DE1517751A1

DE1517751A1 - Verfahren zum Stabilisieren von waessrigen Lysozymloesungen

Info

Publication number: DE1517751A1
Application number: DE19661517751
Authority: DE
Inventors: Yoshio Hidaka; Yoshitaka Matsuoka; Kenji Nakano
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1965-07-08
Filing date: 1966-06-30
Publication date: 1970-01-29
Also published as: GB1092985A; ES328692A1; DE1517751C3; NL6609346A; BE683757A; DE1517751B2

Description

Verfahren zum Stabilisieren von wässrigen Lysoaymlösungen

Pur diese Anmeldung wird die Priorität vom 8* Juli 1965 aus der japanischen Patentanmeldung Kr. 40 586/1965 in Anspruch genommen.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Stabilisieren, d.h, zum V.e:chindern der Bildung von flockigen Lysozymniederschlagen in wässrigen Lösungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der wässrigen Lösung ein in Wasser diepergierbares' oder lösliches nieht-ionogenes oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration von mehr als 0,0005 g/100 ml zugesetzt wird.

Lysozyra ist ein kationisches Protein, das als bakteriolytisches Ήχιζγτα in Eiweiss gefunden wurde. Es hydrolysiert die

909885/1299

Bad

β-(1-4-)-Bindung von Mucopolyeaocharid und Muoopeptid. Ee wird auch als Muramidase bezeichnet.

Dieses Enzym ist nicht nur im Eiweiss, sondern auch in menschlichen und tierischen Körperfltissigkeiten, Geweben und Organen weitverbreitet·. Wenn Lysozym oral oder parenteral verabfolgt wird, besitzt es einen weiten Bereich von pharoakologisohen Wirkungen, z.B. Antiödemwirkung und entzUndungsheamende Wirkung, Wirkung gegen Viren, blutstillende Wirkung und eine normalisierende Wirkung auf die Damflora. Daher findet es ' weitverbreitete Anwendung für therapeutische Zwecke.

Bs war jedoch schwierig, wässrige Präparate von Lyaoeym oder seinen Salzen herzustellen, weil das Enzym in wässriger Lösung beim Filtrieren oder S ο hut te In eine Oberflächendenaturierung erleidet und das denaturierte Lysozym ausfällt und inaktiv wird.

In der Erwägung, dass die durch eine solche Denaturierung verursachte Bildung eines flockigen Niederschlages durch Änderung des physikalischen Zustandeθ der Oberfläche der wäserlgen Lysozymlösung verhindert werden könnte, wurden Methoden untersucht, um die Bildung eines flockigen Niederschlages infolge von Oberfläohendenaturierung des Lysozyms in wässriger Lösung zu verhindern. Wenn wässrige lysozymlösungen hergestellt wurden, zu denen -verschiedene oberflächenaktive Mittel in verschiedenen KousseiHNationen zugesetzt wurden, und wenn dann das Auemasθ der Bildung eine» flockigen Niederschlages bein Schütteln der wässrigen LynoiäymXiisungen (mittels einer Iwafci-Bahüt-

0 H i i

telsaeohlne) beobachtet wurde, stellte eich heraus, dose flioh

die Bildung von denaturierte» lysosyaniedersohlag vermeiden läset, wenn man der wässrigen Lyeoaymlöeung eine sehr geringe Menge eines nioht-ionogenen oberfläohenaktiTen Mittels eusetet.

Durch ZusatB verechiedener oberflächenaktiver Mittel in verschiedenen Konzentrationen bu einer wässrigen LyeoBymlttenmg der nachstehend angegebenen Grundauearaenseteung wurden Testlusungen hergestellt. 10 öl einer jeden Testlösung wurden in eine 20 al-Aapulle eingefüllt, und die Ampullen wurden augesohaolsen und 24 Stunden 36Oaal je Minute alt einer Hublänge Ton 5 ob geschüttelt, worauf die Bildung von flockigen liedersohlägen in jeder Ampulle beobachtet wurde· Die Ergebnisse finden sloh In Tabelle I.

Grundguaamaense t Bung Xysozyaohlorid Borbit

Me thylparaben Propylparaben

Mit destilllertea Wasser aufgefüllt auf

2,SO Gewlohteteile 5,00 " " 0,13 " " 0,02 " "

100,00 Eau«teile.

