DE1617307A1 - Diagnostikum fuer den immunelektrophoretischen Nachweis von Gammaglobulinen - Google Patents

Description

DR. PHIL, DR. RER. POL .. - ,

URTKDHLER ^8MDNCHEN2-t c-

PATENTANWALT ' AMALlEKSTRASSE15 | g f

Telephon 284541

Kabi Aktieboläget, Stockholm·

Dia^nostiktim für den immuneiektrophoretischen !Nachweis von &ammaglobulinen_c

Gegenstand öer vorliegenden ..',rfindung ist ein Diagnostikum für den quantitativen, immunelektrophoretisehen Kachv'eis von G-ammgglobulinen und Verfahren zur Herstellung des Diagnostikums sowie Diagnoseverfahren.

Das Diagnostikum gemäss der Erfindung besteht aus von Säugetieren stammenden Anti(human)gammaglobulinen, die durch Blockieren der zugänglichen Aminogruppen modifiziert worden sind. Durch diese Blockierung wird den Globu.linen eine merkbar höhere elektrophoretische Mobilität erteilt, ohne dass die immunologische !Reaktivität nennenswert beeinflusst ist,

vVeiterhin umfasst die Erfindung die Methode zur Erhöhung der elektrophoretischen Mobilität dieser animalischen Änti(human)-gammaglobaline durch das erwähnte Blockieren ihrer zugänglichen Aminogruppen.

Die Erfindung umfasst ebenfalls die Methode zum Nachweis von Gammaglobulinen von Säugetieren durch die Verwendung dieser diagnostischen Angenzien*
BÄDORIGINAL 109813/1563

Der Ausdruck "Gammaglobuline" oder"G-aminaglot>ulin" deckt einen oder mehrere der speziellen Typen von G-ammaglobulinen, die auch als *fk, 0D₁ /g, 0k oder IgA, IgD, IgG und IgM bekannt sind_o (Ig = Immunglobulin)_o

Eine immunelektrophoretische Methode zum quantitativen Nachweis humanen Albumins ist von Carl-Bertil liaurell in Analytical Biochemistry, 15., (1966), 3.45-52,beschrieben worden

Der unterschied der elektrischen Mobilität bei Albumin und bei der G-ammaglobulinfraktion kann in cm/sek per Volt/cm ausgedrückt werden. Bei Untersuchung in Diäthyl—Barbiturat-Puffer in freier Elektrophorese beträgt die Mobilität des Albumins 0,000059 im Vergleich zu 0,000012 itir die Gammaglobulinfraktion.

Die Laurellsche,Methode gründet sich auf den Unterschied in Bezug auf elektrophoretische Mobilität zwischen der schnell wandernden Albuminfraktion von humanem Serum und der Antialbumin enthaltenden Antikörperfraktion von animalischem Antiserum, welche die langsam wandernde Gammaglobalinfraktion ist»

Wird nun einem Tier, z.B. einer Ziege, eine humane Gammaglobulinfraktion eingespritzt, so entstehen in der

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G-ammaglobulinfraktion des betreffenden T i er sei'ums Antikörper -reffen das humane G-ararna globulin. G-amma^lobuline verschiedener Tiere' vioisen die .rl ei ehe elektrophoretisch^ Mobilität auf ο Oa also hier in jiezug auf elektrophoretische Mobilität kein Unterschied vorliegt, lär-st -aich die diagnostische Methode für Albumin von Laurell für eine Analyse des G-ehalts an humanem G-amma^lobulin nicht verwenden«,

Vom klinischen ijeyiehtspunkt £us ist die Lafcoratoriumsdiagnootik pathologischer Veränderungen des G-amma.gl.obu.lins bedeutend wichtiger als ^ er Nachweis, des Albumingehaltes,da Abweichungen von der normalen ^enge G-ammoelobuline mit ernrten Krankheitszustäncen im Zusammenh^nr; steht_o

Die -vorliegende ürfindun^; löst das Problem, G-ammaglobulin von säugetieren nachzuweisen d-adurch, -loss beispielsweise dem Anti(human)gamms^lobulin von Säugetieren grössere elektrophoretische Mobilität erteilt und somit ermöglicht v.^rird, in der elektrophoretischen Mobilität Unterschiede zu. erhalten, ohne dass dadurch die immunologis.che Reaktivität beeinträchtigt würde.

