DE1543716C3 - Verfahren zur Gewinnung von Asparaginsäure oder Glutaminsäure - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Asparaginsäure oder Glutaminsäure aus ihren bei mikrobiellen Herstellungsverfahren anfallenden Fermentationslösungen mit Hilfe von Ionenaustauschern.

Bei einem bekannten Verfahren (DT-AS 1088975) wird eine auf einen pH-Wert von 3,2 bis 7 eingestellte, Glutaminsäure enthaltende Lösung über ein stark saures Kationenaustauscherharz in der Η-Form, die sich dabei ergebende Glutaminsäurefraktion über ein Anionenaustauscherharz in der OH-Form und die sich dabei ergebende Glutaminsäurefraktion über ein schwach basisches Anionenaustauscherharz in der OH-Form geleitet. Alternativ kann eine auf einen pH-Wert unter 3,2 eingestellte, Glutaminsäure enthaltende Lösung zunächst über das Anionenaustauscherharz und die sich dabei ergebende Glutaminsäurefraktion über das stark saure Kationenaustauscherharz geleitet werden. Nachteilig ist hierbei die Verwendung mehrerer verschiedener Austauscherharze sowie die im Zuge einer kontinuierlichen Verfahrensdurchführung wiederholt erforderliche Regeneration dieser Ionenaustauscherharze. Bei einem anderen bekannten, ähnlich arbeitenden Verfahren (DT-AS 1250445; Chemical Abstracts, 55 (1961) Referat 5879c über JA-PS 7461/60) wird die auf einen pH-Wert unter 3,2 eingestellte, Glutaminsäure enthaltende Lösung lediglich über ein einziges Austauscherharz, und zwar ein stark saures Kationenaustauscherharz in der Η-Form geleitet und die Glutaminsäurefraktion aufgefangen. Auch hier stört, daß das Austauscherharz zyklisch mit Salzsäure oder Schwefelsäure regeneriert werden muß.

Bei einem weiteren bekannten Verfahren (GB-PS 947797) wird die die Glutaminsäure enthaltende Lösung unmittelbar, d.h. ohne pH-Wert-Einstellung, über ein einziges, in Strömungsrichtung der Lösung gesehen zunächst schwach saures und anschließend stark saures Kationenaustauscherharz in der H-Form geleitet und die am Austauscherharz adsorbierte Glutaminsäure anschließend eluiert. Für eine weitere Adsorption und Eiuierung von Glutaminsäure muß auch hier das Austauscherharz zuvor mit viel Mineralsäure regeneriert werden. Nachteilig ist weiterhin, daß die Glutaminsäurekonzentration der Ausgangslösung nicht zu hoch liegen darf, weil die Adsorptionsfähigkeit des fraglichen Kationenaustauscherharzes mit zunehmender Glutaminsäurekonzentration der durchgeleiteten Ausgangslösung nach Durchlaufen eines Maximalwertes bis auf Null abnimmt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, anzugeben, wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure mit ei-. ίο nem einzigen Austauscherharz gewonnen werden kann, ohne daß das Austauscherharz ständig regeneriert werden muß.

Die Erfindung besteht darin, daß man eine auf einen pH-Wert von 0,5 bis 3 eingestellte, Asparaginsäure oder Glutaminsäure enthaltende Lösung über ein in der Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalzform vorliegendes Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp leitet, gegebenenfalls das mit der Aminosäure beladene Kationenaustauscherharz mit Wasser wäscht und sodann in üblicher Weise mit einer verdünnten wäßrigen Alkalilösung eluiert.

Die Erfindung nutzt hierbei die überraschende Tatsache, daß ein in der Salzform vorliegendes Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp im Gegensatz zu ' einem entsprechenden, in der Η-Form vorliegenden Kationenaustauscherharz bei höheren Aminosäurekonzentrationen keinen Abfall, sondern ein weiteres Ansteigen der Adsorptionsfähigkeit zeigt, wenn der pH-Wert der Ausgangslösung zwischen 0,5 und 3 liegt, und nach einer Eiuierung der Aminosäure mit Alkalilösung sofort, d.h. ohne Regenerierung für eine weitere Asparaginsäure oder Glutaminsäureadsorption wieder zur Verfügung steht.

