DE1543967A1 - Stabilisierung waessriger Loesungen von Phosphorsaeureestern bzw. deren Salzen - Google Patents
Stabilisierung waessriger Loesungen von Phosphorsaeureestern bzw. deren SalzenInfo
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Description
25.
Warner-Lambert Pharmaoeutioal Company M»rrie Pia ine JBf. J., USA
Stabilisierung wässriger lösungen von Phosphorsäureastern
deren Salzen
Di· Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Stabilisierung
von bestimmten, in wässriger Lösung befindlichen organischen Phosphorsäureestern bzw. deren Salzen und zwar
speziell von solchen organischen lonoestern der Phosphorsäure Aie
Phenolphthalein-HiOnophosphat, Thymolphthalein-nionophoBphat,
Indoxyl-phosph&t, Phenyl-phosphat, p-Mtrophenyl-phosphat,
X-Iiapbthyl-phoßphat und der^l., sowie zur Stabilisierung der
diese i-ster enthaltenden wässrigen Zusammensetzungen.
Di· Herstellung derartiger Phosphorsäureester, vie beispielsweise
des Phenolphthalein-monophosphats, ist in der deutschen
Patentanmeldung W 33 582 VIb/12qt vom I9. Juli 1965 genau beschrieben.
Die anderen kster können in analoger Weise hergestellt
werden.
Diese luster lassen sioh in der Wels· in ihre zugehörigen Salze
überführen, daß man dl« ironoester mit einer Bas·, wie beispielsweise
einem Amin oder einem Alkalimetallhydroxyd umsetzt,
909886/15 63 "2"
BAD ORIGINAL
wie es in der erwähnten Patentanmeldung beschrieben 1st«
Die dabei erhältlichen Salze können ebenfalls durch das erfindungsgemäSe Verfahren stabilisiert werden· Wässrige
Lösungen der genannten Phosphorsäurererbindungen bzw. deren Salze sind als Substrate für die Konzentrationebestimmung
dts Alkaliphosphatase-Enzy&e in Körperflüsai^keiten, wie beispieleweise in Serum» tebräucblich. Bei der Ausführung der
KonzentrationsbeStimmung des alkalischen Phoephatase-Enzyms
löst man den Phosphorsäureester «der dessen Salz in einer wässrigen Pufferlösung aus Trie-(hydroxyiðylamino)-iuethan
geeigneter Konzentration und bedient eich dieser Lösung als
Substrat für die zu untersuchende Körperflüssigkeit. Die
Ken^e des während der Untersuohun^sdauer in deren Verlauf
die Körperflüssigkeit mit dem Substrat behandelt vird, aus
dem Ester abgespaltenen organischen Bestandteiles ist ein Laß für die enzyniatische Wirksamkeit des Enzyms euf den in
dem Substrat anwesenden organischen Phosphorsäureester und sie ist der Enzymkonzentratlon in der Körperflüssigkeit
direkt proportional. Diese Verhältnisse sind in der ÜSA-Pstentβohrift 2 999 793 näher erläutert. Die dabei auftretende färbtiefe, z.B. durch das in dem alkalischen Medium entstandene freie Phenolphthalein kann &enau gemessen werden·
Derartige Phosphorsäureester» wie beispielsweise das p-iiitrophenyl-phoaphat und das Phenolphthalein-monophosphat sind in
wässriger iötung normalerweise sehr unbeständig und können»
9J388Ö/1583
ßAD
1543S67
wenn sie einige Zeit als Vorratslösung aufgehoben werden,
leioht unter Bildung von freiem p-üitrophenol oder Phenolpht hai ein hydrolysiert -«erden. Da die Untersuchung, mit
der die enzyuietiecne Wirksamkeit oder die Enzy mk ο nz ent ration bestimmt werden aoll, die feststellung des durch das
vorhandene j-nzyw abgespaltenen freien p-.uitrophenol3 oder
Phenolphthaieins erforderlich macht, ist natürlich ein auch
nur irgendwie bemerkbarer »*rad an Hydrolyse unerwünscht.
Jede zusätzliche, infolge einer Hydrolyse vorhandene i'bersohußmetit e würde zu einer unrichtig hohen Gkhültebestimmung
führen.
Das Hauptziel der Erfindung lie^t äen.aufolge in der Schaffung
eines neuartigen Pufferungε-Systems für vHerrige Lb* runden
der organischen Phospnorsäureester und deren Salze, das
zur Stabilisierung dieser Phosphatester und ihrer entsprechenden, in den wässrigen lösungen verwendeten Sal e geeignet ist.