Einem geeigneten 21er, z.B. Meerschweinchen, Ziege, Kaninchen, Ratte oGcr ochaf, v.drd eine Gammaglobulinfraktion humanen oerums - IgA, IgD, IgG- oder IgRI, allein oder a'ls..Mischung irgendderer - eingespritzt. Das Tier entwickelt Antikörper

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gegen die fremde (humane) Proteinfraktion* Unter Beachtung ei ei· Beäinguu, en Tür die Iier etc llung von Antisurum 'vird JJl ut entnommen und für- die Erzeugung des Serums oder der Cramma.elobulinfraktion bearbeitet, die -Antikörper gegen die für die Immunisierung verwendete humane Gammarlobulinfraktion enthält.

Die Methode zur Erhöhung der elektrophoretischen Mobilität der üntigammaglobulinfraktion gemäss der .Erfindung besteht in dem Blockieren von etwa l/5-bis 4/5 der leicht zugänglichen Aminogruppen dieser !Fraktion mit einem aliphatischen Acylierungsmittel, dessen Kette nicht mehr als 10 Kohlenstoffetome enthält und so aufgebaut ist, dass sie bei der Umsetzung mit einer freien Aminogruppe eine üarbo~iyalkylcarbami.3gruppe bildet,

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Als solche Acylierungsmittel kommen aliphatische Äcylierungs— mittel mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, die bei dem Umsetzen mit einer freien Aminogruppe Carboxyalkylcarbamidgruppen ergeben, in Frage« Das Blockieren der leicht zugänglichen freien Aminogruppen der Antigammaglobulinfraktion erfolgt durch Mischen der Antigammaglobulinfraktion mit dem aliphatischen _Acylierungsmittel in Mengenverhältnissen, die die Blockierung der freien Aminogruppen unter den gewählten Reaktionsbedingun^en in ge-■■•ünschtem Umfang ergeben,»

Danach wird die so carboxyalkylacyl-substituierte,veränderte Antigammairlobulinfraktion isolierte

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■■ "üie Reaktion zwischen dem blockierenden Reagens und der Antigammäglobülinfraktion wird mit Vorteil unter alkalischen Bedingungen ausgeführt, z.B. bei einem pH-V/ertvon etwa8 bis 8,5. . ' ■ -- ,;;.^{: :}_ ^: -. .:..'■'■ '■',■ ■■"-.■.'

Die modifizierte Antigammaglobulinfraktion mit blockierten Aminogruppen vilrä zweckmässig durch Dialyse der dialysierbaren Inhaltstoffe des Heaktionsgemisches gegen Salzlösung isoliert, vorzugsweise gegen eine physiologische -Kochsalzlösung«;

Das Bndprodukt kann nach einer bevorzugten Ausfiihrungsform durch G-efriertrocknen von der Heaktionslösunggetrennt

Durch eine derartige chemische Modifikation des Äntiaerums od er d ess en Antigammaglobulinfraktion ändert sich die elektrophoretische Mobilität der Antigammaglobulinfraktion und ergibt Produkte mit erhöhter elektrophoretischer Mobilität im Vergleich zu der unumgesetzten Fraktion, ohne dass die immunulogische Üeaktivität dadurch beeinträchtigt wird*

I¹Ur die Blockierung der freien Aminogruppen können u.a· folgende Acylierungsverbindungen verwendet werden:alle aliphatischen Dicarbonsäuren, deren Kohlenstoffkette nicht mehr als 10 Kohlenstoffatome enthält, wie z.B. Bernsteinsäure, Maleinsäure, ü'umarsäure, GlutarBäure, Adipinsäure,

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Pimelinsäure, Korksäure,Azelainsäure und jebücinsäure.

Durch Umwandlung eines Teils der leicht zugänglichen •Aminogruppen der Antigammaglobulinfraktion in Carboxyalkylcarbamidgruppen erhält die so veränderte Fraktion höher.e elektrophoretische Mobilität, ohne dass dabei die immunologische Reaktivität des Antigammaglobulins beeinträchtigt wird.

