DE1543967B2 - Reagenz zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase - Google Patents
Reagenz zur Bestimmung der alkalischen PhosphataseInfo
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Description
testen erzeugten Farbtiefen her. Auf diese Weise ist bei Benutzung einer derartigen genau geeichten Farbmusterkarte
eine direkte Konzentrationsablösung der alkalischen Phosphatase durch einen einfachen Farbvergleich
möglich.
Zur genaueren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienen die folgenden Beispiele.
Es wurden Lösungen von Phenolphthalein-monophosphat-dicyclohexylaminsalz
bei drei verschiedenen Konzentrationen in drei verschiedenen Pufferlösungen hergestellt. Diese Lösungen wurden dann während
einer Dauer von 11 Tagen bei einer Temperatur von 45° C behandelt. Anschließend wurden die Lösungen
auf ihren Gehalt an freiem Phenolphthalin untersucht. In der nachstehenden Tabelle sind für alle Untersuchungsbedingungen
die pro 10 mg des Phenolphthaleinmonophosphatsalzes abgespaltenen Mengen an freiem Phenolphthalein angeführt. Alle Pufferlösungen
wurden bei einem pH-Wert von 10,2 gehalten.
Puffersubstanz Molarität
Ausgangskonzentration für das Phenolphthalein-Monophosphat
20 mg/ml
10 mg/ml
5 mg/ml
Menge an freiem Phenolphthalein
bei Beendigung der lltägigen Behandlung
(Gamma)
2-Amino-2-methyl-l-propanol
2-Amino-2-methyl-l-propanol
2-Amino-2-methyl-l-propanol
2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol .,
2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol ..
2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol .
Tris-(hydroxymethylamino)-methan
2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol .
Tris-(hydroxymethylamino)-methan
Tris-(hydroxymethylamino)-methan
Tris-(hydroxymethylamino)-methan
Tris-(hydroxymethylamino)-methan
| 7,2 | 2,5 |
| 3,6 | 3,9 |
| 1,8 | 6,0 |
| 7,0 | 5,3 |
| (gesättigt) | |
| 3,5 | 5,5 |
| 1,75 | 8,0 |
| 4,2 | 10,2 |
| (gesättigt) | I |
| 2,1 | 12,7 |
| 1,05 | 13,0 |
3,1 5,8 7,2 4,2
7,5 11,8 10,7
17,3 20,1
4,8 9,0 4,1
■ 8,0 17,0 11,9
25,9 37,0
Es ergibt sich aus dieser Tabelle, daß das 2-Amino-2-methyl-l-propanol und das 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol
außerordentlich wirksame Stabilisatoren für die Phenolphthaleinmonophosphatsalze sind.
B ei sp i e1 2
Unter Benutzung von 2-Amino-2-methyl-l-propandiol als Puffersubstanz bei einem pH-Wert von 10,2
und bei vier verschiedenen Konzentrationen dieser Puffersubstanz wurden Lösungen von Phenolphthaleinmonophosphat-dicyclohexyläminsalz
in vier verschiedenen Konzentrationen hergestellt. Der in diesem Beispiel untersuchte Konzentrationsbereich der Puffersubstanzen
geht bis auf das 25fache, während er im Beispiel 1 nur auf das 4fache geht. Die hergestellten
Lösungen wurden 7 Tage lang bei 45 0C gehalten und dann in der vorbeschriebenen Weise auf freies Phenolphthalein
untersucht. Der pro 10 mg an vorhandenem Phenolphthaleinmonophosphatsalz gefundene Gammagehalt
an freiem Phenolphthalein wird in der nachstehenden Tabelle angeführt.
| Ausgangskonzentrationen für das | 39 mg/ml | 7,8 mg/ml | 3,9mg/ml | I,56mg/m1 | 2,9 | 1,7 | 1,7 | 2,9 | |
| Phenolphthaleinphosphat | Gefundenes freies | Phenolphthalein | 4,9 | 5,2 | 6,0 | 10,9 | |||
| Molarität der Pufferung |
in Gamma-Werten | 5,6 | 7,3 | 10,2 | 16,2 | ||||
| 8,2 | 9,8 | 13,0 | 21,0 | ||||||
| 7,20 | |||||||||
| 1,44 | |||||||||
| 0,72 | |||||||||
| 0,29 |
Es wurden in einer 0,72molaren Lösung von 2-Amino-2-methyl-l-propanol bei einem zwischen
9,7 bis 11,15 liegenden pH-Wert, wie es in der unten stehenden Tabelle angeführt ist, Lösungen von
Phenophthaleinmonophosphat-dicyclohexylaminsalzin einer Konzentration von 7,8 mg/ml hergestellt; diese
Lösungen wurden 8 Tage lang bei einer Temperatur von 45 0C behandelt und anschließend auf den freien
Phenolphthaleingehalt untersucht. Das pro 10 mg vorhandenem Phenolphthaleinmonophosphatsalz gefundene
freie Phenolphthalein ist in der nachfolgenden
Tabelle angeführt.