Dae erfindungnoetiäße Ziel lie :t ferner derin, für die wässrigen LüBun. en der genannten Phosphorsäureester oder deren
Salze eine vorteilhaftere Puffersubstanz zu verwenden, die sieh speziell für die Verwendung bei der alKalischen PhosphfrtaseenayuigehultobestiiLniung eignet.
ύβ kount? auii ^efuticen rerden, dnß sich or^.f ninche Phosphor-
- / 1 S 6 3
-4-
säureester und deren Salze, beispielsweise Phenolphthaleinmenophosphat oder p-Hitrophenylphosphat in wässrigen Lösungen unter völliger oder faet völliger Unterdrückung der
Hydrolyse stabilisieren lassen* wenn man darin gewisse neuartige alkalische, nechatehend -enauor beschriebene Puffersubstanzen/ ****■ e-bWereind, in •verhältnismäßig hohen Konzentrationen auflöst.
Als besonders wirkungsvoll für die Stabilisierung von wässrigen Lösungen dieser Phosphorsäureester und deren Salze hat
sich die Verwendung von alkalischen Puffereubstenzen, wie beispielsweise 2-ÄBiine-2-methyl-1-propanol in einer molaren Konzentration von 1-7 unter Aasbildung eines pH-Wertes von
10,2 erwiesen. So findet man beispielsweise nur Spurenmengen, wie etwa 3,9 Gamma,an freiem Phenolphthalein, wenn nan eine
das Phenolphthaleinuionophosphat.dioyclohexylammoniuBsalz in
einer Konzentration von 20 mg/ml enthaltende Lösung mit 2-Amino« 2-methyl-1-propanol als Puffersubstanz in einer 3>6-malaren
Lösungskonzentration und bei einem pH-Wert von 10,2 versetzt
und unter reaktionsbesohleuni^enden Bedingungen, wie beispielsweise bei einer Temperatur von 45°C zehn Taee lang behandelt. Im Vergleich hierzu beobachtet man nach einer 11-tät;icen Behandlung eine Abspaltung von 10,2 dämme an freien
Phenolphthalein, wenn man für die wässrigen Lösungen des genannten Phoopaorsäureesteroalzes das Trie-(hydroxymethylaiitino)-«-ßthan in einer i olarität von 4t2 gelöst als Pufferunßslösung verwendet.
Als eine besonders vorteilhafte alkaliscne Pufferungssubstanz
für dhö erfindurxgBt_e&iä8e Stabllisierungsverfahren kann das
2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol eingesetzt werden.
Der pH-Wert des verwendeten iöu ferun&SBystöibes iat nicht kritisch; man stellt ihn vorzu^sweiBe bei dem für die Aktivität
des alkalischen Phosphatase-£nzyme optimalen Wert ein, d.h.
90 9 8 86/1563
also, man benutzt die wässrige Losung des Phoepnoraäureesters
ale Substrat bei einem pH-Wert von 9,7 bis 10,5.
In der Praxis wird der gewählte Phosphorsäureester in einer
rtwa 0,01-inolaren bis zu 0,1-ciolaren iiösungsetärke in einer
wässrigen ixjsung der gewünschten Puffersubstanz aufgelöst,
wobei die Konzentration der Puff er substanz einer etwa 7i5-molaren
Lösung entsprechen und der pH-«art bei etwa 10,2 liegen
kann· Die zu untersuchende enzymhaltige Substanz, im
allgemeinen eine Körperflüssigkeit wie das Blutserum, wird
hinzugefügt und das dabei entstehende Gemisch wird-mit Wasser
soweit verdünnt, daß eine Lndkouaentratioa entsteht, bei der
die Lösung 0,29-molar an Puffersubstanz ist und etwa 1,56 mg/ml
von dem .bster enthält. las G-emieoh wird etwa 20 Minuten lang
bei einer lemperatur von etwa 27 C ^ehalten. Am Ende dieser
Behandlung wird die Lnzyniwirksamkeit durch Zugabe z.B.einer
0|5 it isiatrlumhydroxydlösung abgestoppt. Die dabei aus der
Abspaltung des or^anisohen Bestandteiles entstehende Färbung
wird duroh eine zweite Zugabe eines Pufferungssyetems bei einem
pH-Wert von über 11 stabilisiert. Die entwickelte und stabilisierte
Färbung wird dannmit einer nachstehend beschriebenen
Standardfarbmusterkarte in Vergleich gesetzt» Diese- Farbmusterkarte
stellt man durch Abmusterung der farbtiefen, bei quantitativ vorbestimmten alkalischen Phoaphatasewerten an
Stelle der in den Untersuchungsteeten erzeugten JParbtiefen
her. Auf diese /.eise ist bei Benutzung einer derartigen genau
9U9886/1563
geeichten Farbmusterkarte eine direkte Konsentrationsablfisung
der alkalischen Phosphatase duroh einen einfachen Farbrergleioh
möglioh.