Bevorzugt ist die Blockierung der Aminogruppen im Verhältnis 1/5 bis 4/5 der leicht zugänglichen Aminogruppen des Antigammaglobulinsο Damit erreicht man eine Mobilität von 0,00002 bis 0,00008 em/sek per Volt/cm in freier Elektrophorese in einem otandardsystem« Die Mobilitätswerte für die verschiedenen Grade der Aminogruppenblockierung, wie sie sich aus der Gel-Elektrophorese und im Vergleich mit Albumin ergeben,gehen aus der l'abelle im Beispiel 2 hervor.

Die Anzahl nicht blockierter, leicht zugänglicher Aminogruppen lässt sieh nach einer chemischen Blockierungareaktion mit beispielsweise Succinylanhydrid (wie in Beispiel 1) feststellen, und zwar nach der Methode A.F.S.A. Habeebs,Analyticyl Biochemistry, 14,- (1966) ,S.328-336,unter Verwendung von 2_t4,ό-TrinitrobenzoIsulfonsäure·

Die Beispiele zeigen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindungβ _

BAD ORIGINAL

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Beispiel 1.

600 mg- Ziegen-Anti (human) gammaglobulinfraktion warden Umrühren in 30 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst.Der pH-Y/ert ti er Lösung wurde mit Kaliumhydroxydlösung auf 8,2 eingestellt. 5 ml der ursprünglichen Löcung rrurden für vergleichende .ilektrophorese reserviert. I)iε restlichen 25 ml wurden unter Umrühren und Abkühlen im J.sbaö mit 125 mg Suceinylanhydrid versetzt·. Der pH- "ei-t des Heafctionsgemi^ehes wurde mit Ka Ii umh./-Ir oxid lösung dauernd bei 8 gehalten. Nach 2-stündiger Reaktionszeit erfolgte eine 24— stün^ige -^ialv^e gegen physiologische Kochsalzlösung sowie Gefriertrocknen des ileaktionsproduktes.

Das entstehende Succinylderivat öeB Ziegen-Anti(human)gammaglobulins v/urde "bis zu einer Konzentration von 2 ;i in ""asser gelöst.~.ährend einer 2-stüncligen, vergleichenden Elektrophorese wanderte die ursprüngliche iiammaglobulinlosung nicht ,wogegen die succins"!-modifizierte Präparation etwa· 5,5 und Albumin 4,5 cm wanderte. Dieses Bucciny!derivat des Antigonunaglobulins bev/ahrte volle immunologische Reaktivität gegen humanes G-ammaglobülin der für die Immunisierung verwendeten .jt,

Beispiel 2 . '

Eine Probeserie wurde mit Antihumsngammaglobulin ausgeführt, dessen freie Aminogruppen gemäss Beispiel 1 mit ^uccinylanhy-

drid blockiert waren_v Die Proben sollen das Verhältnis zwischen

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der Anzahl blockierter Aminogruppen und der elektrophoreticchen Mobilität sowie der immunologischen Gpezifizität der eich ergebenden, veränderten Antigammaglobuline veranschaulichen.

Folgende i,r^-:ebnirjse wurden mit den hier beschriebenen kathoden erreicht„ ·

ι _Tr _ _Ί , ., . , Elektrophoreti:-che Immunologische ) Menge ouccinylanhycrxd _Mobilität in Agaro- ,ieaktivität des pro ml Anti^ammoglobu-^ _{χ ±} y_erhältni^ veränderten Gamlinloeung (250 nach .eisp_ol _ζα-_ΑΐΐαΜη maglobulins

10 £	—
15 $>	voll
25 #	ti
75 #	tt
135 #	11
175 Io	beeinträchtigt

0,1 mg

0,3 mg

1 mg

5 mg

10 mg

jjurch das Slockieren von 1/5 bis 4/5 der leicht Aminogruppen :er Antigammaglobulinfraktion von immunisierten Tieren erhält die fraktion eine elektrische Mobilität,die die Au'ivertung der Muster mit humanen Gamma lobulinen,-7ie nie untenstehend beschrieben ^ird, ermöglicht., ')er NMch-veis der leicht zugänrlichen Aminogruppen erfol.'t rinch ,.^r zitierten Methode von Habeeb«,