Gegenüber den aus DT-AS 1088975, DT-PSl250445 bzw. Chemical Abstracts (I.e.) bekannten Verfahren besteht der durch die vorliegende Lehre erreichte technische Fortschritt darin, daß zur Gewinnung der Asparaginsäure bzw. Glutaminsäure nur ein einziges, nicht zu regenerierendes Austauscherharz erforderlich ist. Gegenüber dem Verfahren gemäß GB-PS 947797 werden folgende Vorteile erreicht: Das vorliegende Verfahren ist schneller durchführbar, weil die pH-Wert-Einstellung der Ausgangslösung weniger Zeit in Anspruch nimmt als die Regeneration des Austauscherharzes; das Verfahren ist billiger, weil zur pH-Wert-Einstellung der Ausgangslösung erheblich weniger Mineralsäure benötigt wird als für die Regeneration des Austauscherharzes; die Aminosäureausbeute wird von 95,5 auf 99,1% gesteigert.

Ein besonderer Nutzen des erfindungsgemäßen ( Verfahrens ist in der Gewinnung der Asparaginsäure oder Glutaminsäure aus darüberstehender Fermentationslösung zu sehen. Die Asparaginsäure oder Glutaminsäure enthaltende Lösung kann bis zu einem entsprechenden pH-Wert (zur Adsorption der Aminosäure auf dem Kationenaustauscherharz) mit Hilfe einer Mineralsäure, z.B. Schwefelsäure oder Salzsäure, angesäuert werden.

Das Kationenaustauscherharz kann z.B. in der Kaliumsalzform in der Adsorptionsstufe angewendet werden, vorzugsweise wird es aber in der Natriumoder Ammoniumsalzform verwendet. Mischungen dieser Formen können auch benutzt werden. Die Eiuierung wird vorzugsweise mit verdünntem wäßrigen Ammoniak ausgeführt. Es ist üblich, die Kolonne zwischen Adsorptions- und Eluierungsstufe zu waschen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinu-

ierlich oder zyklisch angewendet werden. Fig. 2 zeigt das in Form eines Diagrammes, in welchem eine punktierte Linie die Reihenfolge der bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vom Austauscherharz durchlaufenen Stufen verdeutlicht. Die Lösung, welche Asparaginsäure oder Glutaminsäure bei einem entsprechenden pH-Wert nicht über 3 enthält, wird mit dem Kationenaustauscherharz vom SuI-fonsäuretyp in der Salzform zusammengebracht, wobei die Aminosäure auf dem Harz adsorbiert wird; danach wird die Aminosäure mit einer verdünnten alkalischen Lösung eluiert und aus dem Eluat isoliert. Das Harz liegt jetzt wieder in der Salzform vor und ist so für einen weiteren Adsorptionsvorgang bereit; jedoch ist es im allgemeinen erwünscht, das Harz vor der nächsten Adsorptionsstufe mit Wasser zu waschen. Das in Fig. 2 dargestellte Verfahren wird im folgenden als Salztyp-Zyklus bezeichnet.

Die Menge der auf dem Harz adsorbierten Aminosäure hängt vom pH-Wert der Aminosäurelösung ab. So zeigt die in Versuch I ermittelte Fig. 3 die adsorbierte Menge an Glutaminsäure in Gramm pro Liter eines handelsüblichen Kationenaustauscherharzes

J vom Sulfonsäuretyp als Funktion des pH-Wertes der Glutaminsäurelösung. Dabei ist zu beobachten, daß bei einem pH-Wert über 3 eine sehr geringe Adsorption stattfindet, und daß die Adsorption bei einem pH zwischen 2 und 0,5 am stärksten ist. Bei einem pH unter 0,5 ist die Wasserstoffionenkonzentration so hoch, daß die Adsorptionsfähigkeit des Harzes vermindert wird.