90988 5/1299

	t«tolle I	HLB**	Konten-
	Zugesetstes oberflä chenaktives Mittel	-	tration des ober fl Aohen- aktiven Mittels, g/100 al
euch Ir.	(die tn ELejsaern stehenden Sshlen geben die Ansahl der Polyoxyäthylen- einheiten ie Mole kül «η)	10,8
1	keine·	15,2	0,1
2	Polyoxyäthylen-(10)- stearat	17,4	0,1
3	Polyoxyttthxlen-(25)- stearat	17,9	0,1
4	Polyoxyäthylen-(40)- •tearmt	19,1	0,1
5	Poljoiyäthylen-i45)-	9,2	0,1
6	Polyoxytthylen-(55)-	12,3	0,1
7	Pol7OXjäthylen-(20)- Äther von hydrier tes Rioinueöl	14,1	0,1
8	PolyoiyÄthylen-(40)- Äther ron hydrier te« RioinuäBl	14,1	1.0
9	Polyoryäthylen-(60)- Äther Ton hydrier ten Rioinueöl	14,1	0,5
10	RNN	14,1	0,25
11	»wn	14,1	0,1
12	N N Ν	14,1	0,05
13	η μ ν	14,1	0,005
14	W Ν II	4 - 1299	0,0005
15	M tt H
	909885/

Bildung «ine· flockigen liedersohlages naoh dea Schütteln

1517731

	Tabelle I	(Vortsetsune)	Konzen tration des ober flächen aktiven Mittels, g/100 al	Bildinig eines flockigen MIe- dersohlages naeh den Schütteln
Ver- suoh Ir»	Zugesetztes oberflä chenaktives Mittel (die in Klaamern stehenden Zahlen geben die Anaahl der Polyoiyäthylen- einheiten je Mole kül an)	HLB**	0,1
16	Polyoxyäthylen~{80)- äther von hydrier tem Ricinusöl		0,1
17	Polyoxyäthylen-(10O)- äther von hydrier ten Rioinusöl		0,1
18	Polyoxyäthylen- sorbitannonooleat	15,0	0,1	+
19	Polyoxyäthylen- sorbitantrioleat	11,0	0,1
20	Natriunlaurylsulfat		0,1	*
21	Benaäthoniuachlorid

22 Polyozyäthylen-Anl8>-

gerungsprodukt an ein Kondensationeprodukt aus Honylphenol und formaldehyd

23 Polyglyoerin-laurin-

saureester

13,2 16,0

0.1 0,1

+++ Ss bildet eich sofort eine grosee Menge liederschlag.

-Hh Haoh dem Sohtttteln bildet eich eine grosee Menge Hlederschlag.

+ Da das oberflächenaktive Mittel nioht vollständig In Lösung geht und die Lösung trüb let, let die Bildung des LysoBymniedersohlagee schwer «u beobachten.

- Niederschlag nloht beobachtet.

* Niederschlag nioht beobachtet, Lösung wird jedoch trüb. ·* HLB ist das Hydrophil-Llpophil-ßleiohgevioht des oberflä-

909885/1299

chenaktiven Mittels; vgl. W₀C. Griffin, J,Soo.Coem.Chem., Band 1, 1949, Seite 311, und Band 5, 1954, Seite 1.

Ein anionisohes oberflächenaktives Mittel, nämlloh Natriumlaurylaulfat, bildet mit dem Lysozya eine unlusliohe Komplexverbindung. Ein kationisches oberflächenaktives Mittel, nämlich Benzäthoniunohlorid, ist zwar wirksam, führt jedooh zur Bildung einer trüben Lösung und besitzt daher kaum pharmazeutisehen Vert.

Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrene können alle nioht-ionogenen oberflächenaktiven Mittel, die in Wasser dispergierbar oder löslioh sind und HLB-Werte von 10 oder mehr aufweisen, in Konzentrationen oberhalb der oben angegebenen Mindestkonzentration angewandt werden.

Beispiele für erflndungsgemäes verwendbare nioht-ionogene oberflächenaktive Mittel sind Alkyl- oder Alkylaryl-polyoxyäthylenäther, wie Polyoxyäthylen-(25)-lauryläther und Polyoxyäthylen-(20)-nonylphenoläther, Polyoxyäthylen~Fe ttsäureeeter, wie Polyoxyäthylen-(25)-stearat» Polyoxyäthylen-Sorbitan-Pettsäureester, wie Polyoxyäthylen-sorbitanmonooleat, Anlagerungsprodukte von Polyoxyäthylen an Kondensationsprodukte aus Alkylphenolen und Formaldehyd, wie das Anlagerungsprodukt von Polyoxyäthylen an ein Konden»ationsprodukt aus Nonylphenol und Formaldehyd, Polyoxyäthylen-Allylamine, wie Ν,Ν-Dipolyoxyäthylen-(20)-laurylamin, Polyoxyäthylen-Alkylamide, wie N,H-Dipolyoxy~ äthylen-(20)-laurylemid, Blookpolymerisate aus Polyoxyäthylen

909885/1299

und Polyoxypropylen, Polyoxyäthylenäther von hydrierten Rioinusöl, wie der Polyoxyäthylen-(60)-äther von hydrierten Rioinueöl, Polyglyoerin-Pettsäureester, wie Polyglycerin-Laurineäureester (HLB 16)« Unter den oben angegebenen Versuohsbedingungen war das nioht-ionogene oberflächenaktive Mittel In einer Konzentration von 0,0005 g/100 nl eur Verhinderung der Bildung einee Niederaohlages von denaturierten Lysosyn in wässriger Lösung nicht wirksan; jedoch'kann bei einer Konzentration von 0,0005 g/100 nl bereite eine Wirkung erwartet werden· Saher soll die Konzentration des nioht-lonogenen oberfläohenakti- " Ten Mittels nehr als 0,0005 g/100 nl betragen, und daher sind nioht-ionogene oberflächenaktive Mittel in Konzentrationen von nehr ale 0,005 und weniger als 1,0 g/100 nl für die praktische Verwendung geeignet.