Beispiel 3

10 ml Ziegen-änti(human)gammaglobulin wurden mit 20 ml physiologischem Phosphatpuff er versetzt. Die Lb" tsunir wurde im ^r]isbad abgekühlt, 5 mg/ml Succinylanhydrid wurden unter Umrühren zugegeben,

BAD ORiGiNAL

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Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde mit Kaliumhydroxydlösung dauernd bei 8 gehalten. Fach 1-stündiger Reaktion wurde die Lösung 20 utd. diälvsiert, wonach \ler Rückstand durch Gefriertrocknen gewonnen wurde.

JSine immunelektrophoretisehe Probe mit einer 2}ü-igen 7/asserlÖoung des entstandenen Succiny!-Produktes ergab das Yorhündensein voller immunologischer Reaktivität mit humanem G-ammaglobulin; die erhöhte -eiektrophoretische Mobilität ermöglichte de-n quantitativen Nach" eis von humanem-G-ammaglobulin in^elner un;.ßkannten Probe.

Das Succlnyianhjdrid kann ei ureh eine entsprechende Menge des Anhydrids jeder der underen hier erwähnten zweibasischen Jäuren ersetzt werden· So kann auch jeder dieser Anhydride durch ein anüeres acylierendes .Derivat jeder dieser zweibasi-' sehen Säuren ersetzt'werden,sowie das jeweilige entßprech_en£_e Monoacylhalid in der I/lonoacylc.hloridf orm.

Die zugänglichen freien Aminogruppen, können gleieherweise durch jeweilige Konversion mit jedem einzelnen dieser Monoacylchloride blockiert werden unter den für eine solche Acylierung mit Acy1halid geeigneten Bedingungen um die jeweils entsprechenden Garboxyalkylcarbamidgruppett zu bilden.

Labormethode zur Bestimmung von G-ammoglobulinen von säugetieren

Auf einer G-lasplatte von 120 χ 120 mm wird eine 2 mm dicke o-chicht aus l;,j-iger Agarose oaer Agar gegossen'. Diese A^uroae oder dr?s Agar muss vorher im Diäthyl-Barbituratsäurepiiff er (Ionenstärke O,O7;O,OO2 m Kalziumlaktat; pH = 8,6) gelöst werden. ±>le Methode entspricht dem oben zitierten, von Laurell beschriebenen Verfahren. -.Venn die Agsroseschicht erstarrt ist, wird ein 95 χ 25 mm grosses .,tuck aus eier Mitte herausgenommen, sodass man ein Becken erhält_o

In dieses Becken v.ärd eine 2 mm dicke .Jchicht. aus gepufferter lf/i-iger Agarose oäer Agar, mit Antigammaglobulin mit blockierten Aminogruppen versetzt, gegonsen₀ Nachdem die Schicht erstarrt ist, v/ird eine Iteihe 2 mm grosser Löcher in .abständen von 5-10 mm gestanzt. Diese Löcher sollen die Proben enthaltene Der Abstand vom Beckenrand zur Lochmitte soll etwa. 4 mm be ragen,, Inagesamt finden 12 bis 20 Löcher auf einer Standardplatte Platz, Bei der einen Alternative für die Ausführung des elektrophoretisehen Nachweises wird die Agaroseschicht als Träger verwendet „Bei dieser Ausführung ist ein schnell wanderndes G-ammaglobulin mit blockierten Aminogruppen, dessen Mobilität der des Albumins entspricht, vorzuziehen. Die Platte mit der Agaroseschicht v/ird in einen Elektrophoreseapparat gebracht, wobei die Löcher des Antigammaglobulin enthaltenden. Beckens der Anode zu. liegen sollen (+)-. Die Agaroseschicht wird an den Elektrolyt des betreffenden Elektrodengefässes angeschlossen«