Fig. 1 erläutert eine als H-Typ-Zyklus bezeichnete, bekannte Methode zur Gewinnung von Asparaginsäure oder Glutaminsäure. Eine Lösung, welche Asparaginsäure oder Glutaminsäure enthält, wird mit einem Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp in der Η-Form zusammengebracht, wobei die Aminosäure auf dem Harz adsorbiert wird. Anschließend wird die Aminosäure mit einer verdünnten alkalischen Lösung eluiert und die Aminosäure kann aus dem Eluat isoliert werden. Das Harz, das nun in der Salzform vorliegt, wird erneut in die Säureform mit Hilfe einer verdünnten Mineralsäure übergeführt und kann dann wieder zur Adsorption verwendet werden.

« In Versuch (II) wird der Salztyp-Zyklus gemäß der Erfindung mit dem vorher in Vorschlag gebrachten H-Typ-Zyklus verglichen. Versuch (III) erläutert die Einsparung an Mineralsäure beim erfindungsgemäßen Salztyp-Zyklus. - ■■·■- — ,::„,;

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Natriumglutamat-Lösungen werden mit Schwefelsäure und Wasser auf verschiedene pH-Werte, aber die gleiche Konzentration von 35 mg/ml Glutaminsäure verdünnt. Dann schickt man 60 g jeder Lösung durch eine Kolonne, die mit 20 ml eines handelsüblichen Kationenaustauscherharzes vom Sulfonsäurety in der Natriumform beladen ist. Das Harz wird dann mit Wasser gewaschen; danach werden die Glutaminsäuremengen im Waschwasser und Ablauf bestimmt. Die adsorbierte Glutaminsäuremenge in Abhängigkeit vom pH-Wert ist in Fig. 3 dargestellt. Aus Fig. 3 ist zu ersehen, daß Glutaminsäure aus einer Lösung mit einem pH-Wert von über 3 kaum adsorbiert werden kann, während die adsorbierte Menge an Glutaminsäure steigt, wenn man den pH-Wert insbesondere auf 2 erniedrigt.

Versuch '(II)

Eine glutaminsäurehaltige Fermentationslösung, die einen pH-Wert von etwa 7 und eine Glutamin-Säurekonzentration von 28,2 mg/ml hat, wird mit 2N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 1,5 eingestellt und dann durch eine Kolonne mit einem Durchmesser von 6 cm gegeben, welche 1 1 eines handelsüblichen Kationenaustauscherharzes vom Sulfonsäuretyp in

ίο der Ammoniumform enthielt. Die Menge an adsorbierter Glutaminsäure in Gramm pro Liter Austauscherharz in Abhängigkeit von der Menge der Fermentationslösung in Liter pro Liter Austauscherharz ist in Kurve B der Fig. 4 dargestellt.

Zum Vergleich wurde die Kolonnenfüllung mit wäßrigem Ammoniak eluiert, gewaschen und mit 1,2 1 einer 2N Schwefelsäure regeneriert, um ein Austauscherharz vom Η-Typ zu erhalten. Durch dieses wurde eine glutaminsäurehaltige Fermentationslösung (pH 7, Glutaminsäurekonzentration 28,2 mg/ ml) geschickt. Diese Versuchsdurchführung ergibt Kurve A der Fig. 4. Wie in Fig. 4 gezeigt, kann die letztere Behandlung sogar eine Eluierung der bereits adsorbierten Glutaminsäure verursachen, wenn eine gewisse kritische Menge der Lösung behandelt ist, wahrscheinlich weil andere Kationen (z.B. Ammonium-, Natrium- oder Kaliumionen), die in der Lösung vorhanden sind, sich beteiligen können und Glutaminsäureionen ersetzen, welche eine geringere selektive Adsorptionsfähigkeit haben als die genannten Kationen. Daher kann die Glutaminsäure im Ablauf auftreten. Andererseits ist beobachtet worden, daß die Menge an adsorbierter Glutaminsäure sogar noch erhöht werden kann, insbesondere wenn mehr als das doppelte Volumen der Lösung beim pH-Wert 1,5 mit einer gegebenen Harzmenge in der Salzform behandelt wird, verglichen mit jenem Volumen an Lösung, das durch dieselbe Menge an Harz in der H-Form behandelt worden ist. Das kommt daher, daß die Glutaminsäure im wesentlichen als Kation vorliegt, wenn die Lösung einen pH-Wert von nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 2, aufweist, und daß bei Glutaminsäurekationen die selektive Adsorptionsfähigkeit erhöht ist und diese daher im wesentlichen ausschließlich durch das Kationenaustauscherharz adsorbiert werden. -^:-^;. :·..-.·

