 2 Stunden lang stehen· Mit Chlorwasserstoffsäure wird der pH-Wert auf 6,2 eingestellt, und die Lösung wird auf das halbe Volumen eingeengt und bleibt zum Abkühlen stehen. Aus dieser Lösung kristallisieren etwa 0,8 g d©r freien Methobottromyoinsäure aus. 80 mg der freien Säure werden in 2 ml Dimethylformamid gelöst und mit 40 mg bi8-2,4-Binitrophenylearbonat versetzt. Bann werden 10 mg Triethylamin zugegeben, und die Mischung bleibt 30 Minuten lang stehen· Dann werden 10 mg t-Butylamin zugegeben, und die Mischung bleibt über Nacht stehen. Biese Mischung wird mit 10 al OSsloroform versetst, mit Wasser und verdünntem Ammoniianhydroxyd gpwasohen* sind die Waeohlösungen werden verworfen. Bas Chloroform wird verdampft, und das Methobottromyoin-t-butylamid wird in einer

Ö09&23/1867 Ausbeute von etwa 50# isoliert.

Die Amidderivate von Araethobottromycin, Methobottromycin und deren Mischungen sind wertvolle, antibakterielle Mittel, die, wie oben hervorgehoben wurde, als Mittel zum Inhibieren des Wachstums verschiedener grammpositiver Organismen wirksam sind. Biese Antibiotika sind jedoch für die Behandlung ohronlsoher Krankheiten der Atmungeorgane von Hühnern und ansteckender Nebenhöhlenentzündung von Truthühnern sehr geeignet. Bei dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß die chronische Erkrankung der Atmungsorgane von Hühnern und die ansteckende Nebenhöhlenentzündung bei Truthühnern durch die erfindungsgamäßen Amidderivate, die entweder suboutan oder oral verabreicht werden können, wirkungsvoll Inhibiert werden Manen. Weiterhin wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Amidderivate die chronische Erkrankung der Atmungsorgane von Hühnern und die ansteckende Nebenhöhlenentzündung bei Truthühnern wirksam bekämpfen, wenn sie in Dosierungen von etwa O₉I bis etwa 250 mg/kg Körpergewicht des Vogels und je nach dem Therapieweg vorzugsweise von 0,5 bis 130 mg/kg; Körpergewicht des Vogels -verate^ reicht werden. Dabei 1st keine Tozicltät zu befürchten

Die im folgenden gegebnen Vrr uohe dienen der VeraneohauMohung der üJcftivität und Vorteile der vorliegenden Erfindung %ül #©"^τ "!©^Μβη&ΜΒ^ v©n Amidß@rivät€ii vtm uwsuieisottromyolE, Methobottromyoin und deren Mischungen als Antibiotika.

0 09823/1867 - 41 -

9714 .

Es versteht sich jedoch, daß die Beispiele nur gas lw©@ke de? Veranechauliohung der Erfindung angeführt wurden, Si© Erf ia· dung jedoch nicht begrenzen sollen.

Me folgenden Beispiele dienen der Verene©he*üLt@huBg' tivität der erfindungsgeBäßen Verbindungen ©1® aat&b&otieehiB Mittel gegen ohronisoh® Erkrankung d@r uii'3 der

B θ 1β y i β 1

3,00

©Mo isQSicc^v^lQs^Q 2&
üon :JcgQ -llsgr

1)ΘΘίΞΐ.€©·δ₀ wmi ü&

BAD ORIGINAL

Durohsohn.Gew. $> Gew. Zunahme. Sterblichkeit ι

Behandlung Zunahme in g bezogen auf nicht Anzahl der totoi

infizierte Vögel Vögel/Geaamt _r zahl der Vögel

nicht infizierte Kontrollvögel 212 - 0/6

infizierte
Kontrollvögel 139 67 10/21

Hethobottromyoln-a@thyl~
amid

25 mg/kg 173 82 0/6

50 mg/kg 208 98 3/6

mg/kg 169 80 0/6

Bei dem oben angegebenen Versuch zeigten die nach dem erfindungegemäßen Verfahren behandelten Vögel eine beträohtliohe Gewichte zunähme gegenüber den infizierten Kontrollvögeln. Außerdem starben von den infizierten Kontrollvögeln U ron 2I₉ d.h. 52£_t während von den naoh dem erfindungegemäßen Verfahren behandelten Vögeln nur 3 von 18, d.h. starben.

