DE1470310A1

DE1470310A1 - Verfahren zur Herstellung von Histidylphenylalanylarginyltryptophan

Info

Publication number: DE1470310A1
Application number: DE1964S0094850
Authority: DE
Inventors: Ken Inoue; Hideo Otsuka
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1963-12-27
Filing date: 1964-12-28
Publication date: 1969-06-12
Also published as: GB1037168A; FR4293M; FR1442330A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung vnn Histidylphenylalanylarginyltryptophan mit guter physiologischer Wirksamkeit.

Es ist bekannt, daß die physiologische Wirksamkeit eines Iielanocyt-stimulierenden Hormons (MSH) auf dem Vorliegen der Histidylphenylalanylarginyltryptophylglycin-Sequenz (His-Plie-Arg-Try-Gly) beruht (Hofmann et al.: Recent Progress in Hormone Research, 18 (1962), Seite 41» Pickering et al.: Biochim.Biophys. Acta, 62 (1962), S. 475.) In der Tat ist die Melanocyt-stimulierende Wirksamkeit von L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin und L-histidyl-

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D-phenylalanyl-1-arginyl-L-tryptophyl-glycin bereits erwiesen (Hofmann et al.: J-.Am.Chem.Soc., 80 (1958), S. 6458j Schnabel et al.: J.im.Chem.Soc., 82 (i960), S. 4576). Unbekannt ist bisher jedoch die Rolle des Glycinrestes in der oben erwähnten Sequenz und es ist noch nicht bekannt, ob dieser liest für diese Wirksamkeit von Bedeutung ist. Es wurde nun erkannt, daß das neu hergestellte Cetrapeptid Histidylphenylalanylarginyltryptophan, den gleichen Wert bezüglich der Helanocyt-stiinulierenden hormalen Wirksamkeit besitzt wie die bekannten Pentapeptiäe.

Gegenstand der Erfindung ist somit die Herstellung eines neuen Peptids mit Melanocyt-stimulierender hormonaler Wirksamkeit. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Schaffung eines Peptids mit einer geringst möglichen Anzahl an Aminosäuren, die die Melanocyt-stimulierende Wirksamkeit noch aufweist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein bevorzugtes Herstellungsverfahren des neuen Peptids.

Nach der Erfindung wird das Histidylphenylalanylarginyltryptophan durch Kondensation einer Ilistidinverbindung der lOrmel:

Ii GH

T-R

H*

H₂ (I)

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in der P eine geschütze Aminogruppe, Q eine Carboxylgruppe oder eine reaktiv funktionell von Carboxyl herrührende Gruppe und E ein Wasserstoffatom oder eine schützende Iminogruppe ist, mit einer Phenylalanylarginyltryptophan-Verbihdung der lOxmel:

HIT=C-InI-R¹

Γ2

H₂IiOHGO-HNOHOO-HNOH-Q'

(II)

in der Q' eine Carboxyl-Gruppe oder eine geschützte Carboxy1-Gruppe und E¹ ein Wasserstoffatom oder eine schützende Amino-Gruppe ist, und Abspalten der schützenden Gruppe (n) in dem erhaltenen Kondensationsproduki zur Erhaltung der ursprünglichen Gruppe (η), hergestellt.

In der formel (i) kann die mit P "bezeichnete geschützte Aminogruppe sum Beispiel sein: Carbobenzoxyamino (-ITH-CO-O-OH₂-G₆H₅), ^rJritylamino (-ITII-C(C₆H₅)^), Tosylamino (-HH-SOg-OgIl^-ΟΙϊ,-ρ), l'oramylamino (-HH-CHO) oder t-Butyloxycarhonylamino (-IiIi-CO-O-U(CH-)^). Beispiele für die mit Q "bezeichnete :.?unlctionelle von Carbo--::yl herrührende Gruppe sind Chlorcar"bonyl (-Oc-(Jl), Aziäocarbo;iyl (-CO-IT-), Isobutylcarbo-

BAD ORIGINAL

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ρττ

nyloxycarbonyl (-GO-O-OO-GHp-GH „„3), p-ITitrophenyloxycarbo-

GH,,'

nyl C-GO-O-O^H.-iro„-p), Eyanomethyioxycarbonyl (-CO-O-CH₉-GlT) und dergl. Die mit '&. "bezeichnete schützende Iminogruppe kann z.B. sein: Carbobenzoxy (-GO-O-GH₂-G₆H₅), Benzyl (-CH₂-C₆H₅) oäer Trityl (-C(C₆H₅)^). Die mit Q» in der Formel (II) "bezeichnete geschützte Carboxylgruppe kann sein: Methoxycarbonyl (-GO-O-CH₃), Äthoxycarbonyl (-CO-O-C₂H₅), t-Butyloxycarbonyl (-OO-O-OCOH-)-), Benzyloxycarbonyl (-CO-O-CH₂-G₆H₅), p-NitrotienzyloxycarbQnyl (-GO-O-CH₂-C₆H₄-IiO₂-P) oder dergl. Beispiele für die mit IV "bezeichnete Amino schützende Gruppe sind Tosyl (-SO₂-C₆H₄-CH₃-P) und iiitro (-HO₂).