_; ^Versuch (III), ,

An Hand der Fig. 4 soll die gegenüber dem H-Typ-Zyklus erreichte Ersparnis an Schwefelsäure beim erfindungsgemäßen Salztyp-Zyklus ermittelt • werden.'. . ■■- ■;'■■■-■■'■...■v.iv. .· .... ' . ,-■^; ·.::. "ν··-;,ν τ·· -Ein Liter Harz (Salzform) erfordert 1,2 Liter 2N

Schwefelsäure (2,4 VaI) zum Regenerieren. Da das Harz nunmehr im H-Typ-Zyklus ist, kann es maximal 60 g/I Glutaminsäure (wie durch Kurve A in Fig. 4 gezeigt) adsorbieren; insgesamt sind 40 VaI Schwefelsäure zur Regenerierung, bezogen auf jedes Kilogrammadsorbierter Glutaminsäure, erforderlich. Andererseits zeigt die Kurve B in Fig. 4, daß 60 g Glutaminsäure durch 11 Harz aus 2,5 1 Fermentationslösung beim pH-Wert 1,5 adsorbiert wurden; 1,152 VaI Schwefelsäure waren notwendig, die Fermentationslösung anzusäuern. Das bedeutet, daß 19,2 VaI Schwefelsäure erforderlich sind zur Ansäuerung eines solchen Volumens an Fermentationslösung, das ausreichend ist, um 1 kg adsorbierte Glutaminsäure zu ergeben. Somit war das Verhältnis von Schwefel-

säure, die erforderlich ist, um Fermentationslösung für den Salztyp-Zyklus anzusäuern zu Schwefelsäure, die erforderlich ist, Harz im H-Typ-Zyklus zu regenerieren etwa 1:2.

. .. Die Glutaminsäure wird mit einer geeigneten verdünnten alkalischen Lösung (z.B. wäßrigem Ammoniak) eluiert. Als Ergebnis kann das Harz im Salztyp ohne zusätzliche Behandlung erhalten werden. Die Menge an verdünnter alkalischer Lösung, die erforderlich ist, die adsorbierte Glutaminsäure zu eluieren, ist eigentlich dieselbe, ob der H-Typ-Zyklus oder der Salztyp-Zyklus angewendet wird. Andererseits ist es möglich die erforderliche Menge an Mineralsäure wesentlich zu reduzieren, wenn der Salztyp-Zyklus angewendet wird.

Jede Salzform des Sulfonsäureharzes, welche nach der Adsorption mit einem verdünnten alkalischen Lösungsmittel eluiert wird, kann mit Vorteil als Harz vom Salztyp verwendet werden. Es ist jedoch vorzuziehen, das Harz vor der nächsten Adsorptionsstufe mit Wasser zu waschen; so kann jede übliche Regenerationsstufe ausgelassen werden. Das Weglassen der Regenerationsstufe und das Herabsetzen der Mineralsäuremenge, die im Salztyp-Zyklus erforderlich ist, bedeutet, daß Asparaginsäure oder Glutaminsäure im allgemeinen mit reduzierten Kosten, verbesserter Produktivität und Einsparung von Zeit erhalten werden kann.