Zur genaueren Erläuterung des erfindungsgenäfien Verfahrens
dienen die folgenden Beiepielei
Es wurden Lösungen von Phenolphthalein-monophoephat-dioyolohexylaninsals bei drei verschiedenen Konsentrationen in drei
verschiedenen fufferlösungfn hergestellt. Diese Lösungen wurden dann während einer Sauer von 11 Tagen bei einer Temperatur
von 45 C behandelt· Anschließend wurden die Lösungen auf inren
Gehalt an freiem Phenolphthalein untersucht· Xn der naohstehenden Tabelle sind für alle Untersuohungsbedingunjen die pro
10 mg des Phenolphthaleinmonophosphatsalzes abgespaltenen
Mengen an freiem Phenolphthalein angeführt· Alle Puffer» lösungen wurden bei einem pH-Wert von 10,2 gehalten!
909386/1563 "
BAD ORIGINAL
.j^ für das
Phenol pht hai β in-i<*o no pho s pha t
| MelarltMt | 20 mg/m!}. | 10 m«/»l | 3.1 |
k
5 m«/ml |
||
| Pufferiubetane | 7.2 |
Menge an freiem
bei Beendigung < Behandlung |
5.8 |
Phenolphthaiein
äer 11-tägiisen |
4.6 Gantma | |
|
2-Amint- 2-iue t hy 1*
1-propaneI |
3.6 | 2· 5 liaiuma | 7.2 | uamma | 9.0 Gamma | |
|
2-Amin*-2-methyl-
1-prepanol |
1.8 | 3.9 Gamma | 4.2 | ufamaa | 4.1 Gamma | |
|
2-Amin#-2-methyl-
1-propanel |
7.0
(.gesättigt) |
6.0 Gamma | 7.5 | Gamma | f.Ö Gamma | |
|
2-Amine-2-methy 1-
1,3-propandiol |
3.5 | 5.3 uraiuma | 11.8 | Gaiuna | 17.0 Gamma | |
|
2-Amint-2-methyl-
1»3-propaadiel |
1.75 | 5.5 Gamma | ?amma | |||
|
2-Amin»-2-taet hy 1-
1»3-propandi·! |
3.0 Gercine | JBILIÜH | ||||
amino}-methan (^esättigt)
(jy amino;»methan
2.1
Irii-(hydroxyu.etayl 1.05
amino)-methan
12.7 jamma 17.3 Gamma 25.9 Gamma
13.0 Gamma 20.1 Gemn.a 57.0 Gamma
Ee ergibt aioh aus dieser Tabelle, daß das 2-A&iino-2-methyl-1-propanol und dap 2-Amino-2-n:ethyl-1f3-propsndiol au erorcentlich wirksame Stabilieatoren für die Phenolphthrleinincnop! oephatealie
eind.