Gemäß der Erfindung werden zunächst die Histidin-Vertiinäung

(I) und die Phenylalanylarginyltryptophan-Verbindung (II) der Kondensation unterworfen. Die Kondensation kann auf an sich "bekannte Weise durchgeführt werden. So kann die Histidin-YerMndung (I) mit der Phenylalanylarginyltryptophan-Verbindung

(II) in einem inerten organischen Lösungsmittel (zum Beispiel Dichlormethan, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Äthylacetat, Diäthylphosphit) "bei einer Temperatur von 0 bis 30 G, wenn notwendig, in Gegenwart eines Kondensationsmittels wie z.B. Dicyclohexylcarbodimid (C^-H. ,-Ii=C=K-CcH..), Carbonyldiimidazol ( H-GO-H I)

oder Tetraäthylpyrophosphit ((H₅C₂O)₂=P-O-P=(OC₂H₅)₂) behandelt werden.

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Das erhaltene Kondensationsprodukt wird dann einer Behandlung zur Abspaltung der schützenden Gruppe bzw. der schützenden Gruppen zur !Beisetzung der ursprünglichen Gruppe bzw. der ursprünglichen Gruppen unterworfen. Diese Abspaltung bzw. Freisetzung kann ebenfalls nach bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispiele für solche Abspaltungsbehandlungen sind die Behandlung mit Bromwasserstoff in Essigsäure, die katalytische Reduktion, die Behandlung mit Trifkioressigsäure, die Behandlung mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak oder Hydrolyse mit Alkali.

Im Einzelfalle kann die verwendete Kondensationsreaktion bzw. Abspaltungreaktion mit Rücksicht auf die Art der Ausgangsmaterialien gemäß dem Wissen des Peptidfachmannes gewählt werden.

Das so hergestellte Histidylphenylalanylarginyltryptophan ist als Ilelanocyt-stimulierendes Mittel geeignet} es ist auch als lipolytisches Mittel brauchbar.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, wobei Änderungen und Abwandlungen bezüglich der Lösungsmittel und der Reaktionskomponenten, der Reihenfolge der Einführung der Reaktionspartner zu der Reaktionslösung, der Reaktionstemperatur und der Reaktionsdauer, der Art der Aufarbeitung des Reaktionsgemisches

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und der Isolierung und Reinigung des Reaktionsproduktes gemäß dem Wissen des Fachmannes vorgenommen werden können. So ist dem Chemiker klar, daß ohne weiteres die D- oder DL-Aminosäure anstelle der !-Aminosäure verwendet werden kann.

Beispiel 1

2,45 g t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N -tosyl-L-arginyl-L-tryptophanbenzylester werden in 7 ml wasserfreier Trifluoressigsäure gelöst; man läßt bei Zimmertemperatur eine Stunde stehen. Es werden 100 ml wasserfreier Äther unter Eiskühlung zugesetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit wasserfreiem Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 2,34 g

ΛΙ

L-Phenyl-alanyl-N -tosyl-L-arginyl-L-tryptophan-benzylestertrifluoracetat. 0,88,6 g Irifluoracetat v/erden in 15 ml Äthylacetat gelöst und mit 10 ml 50 Ja (Gewicht/Volumen) Kaliumkarbonatlösung bei O⁰G geschüttelt. Die organische Schicht wird mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet; das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck bei 30⁰C abgedampft. Der so erhaltene L-Phenylalanyl-N -tosyl-L-arginyl-L-tryptophan-benzylester (0,86 g) und das N^N^-dicarbobenzoxy-L-histidin (Akabori et al.: Nature, 181 (1958), Seite 772) (0,423 g) werden in 10 ml Acetonitril gelöst; dann wird eine Lösung von 0,206 g N,N'-Dicyelohe:xyl~earbodiimid in 3 ml Acetonitril gegeben. Das erhaltene Gemisch läßt man 20 Stunden bei O⁰C stehen.

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Der ausgefällte Harnstoff wird abfiltriert. Das 3?iltrat wird unter vermindertem Druck "bei 35⁰C' eingeengt. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, mit η Salzsäure, Wasser, 5 Natriumcarbonatlösung und Wasser - in dieser Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet; das Lösungsmittel wird abgedampft, Das erhaltene Produkt (1,15 g) wird in 10 ml Äthylacetat gelöst und über 60 g Silikagel chromatographiert. Das Eluat mit Äthylacetat wird eingeengt. Man erhält 0,81 g In ,N ^m-Dicarbobenzoxy-L-histidyl-L-phenylalanyl-N -tosyl-L-arginyl-L-tryptophan benzylester.