Die Erfindung wird angewandt, um wässrige Lösungen von Lysosyn und bsw. oder Salzen desselben nit einer gegebenen Konsentration, praktisch alt einer Konsentration von weniger als 10 g/100 ml, herzustellen, feiner wurde der Einfluss von niohtionogenen oberixeLuhenaktiven Mitteln auf die Aktivität des i Lysosyns untersucht· Hierbei wurde gefunden, dass das Lysozyn nicht inaktiviert wurde, wenn verschiedene nioht-ionogene oberfläohenakti ve Mittel in verschiedenen Fonzentrationsstufen zwisohen 0,001 und 10,0 g/100 nl su wässrigen Lösungen sugesetst wurden, die 2,5 g Lysosyn auf 100 nl Lösung enthielten. Sie ensynatlsche Aktivität des Lysosyns wurde durch Messung seiner bakteriolytisohen Wirkung auf Mioronooous lysodeiktious ATCX3 4696 nach der turbldinetrischen Methode beetinnt.

- 7 9098Θ5/1299

BelBPiel 1 Lysosyaohlorid Sorbit

Polyoxyäthylen-(60)-äther Ton hydriertes Rioinuaöl

Methylparaben Propylparaben

KLt destillierten Wasser aufgefüllt auf

2,5 Gewiohtsteile 5,0 ■ ·

0,005 " " 0,13 " * · 0,02 " "

100,00 Baustelle.

Bine wässrige Lb* sung der obigen Zusamensetsung wird unter aseptisohen Bedingungen duroh Bakterien surttokhaltende filter filtriert» Sine sterile 2 al-Aspulle wird alt 2 al dieser Lusung besohlokt und sugesohaolsen. Sie LOsung eignet eioh sur iatraauskulären Injektion·

Beispiel 2

lysosyflohlorid Sorbit

Polyoxyathrlen-eorbitannonooleat

Methylparaben Propylparaben

Mit destUliertea Wasser aufgefüllt auf

2,5 Oewiohteteile 5,0 ■ ·

0,1

0,13

0,02 « «

100,00 Rauatelle.

Bine wässrige Lusung der obigen Zusaaaensetiung wird unter aseptisohen Bedingungen duroh Bakterien nirUokhaltende filter filtriert· Bine sterile 2 al-Aapulle wird alt 2 al dieser Lusung besohiokt und Bugesohaolsen. Die LOeung eignet sieh sur Intraauskuliren Injektion.

- 0 909885/1299

Beispiel 3	Lysosyn	2,5 öewlohteteile
Sorbit	5,0 "
Polyoxyäthylen~( 4-0)-β tears t	0,1 " "
Methylparaben	0,15 " "
Propylparaben	0,02 · ·
Mit destillierten Wasser aufgefüllt auf	100,00 Raunteile.

Bine wässrige Löeung der obigen Zusamenseteung wird unter aseptlsohen Bedingungen duroh Bakterien surüokhaltende Filter filtriert. Bine sterile 2 nl-Anpulle wird mit 2 ml dieser Lösung beschickt und Bugesohnolsen. Sie Lösung eignet sich hut intramuskulären Injektion.

BeiSDiel 4	Lysosya	1,5 Gewiohtstelle
Glucose	5,0 · »
Polyoiyäthylen-(40)-äther von hydrierten Rioinueöl	0,25 " "
Me thylparaben •	0,15 " ⁿ
Fropylparaben	0,02 " "

Kit destillierte» Wasser aufgefüllt auf

100,00 Haueteile.

Bine Lösung der obigen ZusaanensetBung wird unter aseptischen Bedingungen duroh Bakterien zurückhaltende Filter filtriert. Sine sterile 5 al-Aapulle wird mit 5 nl dieses Präparates besohlokt und sugesohnolsen.

909885/1299

Claims

HorrLur, , .^r,, „,.!„(j:.

Eieai Co·, Ltd*

Patentansprüche

1α Verfahren'zum Stabilisieren von wässrigen Lösungen von Lyeozyn und bzw. oder Baissen desselben, daduroh gekennzeiohnet, dass zu dor wässrigen Lösung ein in Wasser dispergierbares oder lösliches nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration von mehr als 3,0005 g/100 ml zugesetzt wird.

2· Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als nioht-ionogenee oberflächenaktives Mittel ein Polyoxyäthylenderivat verwendet wird.

3* Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel ein Fettsäureester von Polyglycerin verwendet wird.

SAD ORiUtHAL
909885/ 1 299