Das Kationenaustauscherharz kann nach wiederholten Adsorptionszyklen vom einfachen Salztyp zum gemischten Salztyp umgewandelt werden, da ein Gemisch von Salzen, z.B. des Ammoniums, Kaliums, Natriums und Magnesiums, das in der Fermentationslösung vorhanden ist, infolge der aufeinanderfolgenden Zyklen auf das Harz aufgebracht worden sein kann. Jedoch fand man, daß solche Harze vom gemischten Salztyp in bezug auf ihr Adsorptionsvermögen für Glutaminsäure sich wenig von einem Harz des einfachen Salztyps unterscheiden, so daß beide, sowohl Harze vom einfachen als auch vom gemischten Salztyp, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ohne irgendeinen praktischen Unterschied verwendet werden können.

Harze vom Η-Typ haben den Nachteil, daß die Glutaminsäure, nachdem sie durch das Harz adsorbiert worden ist, von dem Harz verdrängt werden kann, wenn ein Überschuß an Glutaminsäure enthaltender Lösung mit dem Harz behandelt wird. Austauscherharze vom Salztyp können größere Mengen an Glutaminsäure adsorbieren, als es dieselbe Menge . an Harzen von Η-Typ kann. Wenn ein Harz vom Salztyp verwendet wird, ist es vorzuziehen, mehr als zwei in Serie geschaltete Kolonnen zu verwenden, wobei jeder Verlust an Glutaminsäure aus der letzten Kolonne verhindert werden kann. Um die Menge an Glutaminsäure, die durch jede Harzkolonne behandelt wird, zu erhöhen, ist es vorteilhaft, die Harzkolonnen in solcher Weise anzuordnen, daß die Glutaminsäuremenge, die durch die erste Kolonne adsorbiert wird, anfänglich steigt, daß die erste Kolonne dann durch eine geeignete verdünnte alkalische Lösung zur. Gewinnung der Glutaminsäure eluiert wird, während eine andere Kolonne nach der EIuierung mit der letzten Stufe der Kolonnen in Serie geschaltet wird.

Es ist weiter beobachtet worden, daß ein Harz vom Salztyp, das zur Gewinnung von Asparaginsäure aus Fermentationslösung mit Vorteil verwendet werden kann, eigentlich dasselbe erzielt wie ein bei der Gewinnung von Glutaminsäure eingesetztes Harz. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1

Ein Liter eines handelsüblichen Kationenaustauscherharzes vom Sulfonsäuretyp in der Ammoniumform wufde in eine Kolonne von 6 cm Durchmesser gefüllt. Inzwischen wurde eine glutaminsäurehaltige Fermentationslösung, die durch Züchten von Micrococcus glutamicus auf einem Nährmedium erhalten worden war, mit Wasser und Schwefelsäure verdünnt, um ihren pH-Wert auf 1,5 einzustellen. Dann ließ man 3 1 der überstehenden Lösung, die durch Zentrifugieren erhalten worden war, und eine Glutaminsäure-Konzentration von 34,5 mg/ml hatte, mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 2 Liter pro Liter Harz und Stunde durch die Kolonne laufen und wusch anschließend die Kolonne zwecks Erhalt eines Ablaufs mit 2 1 Wasser. Die Konzentration an Glutaminsäure in 5 1 Ablauf lag bei 2,8 mg/ml.

Somit wurden 89,5 g Glutaminsäure durch 1 1 Harz adsorbiert. Man erhielt die Kolonne bei einer Temperatur von nicht weniger als 40° C und behandelte sie mit 1,2N wäßrigem Ammoniak, um 1,2 1 Eluat zu erhalten, welches Glutaminsäure einer Konzentration von 71,9 mg/ml enthielt.

Die eluierte Harzkolonne wurde dann gründlich mit Wasser gewaschen. Sofort danach schickte man 3 1 einer ähnlichen Glutaminsäure-Fermentationslösung durch die Kolonne. Es wurde gefunden (nach der oben beschriebenen Methode), daß 89,0 g Glutaminsäure durch 1 1 Harz adsorbiert waren.