| pH-Wert der Pufferlösung |
Gefundene Gamma- Werte |
| 11,15 10,67 10,46 10,24 10,08 9,74 |
5,1 5,8 5,6 6,0 5,3 5,6 |
Die gefundenen Ergebnisse zeigen, daß der pH-Wert nicht von kritischer Bedeutung ist.
Claims (2)
1. Reagenz zur Bestimmung der alkalischen infolge einer Hydrolyse vorhandene Überschuß-Phosphatase,
bestehend aus einer 0,01- bis 0,lmo- 5 menge würde zu einer unrichtig hohen Gehaltslaren Lösung eines Monoesters der Phosphorsäure, bestimmung führen.
wie Phenylphosphat, p-Nitrophenylphosphat, Phe- Der Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, ein
nolphthaleinmonophosphat, Thymolphthalein- Reagenz zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase
monophosphat, Indoxylphosphat oder a-Naphthyl- zu schaffen, das ohne Gefahr einer Hydrolyse der
phosphat oder deren Salze und einer den Ester io darin als Substrat enthaltenen organischen Phosphorstabilisierenden
Puffersubstanz mit einem pH-Wert säureester und deren Salze über längere Zeit hinweg
im alkalischen Bereich, dadurch gekenn- gelagert werden kann, d. h. stabil bleibt,
zeichnet, daß die den Ester stabilisierende Der Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß Puffersubstanz ein 2-Amino-2-methyl-l-propanol sich die gestellte Aufgabe bei Verwendung eines aus und/oder 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol in 1- 15 bestimmten Aminoalkoholen in hoher Konzentration bis 7,2molarer Konzentration ist. bestehenden Puffersystems lösen läßt.
zeichnet, daß die den Ester stabilisierende Der Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß Puffersubstanz ein 2-Amino-2-methyl-l-propanol sich die gestellte Aufgabe bei Verwendung eines aus und/oder 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol in 1- 15 bestimmten Aminoalkoholen in hoher Konzentration bis 7,2molarer Konzentration ist. bestehenden Puffersystems lösen läßt.
2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Diese Aufgabe wird bei einem Reagenz der eingangs
zeichnet, daß das Phenolphthaleinmonophosphat in geschilderten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst,
Form dessen Dicyclohexylammoniumsalzes vor- daß die den Ester stabilisierende Puffersubstanz ein
liegt. 20 2-Amino-2-methyl-l-propanol und/oder 2-Amino-
2-methyl-l,3-propandiol in 1- bis 7,2molarer Konzen-
tration ist.
Die stabilisierende Wirkung der erfindungsgemäß als Puffer verwendeten Aminoalkohole ist so stark,
Die Erfindung betrifft ein Reagenz zur Bestimmung 25 daß man beispielsweise bei lOtägiger Lagerung einer
der alkalischen Phosphatase, bestehend aus einer Lösung mit 20 mg/ml Phenolphthalein-monophosphat-0,01-
bis 0,lmolaren Lösung eines Monoesters der dicyclohexylammoniumsalz und 2-Amino-2-methyl-Phosphorsäure,
wie Phenylphosphat, p-Nitrophenyl- 1-propanol als Puffersubstanz in 3,6-molarer Konzenphosphat,
Phenolphthaleinmonophosphat, Thymol- tration bei einem pH-Wert von 10,2 nur Spurenmengen,
phthaleinmonophosphat, Indoxylphosphat oder 30 wie etwa 3,9 Gamma, an freiem Phenolphthalein
«-Naphthylphosphat oder deren Salze und einer den findet. Im Vergleich hierzu beobachtet man nach
Ester stabilisierenden Puffersubstanz mit einem pH- lltägiger Lagerung eine Abspaltung von 10,2 Gamma
Wert im alkalischen Bereich. an freiem Phenolphthalein, wenn man für die wäßrigen
Es ist bereits bekannt, beispielsweise aus der Lösungen des genannten Phosphorsäureestersalzes das
Zeitschrift »Milchwissenschaft«, H. 8 (August 1952), 35 Tris-(hydroxymethylamino)-methan in einer Molarität
S. 274/275, und H. 9 (September 1952) S. 301 bis 307, von 4,2, gelöst als Pufferungslösung, verwendet,
der USA.-Patentschrift 2 999 793 sowie H. S t e 11 e r, Der pH-Wert des verwendeten Puffersystems ist
»Enzymatische Analyse« 1951, S. 182/183, Verlag nicht kritisch; man stellt ihn vorzugsweise auf den
Chemie, Weinheim/Bergstraße, alkalisch gepufferte für die Aktivität des alkalischen Phosphatase-Enzyms
Phosphorsäureester, wie Phenylphosphat, Phenol- 4° optimalen Wert ein, d. h. also, man benutzt die wäßrige
phthaleinphosphat und p-Nitrophenylphosphat, als Lösung des Phosphorsäureesters als Substrat bei
Substrat zur Phosphatasebestimmung zu verwenden. einem pH-Wert von 9,7 bis 10,5.