- 43 -

BAD OR!Q?NAL

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9714
Beispiel 25

Ativitat von Hethobottromyöin-methYlamid gegen Myoopiasma galllseptloum (PPLO) - Infektionen bei Hühnern (suboutane Verabreichung) .

Drei Gruppen von Hühnern wurden bei diesem Versuch verwendet· Das Methobottromyoln-methylamid wurde als wässrige Suspension mit einem Gehalt von 5 $> Gummi auf dem suboutanen Wege verabreicht· Dosierungen von 0,05, I₉O, 2,0 und 4,6 rag/kg Körpergewicht wurden als Einzeldosis innerhalb einer Stunde nach der Infektion gegeben. Die Vögel wurden infiziert, indem eine konzentrierte Brühe von Myooplaema galllseptloum (PPLO) auf dem Wege über den Intraluftsaok injiziert wurde· Der Versuch wurde 3 Wochen nach der Infektion beendet. Die Ergebnisse wurden aufgrund der Sterblichkeit und der Körpergewiohtssunahme ausgewertet.

Behandlung durohsohnittl. $> Körpergew· Zunahme, Sterblich» Gew.Zunahme bezogen auf nicht kelti Anzahl in Gramm infizierte Vögel der toten

Gesamtzahl

— ___ ', - —~-^ der Vögel

nicht infizierte Kontrollvögel 216 - 0/6

Infizierte Kontrollvögel 107

Hethobottromy«
oitt-methylamid
0,5 mg/kg
I₉O mg/kg
2,0 mg/kg
4,0 '

157	73	0/6
195	89	2/6
196	91	2/6
193	89	©/6
	.0091 ■=» 44 **=	BlAD ORIGINAL
I2371IS7

9714

In dem oben angegebenen Versuch zeigte aioh bei den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Vögeln eine beträohtliohe Körpergewichts zunähme gegenüber den infizierten Eontrollvögeln. Außerdem starben von den infizierten Kontrollvögeln 7 von 18, d.h. 39 ^t während von den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Vögeln nur 4 von 24, d.h. 17 #, starben.

Zur weiteren Veraneohauliohung der antlbiotisohen Aktivität der erfindungsgemftpen .Amldzusammensetzungsn wurden dieselben gegen PPLC-Milcroorganiemen geprüft. Die Ergebnisse der in vltro-Yersuohe (Agardiffusionsmethode) werden durch das folgende Beispiel veranschaulicht, jedoch nicht begrenzt:

Beispiel 26 In vitro-Amidaktlvität

Inhibit long zone: mm Amid 250 y /ml 500 u /ml 1.0 /ml

Benzylamld von · Hethobottromyoin 21 - Anillnamid von Methobottromyoln 27 - -

p-Huoranilinamid von

Methobottromyoln 22 Horphollnamid von Nethobottromycin - - 22 Methyl-ß-phenylalanin-

amid voa M@tfe©bottroBysis «- 19 -

' bottromyeia 21

t% ft fä ik ^ ty i 1 ß ß *7

Methobottromyoin _ΛΕ BAD ORIGINAL

weiteren Ye?eu&@®h&uliefeiang der ®ntibiotisek©a ükttvität

werden to?©fo «ta® folgeade Eöispitl nicht begrenzti

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toe 5 fsg© altes,.. K@iß@n> Legho.i^i-gi&§r©p v?i5^5os über Lufts&@k mit «jäier Kiiltmrferüfe© von My©opl®es^ galliseptioiim infiziert® Y@rs©M©i(sa© #jaii© ier "^©^llegeMem Er findung wurden in wässriger Lf3sussg mmi ®mli®vfäm®m v'^: .·; ·, 18 Stunden nach der Infektion in ISosierungamengem 25 und 50 mg/ke Körpergewloht jeder mdsengruppe Die Tögel wurden beoimohtet, um die Entwicklung der Symptome der ohronisohen Erkrankung der Ätmungsorgan® festsuetellen. folgende Ergebnisse wurden erhaltene Amide Ergebnisse bei Beendigung des

Unbehandelte Kontrollvögel Erkrankung ist augenscheinlich Methylemld Erkr&akuag ist sum Stillstand

Äthanolamid ®ebraofet . .