563
-8-
BAD ORlGJNAt
Unter Benut^un^ von 2-iiSLino-2-methyl-1-propandiol ale Puffersubstona bei eineu ρΗ-ΐ/ert von 10,2 und bei vier verschiedenen Konzentrationen dieser Puffersubstanz wurdet* Lösungen
von Pbenolphthalein-iuonophoephat-dioyolohexylaminsalz in
vier verschiedenen Konzentrationen hergestellt. ler in diesem üeispiel untersuchte Konzentrationsbereich der Puffer-Bubetanzen ^eht biß auf daß 25-fache, während er in Beispiel
1 nur auf das 4-fache ^eht. Die hergestellten Lösungen wurden 7 T&t« leng bei 450C ^ehalten und dann in der vorbeschriebenen Weise auf freies Phenolphthalein untersucht. Der pro
10 h.i·, an vorharideneiu ^henolphthalsinmonophosphätealz gefundene
Jaaiui&^eaGlt an freiem Phenolphthalein wird in der nachstehenden
labelle angeführt ι
| 39 m^/ml | 7.8 bä/bI | 3.9 mg/ml | 1.7 | 1.56 mfi/Ml | |
|
Polarität der
Pufferung |
Gefundenes | freie« Phenolphthalein in | 6.0 | Gemme-Werten | |
| 7.20 | 2.9 | 1.7 | 10.2 | 2.9 | |
| 1.44 | 4.9 | 5.2 | 13.0 | 10.9 | |
| 0.72 | 5.6 | 7.3 | ' 16.2 | ||
| 0.29 | 6.2 | 9.8 | 21.0 | ||
| Beispiel 3 |
in wurden in einer 0,72-molaren Läsung von 2-Amino-2-&tthyl-1-propanol
S . rf i? «i S / 1 5 6 3
-9-BAD ORIGINAL
einem zwisohen 9#7 - 11 »15 liegenden pK-.'/ert, wie a« in
der unten stehenden Tabelle angeführt iat, Lösungen von Phtnopthaleinmontphoephat-dicyclohexylaiainsalis
in einer Konzentration von 7»8 m^/ml hergestellt} dieee Lösungen wurden 8 Ta4Jt
lung boi einer Temperatur von 450O behandelt und anschließend
auf uen i'reien .Phenolphthaleinüehalt untersucht. Baa pro
10 mg vorhandenem PhenolphtiluleiniBonophosphatealz gefundene
freie Phenolphthalein ist in der nachfolgenden Tabelle angeführt
ι
| pH-//ert der Pufferlösung |
gefundene
Jamma-Werte |
| 11.15 | 5.1 |
| 10.67 | 5.8 |
| 10.46 | 5.6 |
| 10.24 | 6.0 |
| 10.08 | 5.3 |
| 9.74 | 5.6 |
Die gefundenen .Ergebnisse zeilen, daß der ρΙΙ-7/ert nieht von
kritischer Bedeutung ist»
Jüs versteht aioh, daß die vorstehende „.enaue Beeohreibung
nur zur Erläuterung dient und daß es müglich iat, im nahmen
der iirfindun^ viele Abwandlunoen durchzuführen.
-10-
8AD ORIGINAL
Claims (4)
- Patentansprüche1, St&bili£ieruno wässriger lösungen TQn Phosphorsäureestern bzw. deren Salaen, dadurch gekennzeichnet, daß man der Lösung einen *ninoalkohol ale Puffer* substanz zusetst.
- 2. Stabilieierun^sverfahren üemäß Anspruch 1, dadurch g e -kennzeichnet , daß man als fhosphoreäureeeterealz das LicycloJaexylamijioniuii-phenolphthaleineonophoephat einsetzt.
- 3· Stabilisierun^everfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß aan als Puffersubstanz 2-Amino-2-Biethyl-1-propanol in einer Konzentration einsetzt, die zwieohen einer 1-molaren und einer 7»2-molaren Lösung liegt.
- 4. Stabilisierun^sverfahren gemäß Anepruoh 1 oder 2, dadurch &ei.ennaeiohnet , daß «an als Pufferoubstana 2-Amiao-2-methyl-1,3-propandiol in einer Konzentration einsetzt, die zwischen einer 1-molaren und einer 7-Rolaren Lösung liegt·909886/1563 BAD 0RIQ,NAL
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47796265A | 1965-08-06 | 1965-08-06 | |
| US47796265 | 1965-08-06 | ||
| DEW0041220 | 1966-03-25 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| DE1543967B2 DE1543967B2 (de) | 1972-11-09 |
| DE1543967C DE1543967C (de) | 1973-05-30 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0359138A2 (de) * | 1988-09-12 | 1990-03-21 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Stabilisierung und Verringerung der Hintergrund-Fluoreszenz von Hydroxy-cumarin-ester Enzymsubstraten |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0359138A2 (de) * | 1988-09-12 | 1990-03-21 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Stabilisierung und Verringerung der Hintergrund-Fluoreszenz von Hydroxy-cumarin-ester Enzymsubstraten |
| EP0359138A3 (de) * | 1988-09-12 | 1991-10-23 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Stabilisierung und Verringerung der Hintergrund-Fluoreszenz von Hydroxy-cumarin-ester Enzymsubstraten |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE1543967B2 (de) | 1972-11-09 |
| US3466306A (en) | 1969-09-09 |
| GB1087003A (en) | 1967-10-11 |
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