Bei der Durchführung der Konzentrationsbestimmung In der Praxis wird der gewählte Phosphorsäureester
Bei der Durchführung der Konzentrationsbestimmung In der Praxis wird der gewählte Phosphorsäureester
der alkalischen Phosphatase bedient man sich einer in in einer etwa 0,01molaren bis zu 0,lmolaren Lösungsgeeigneter
Weise gepufferten wäßrigen Phosphor- 45 stärke in einer wäßrigen Lösung der gewünschten
Säureesterlösung als Substrat für die zu untersuchende Puffersubstanz aufgelöst, wobei die Konzentration
Körperflüssigkeit. Die Menge des während der Unter- der Puffersubstanz einer etwa 7,5molaren Lösung
suchungsdauer, in deren Verlauf die Körperflüssigkeit entsprechen und der pH-Wert bei etwa 10,2 liegen
mit dem Substrat behandelt wird, aus dem Ester kann. Die zu untersuchende enzymhaltige Substanz,
abgespaltenen organischen Bestandteiles ist ein Maß 5° im allgemeinen eine Körperflüssigkeit wie das Blutfür
die enzymatische Wirksamkeit des Enzyms auf den serum, wird hinzugefügt, und das dabei entstehende
in dem Substrat anwesenden organischen Phosphor- Gemisch wird mit Wasser so weit verdünnt, daß eine
säureester und zur Enzymkonzentration in der Körper- Endkonzentration entsteht, bei der die Lösung
flüssigkeit direkt proportional. Die dabei auftretende 0,29molar an Puffersubstanz ist und etwa 1,56 mg/ml
Farbtiefe, z. B. durch das in dem alkalischen Medium 55 von dem Ester enthält. Das Gemisch wird etwa
entstandene freie Phenolphthalein, kann genau ge- 20 Minuten lang bei einer Temperatur von etwa 27° C
messen werden. gehalten. Am Ende dieser Behandlung wird die
Die bei den bekannten Bestimmungsverfahren Enzymwirksamkeit durch Zugabe z. B. einer 0,5 N
verwendeten Phosphorsäureester, beispielsweise das Natriumhydroxydlösung abgestoppt. Die dabei aus
p-Nitrophenylphosphat und das Phenolphthalein- 60 der Abspaltung des organischen Bestandteiles entmonophosphat,
sind in wäßriger Lösung in der Regel stehende Färbung wird durch eine zweite Zugabe
sehr unbeständig und können, wenn sie einige Zeit eines Pufferungssystems bei einem pH-Wert von über
als Vorratslösung aufbewahrt werden, leicht unter 11 stabilisiert. Die entwickelte und stabilisierte Fär-Bildung
von freiem p-Nitrophenol oder Phenolphtha- bung wird dann mit einer nachstehend beschriebenen
lein hydrolysieren. Da die Untersuchung, mit der die 65 Standardfarbmusterkarte in Vergleich gesetzt. Diese
enzymatische Wirksamkeit oder die Enzymkonzen- Farbmusterkarte stellt man durch Abmusterung der
tration bestimmt werden soll, die Feststellung des Farbtiefen bei quantitativ vorbestimmten alkalischen
durch das vorhandene Enzym abgespaltenen freien Phosphatasewerten an Stelle der in den Untersuchungs-
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|---|---|---|---|
| US47796265A | 1965-08-06 | 1965-08-06 | |
| US47796265 | 1965-08-06 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE1543967A1 (de) | 1970-02-05 |
| US3466306A (en) | 1969-09-09 |
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| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
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