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In j «des der für standard- oo.er Musterproben vorgesehen Löcher v-ird die gleiche üen^e, voi^zu^swc-ise zvtisch'en 4-10 Mikroliter, eines Humangamra^;irlobulin;'tandards öler eines Humanscrumniusterc gegeben:danach "*irH die H-lektrophorii :e -sestartet un^ i<\r 100 Minuten bei einem -pannunr-sf^ll von 10 V/cm, ohne ΚηΙαΙυηΛ", fortgesetzt«

lisch abschluss -Λογ- elektrophorese ^Tverden eventuelle xleste Überfluß si.;·: η löslichen Proteins mit phyriolociccher Kochi-^lzlösunrv aus den LöcheTn entx'ernt. "jie Agurose'iehiebt -ii'd danach 5\etrot:Lcnct und mit einem für i'roteine _:'_::eei_t:"neten /■■·.betoi'f, "ie Zc-ii. ',.TQidosch""i.irz, vzocarmin o; or Ijromophenolblaujein^eiärbto

Von den Löchern in der .Schicht·, ö.ie die verschiedenen Losungen des humanen lammaglobulinstaniards und des unbekannten Probemustei*c von Humanserum enthalten, entwickeln sich in.Qem becken mit dem modifizierten »_tnti.ran;msclobulin Präzipitatspitzeh, üie rieh zu der Anode hin ausbilden«. "

i'ür die aiinere Alt em·.· ti ve "-ird Agar als Orä^-r verwendete Unbehiin'eltes G-amma globulin so'-'ie unbehan-eltes Antigamiaa globulin zeilen in Agar.^eI elektroosmotiaehe Mobilität in der ilichtun^ zur Kithoae«,

Die Verv/enciung eines Antiganime-Tlobulins mit mansi^er Aminop;ruppenblockiex'un;j, elches im'Verhältnis zu Albumin eine

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Mobilität von etwa 15 '/i bis 25 « besitzt, kompensiert die osmotische Mobilität und lässt das Äntigammaglobulin unbeweglich bleiben. Die Löcher für die einzelnen, bestimmten Mengen der verschiedenen Lösungen von Standardgammaglobuiin bzw, ,Probemustern werden ausserhalb deb .antigammablobulin enthaltenden Beckens der Kathode (-) zu gestanzt« Nach uer Elektrophorese entwickeln sich Präzipitatspitzen, wenn die Oammablobuline in das Decken'mit den unbeweglichen, chemisch veränderten Anti«- garame;lobuline 'vuii-.'

Beispiel 4 - Labornachteis von ^arnmaglobullnon von oäu ^ie oten bc£chriebt3ne Metliode "?i?3. für die ]3üF-tintriLmg dee £lobulin;;^rehalteri in HumanHerumnlU'··-tern, die serienm'ireig, doh* im 7erhältnis 1:2, 1:4, 1*3, Ij16 und It52 mit physio» logischer li'ochE-iilzlö&unr verdünnt sind, fjn_c';'ev^randt«

Daß A^a rose becken ^-'ii'd rait 1 ^!,ΐ dee n-.ich ,Seispiel 1 oder 2 e haltenen obemisch modifizierten Zio^eö-Anti(human)^amma^lo» bulins vercetzto ■ .

jy'ur die α^stirrimun;i c!or -'•''robemueter κρ.νΛν.η Jtnndardhumangamma globulinlör.unf:en in den Konzentrationen 0,05; 0,01; 0,2; 0,4 und 0,S/i in die gertunzten Löcher gefüllt»

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Die Längen der jeweilsentwickelten Präzipitatspitzen werden nach 1- bis 2-stüncliger .Elektrophorese gemessene Die Länge der ^pitzen bei den bekannten Mustern werden für die Bestimmung der G-amma/rlobulinmenge in jeder der verschiedenen·Lonun^en von unbekannten Probemustorn benutzt. .

jJeJEipiel 5 - Labordiagnostikmit modifiziertem Ziegen-Antigammaglobulinseruin.

Mach 6er im Beispiel 4 beschriebenen Methode wurde eine Bestimmung des Gammaglobulin.':;ehaltes in einem Humanserummuster ausgeführte

Jas Aü*arbecken 'vurde mit 2 % des chemisch modifizierten Ziegen-Ant'i(human)gämma^iobulinnerums nach Leispiel 3 versetzt.

Die Verdünnungen des jt^ndardgamma-lobulins und/der unbekannten ^rrobernu.^c:ter waren die gleichen wie in Beispiel 4ο .