2_V5-Propandiolamid ^ß

p-Pluoranilinamid ^

Pyrolidinamid ®

BAD ORIGINAL

0 0 9&23/1867

9714

Aus den obenstehenden Vereuohswerten geht klar hervor, daß in Hühnern, die mit Myooplasma galliseptloum Inf liiert waren, die ansteckende, chronische Erkrankung der Atmungsorgane zum Stillstand gebracht wurde, wenn die Hühner mit nur IO mg/kg der erfindungsgemäßen Amide behandelt wurden. Demgegenüber trat bei den unbehandelten Hühnern eine fortgesetzte Infektion mit der chronischen Erkrankung der Atmungsorgane auf.

Beispiel

In vivo-Yersnoh Antibiotikum

Methylamid von Methobottromyoln

Äthanolamid von Methobottromyoin

Propanolamid von Methobottromyoin

Pyrolidinamid von Methobottromyoin

Anilinamld von Methobottromycin

Äthylaraid von

Benayli

fön

Infektions- Veg Organismus —— Dopneumoo I.P.

D.pneumo. I.P.

D.pneumo. I .P.

Staph.aureus I.P. Staph.aureus I.P. Staph.aureus I.P. Staph·aureus I.P. Staph.aureus I.P.

isteaperltoneal

mg tereohnet je Dosis, die

■;■",, Mäuse ssohütaen würden.

^50" mg/Dosis

0,0151

0,0035

0,0051

0,011

0,0567

0,064

0,0571 0,0325

der infizier-

BAD

0098^/1867

Der in vivo-Vereuah, dessen Ergebnisse Torstehenci auf ge» führt sind, wurde in der Weiee durebgefüiirtt- ä®ß die Muse O und 6 Stunden nach der Infektion sine Zwei«:D@8is-Behandlung erhielten· Der.Versuch wurde 7 Tage nach der Infektion abgeschlossen.

BAD ORIGINAL

0 8.123 M 187

Claims (1)

1. F 16 80 027. 4-44 14. Okt. do9

   M 70 593 IVd/12 ρ

   Merok * Co., Is»©* 9714

   so

   Neue Patentansp r ü ehe

   1. MethQb©ttr@myein- und Amethobottromycinamide der allgemeinen Formel _Q

   Il ^

   MC-

   in der M Descarbomethoxymethobottromycin, Desearbomethoxyamethobottroroycin oder deren Mischungen, R und R* Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyalkyl, Aryl oder Alkaryl bedeuten, wobei die Alkylreste 1 bis etwa 12 Kohlenstoffatome enthalten und R und R¹ gleiche oder verschiedene Bedeutung haben können.

   2. Verfahren zu» Herstellen von ^fchebofetromyoin- oder Amethobottromycinamiden gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

   dass man einen Methobottromycin- oder Amethobottromycinester mit einer Aminoverbindung der Formel NHRR* umsetzt, wobei R und R* Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyalkyl, Aryl oder Alkaryl bedeuten.

   . Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Ester einen AüLiqrleater verwendet.

   4. Vertaten, siaoh Amp^mk 1$ dfidisroh gekennzeichnet, dass man als

   BAD ORSGSNAL

   Neue Unterlagen {Art ? § 1 Abs. 2 Nr. I Satt 3 des Änderungaae3. v. 4. 9.1SÖ31

   008823/186"?

   5. Tlerarzneiinittel j gekennzeichnet durch «Inen Gehalt an einer Verbindung gemäss Anspruch 1.

   009823/188?