Nach Eluierungder Glutaminsäure mit 1,2 N wäßrigem Ammoniak wurde das Harz mehrere Male in der oben beschriebenen Weise wiederverwendet, dabei wurden 88,2; 88,8 und 88,4 g Glutaminsäure im 3., 4. und 5. Durchlauf adsorbiert.

Beispiel 2

Ein Liter eines handelsüblichen Austauscherharzes vom Sulfonsäuretyp in der Ammoniumform wurde in eine Kolonne von 6 cm Durchmesser gefüllt. Inzwischen wurde eine asparaginsäurehaltige Fermentationslösung, die aus Micrococcus glutamicus und Ammoniumfumarat als Nährmedium erhalten worden war, verdünnt und in ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben auf einen pH-Wert von 1,2 angesäuert. Dann schickte man 3 1 der überstehenden Lösung, die man durch Zentrifugieren erhalten hatte und die eine Konzentration an Asparaginsäure von 38,2 mg/ml besaß, durch die Kolonne; anschließend wusch man die Kolonne in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben. Im Ablauf betrug die Konzentration an Asparaginsäure 2,6 mg/ml. Es wurde berechnet, daß 101,6 g Asparaginsäure durch 1 1 Harz adsorbiert wurden. Die Kolonne wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt. Man erhielt 1,2 1 Eluat, welches Asparaginsäure in einer Konzentration von 84,0

mg/ml enthielt. ·...··

Die Kolonne wurde dann in gleicher Weise wie in Beispiel 1 wiederverwendet und adsorbierte 102,1 g Asparaginsäure pro Liter Harz.

Beispiel 3

Man füllte 1 1 eines handelsüblichen Harzes vom Sulfonsäuretyp in der Ammoniumform in zwei in Serie geschaltete Kolonnen von 6 cm Durchmesser. Beim

ersten Versuch ließ man 3 1 einer durch Kultivierung von Micrococcus glutamicus erhaltenen glutaminsäurehaltigen Fermentationslösung, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten worden war (Glutaminsäurekonzentration 34,5 mg/ml; pH = 1,5), durch die erste und dann durch die zweite Kolonne laufen. Sofort danach schickte man nacheinander durch die Kolonne 2 1 Wasser und entfernte dann die erste Kolonne aus dem System.

Beim zweiten Versuch wurde die ursprüngliche zweite Kolonne als erste Kolonne verwendet, und eine andere in oben beschriebener Weise beschickte Kolonne wurde an diese erste Kolonne in Serie als zweite Kolonne angehängt. Dann ließ man 3 1 glutamin-

säurehaltige Fermentationslösung und 21 Wasser diese beiden Kolonnen in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, passieren.

In beiden Versuchen wurde kaum ein Austreten von Glutaminsäure aus der letzten Stufe beobachtet. Die erste Kolonne aus dem ersten Versuch und die erste und zweite Kolonne aus dem zweiten Versuch hielt man auf einer Temperatur von über 40° C und dann eluierte man mit 1,2 N wäßrigem Ammoniak,

ίο um 1,2 1 der jeweiligen glutaminsäurehaltigen Eluatproben zu erhalten. Die Analyse der entsprechenden Proben zeigte, daß die Mengen an gewonnener Glutaminsäure 86,5, 98,4 und 20,3 g betrugen (Glutaminsäure-Ausbeute 99,1%, Reinheit 98%).

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

609 539/470

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von Asparaginsäure oder Glutaminsäure aus ihren bei mikrobiellen Herstellungsverfahren anfallenden Fermentationslösungen mit Hilfe von Ionenaustauschern, dadurch gekennzeichnet, daß man eine auf einen pH-Wert von 0,5 bis 3 eingestellte, Asparaginsäure oder Glutaminsäure enthaltende Lösung über ein in der Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalzform vorliegendes Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp leitet, gegebenenfalls das mit der Aminosäure beladene Kationenaustauscherharz mit Wasser wäscht und sodann in üblicher Weise mit einer verdünnten wäßrigen Alkalilösung eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Eluieren mit wäßrigem Ammoniak durchführt.