Drei unbekannte Serummuster wurden untersucht, von denen das eine von einer gesunden Yersuehrjperson, das zweite von einem Patienten mit klinischen Agammaglobulinämieerscheinunf;en und das .dritte von einem Patienten mit verdächtigter, aln rekurrierende Infektionen der oberen Luftwege erscheinende Hypogammaglobulinämie stammte_o

BADORIQINAL

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In dem ersten-Muster v/urden 12 rag/ml, im zweiten 0,1 mg/ml und im dritten 3 mg/ml Gamma globulin fe.-utgeste.llt,wodurch" die klinischen liei'un'je b;.-.jtätigt wurden«,'

DAD-ORiQiNAL

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   Biagnostikum zum quantitativeniramun-elektrophoretischen Nachweis von G-amm&^lobulinen, bestehend aus von Säugetieren stammenden Anti (human) gammaglobulinsn mit glockierten Aminogrut>pen_o

   2. üiagnostikum ^eraäss Anspruch 1, gekennzeichnet-durch Blockierunv· von 1/5 bis 4/5' & er freien bzu'. zugänglichen Aminogruppen des Ursprun.i:s.globuliiiBβ

   3. Diacrno-tikum ^emäss Anspruch 1 oäer ?., ^kennzeichne-1 ■dureh mittels ηliph.-tischen uarbonsäureBesten mit 2 bis e.tv;a 10 Ivohlen^toifatomen im aliphatischen liuSt: blockierten

   Ldagnoi'tikum -"rmäss Anspruch 5_} gekennziiobnot durch mittelf? ijlockierun{j dee ^ornr-teinsäurereotes blockierte i ^r uppen_e

   Iiiai-nortikum öemäss iinspruch 1, 2, 3-öuer 4·, gekennzeich net durch eine erektrophoreti---.:he Hobilim.t von et"a 0,00002 bin etv.'frO,00008 c:a/„>ek. pro 7olt/cm in ;Jiäth/lt. äurepuffer in ein:_r freien alektronhoreRe_o

   ORiQmAL 10 9-8.1:37 1 56 3

   6« Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine humane Gammaglobulin-Fraktion einem Säugetier eingespritzt, dem Tier Antikörper gegen die humane Proteinfraktion enthaltendes Blut abgenommen wird und in der so gewonnenen Antigammaglobulin-Fraktion die leicht zugänglichen Aminogruppen,
   vorzugsweise zu 1/5 bis 4/5 der vorhandenen Gruppen,durch Behandeln mit einem aliphatischen Acylierungsmittel
   blockiert werden, dessen Kette nicht mehr als 10 Kohlenstoff atome enthält, und die in einem Teil der freien Amino-· gruppen durch Carboxyalkylacyl substituierte Antigammaglobulin-Fraktion isoliert wird₀

   '7β Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,dass die Blockierung beim pH-Wert von etwa 8 - 8,5 durchgeführt wird,

   6« Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,dass die Isolierung durch Dialyse gegen Salzlösung, vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung, erfolgt,

   9^ Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,dass das Diagnostikum durch Gefriertrocknung ausgeschieden wird.

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   S17307

   10. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,dass

   , ■ als Auagängsmaterial die ÄntigänmagloMlin--Fraktion eines' Antigammaglobulin-oeruins verwendet wird," ; -

   11. Verfahren zur quantitativen immuno-elektrophoretischen Beotimmung von Säugetier-Uammaglobulinen unter Vergleich von entwickelten ]?ällungsspritzen der Testprobe mit denen eines Standards, dadurch gekennzeichnet, dass das Diagnostikum gemäss Anspruch 1 zu einer Gammaglobulin der Säugetierart, die fiir die Erzeugung der Antigammaglobuline verwendet vmrden, enthaltenden Probe zugesetzt wird und das Elektrophorese-Verfahren der -^bobe gleichzeitig mit dei¹ bestimmter Verdünnungen des Standards gemäss den bekannten Verfahren des immuno-Elektrophorese-Vergleiohs durchgeführt und die Mengen der entwickelten fällungsspritzen quantitativ bis stimmt werden*

   töi§l§;iiei