24,5

Ep.: 97 - 105⁰C [öl] -10,9° (c = 1,825 in Methanol).

0,472 g des so hergestellten ΐί*",Ν ^-Dicarbobenaoxy-L-histidyl-L-phenylalanyl-H -tosyl-L-arginyl-L-tryptoplianbensylesters v/erden in 150 ml flüssigem Ammoniak gelöst. Die erhaltene Lösung wird beim Siedepunkt unter portionsweisem Zusetzen von metallischem Natrium gerührt, bis eine dauernde Blaufärbung eintritt. Nach Zugabe von 0,2 ml Eisessig wird der Ammoniak abgedampft. Der Rückstand wird in 40 ml 0,1 η Essigsäure gelöst; die erhaltene Lösung wird durch einen Gelit-Bausch zur Entfernung von Ungelöstem filtriert. Das Filtrat wird über Ainberlite OG-50 (Typ II, H-IOrm) chromatographiert. Die Säule wird mit 700 ml 0,25 ^iger Essigsäure und 50 ml Wasser gewaschen. Anschließend wird das gewünschte Peptid mit einem Gemisch von Pyridin, Essigsäure und Wasser

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(Volumenverhältnis 30:4:66) eluiert. Durch Abdampfen des lösungsmittels aus dem Eluat werden 0,306 g rohes 1-Histidyl-L~phenylalanyl-L-arginyl-L~tryptophan(acetat) erhalten. Das Rohprodukt wird über Carboxymethylcellulose chromatographiert. Das Eluat mit 0,75 m Ammoniumacetatpuffer (pH 6,45) wird zur Erhaltung äes reinen Tetrapeptids eingeengt. Das Produkt ergibt bei der Papierchromatographie unter Verwendung eines Gemisches von n-Butanol, Essigsäure und Wasser (Volumenverhalten 4:1:2) als Lösungsmittel und Papierelektrophorese bei

H01 pH 3,8, 6,6 und 11,1 einen einzigen Flecken. UV: f\ 280,5

max

24,5
(£ = 5100).Joe] -5,4° (c = 0,947 in η HGl).

^JD

Das Ausgangsmaterial dieses Beispieles, t-Butyloxy-carbonyl-L-phenylalanyl-N -tosyl-L-arginyl-L-tryptophanbenzylester, kann nach folgendem Reaktionsschema erhalten werden:

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t-Butyloxycarbonyl-L-phenyl-

alanindicyclohexylaminaalz (Anderson et al.: J.Am.Chem. Soc, 79 (1957), Seite 6180

Dowex-50w χ 8 (H^-Form)

t-Butyloxycarbonyl-1-phenyl alanin

N^-Carbobenzoxy-N -tosyl-L-arginin (Ramaonanäran et al.: J.Org.Chem., 27 (1962), Seite 4006 GH₃OH-SOCl₂

If-Carbobenzoxy-N -tosyl-L-arginin methylester

38 "p HBr-CH^COOH

N -Tosyl-L-argininmethyleater

L.

NjlT'-Dicyclohexylcarbodiimid

t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanylft

N -tosyl-L-argininmethylester

2n NaCH

t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-

H -tosyl-I-arginin

. H₂O

t-Butyloxycarbonyl-Ir-phenylalanyl H -tosyl-L-argininhydrazid

ΐ-ητο,

t-Butyloxycarbonyl-L-plienylalanyl-

N -tosyl-L-argininazid L-Iryptophan

P-CH₃C₆H₄SO₅H-C₆H₅CH₂OH

L-Sryptophanbenzylester-p-toluenBulfonat

50 jo K₂CO₃

L-Sryptopnanbenzylester

O⁰C, 47 Stunden in CH₃COOC₂H₅

t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N -tosyl-L-arginyl-L-tryptophanbenzylester

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Beispiel 2

1,86 g t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N -nitro-L-arginyl-L-tryptophanbenzylester werden in 2 ml Essigsäure gelöst und 8 ml wasserfreie Irifluoressigsäure hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch läßt man "bei Zimmertemperatur 45 Minuten im Stickstoffstrom stehen. Zu dem Reaktionsgemisch werden unter Eiskühlung 80 ml Äther zugesetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,70 g L-Phenylalanyl-N -nitro-I-arginyl-I-tryptophanbenzylestertrifluoracetat. Das Trifluoracetat (1,70 g) wird in 20 ml Essigsäure gelöst und unter Eiskühlung mit 50 tigern 5 ml Kaliumcarbonat geschüttelt, Die organische Schicht wird über wasserfreiem natriumsulfat getrocknet; das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der so erhaltene L-Phenylalanyl-N -nitro-L-arginyl-L-tryptophanbenzylester wird in 10 ml Acetonitril gelöst, und es wird eine Lösung von 1,22 g H⁰^₅N -Dicarbobenzoxy-L-histidin-p-nitrophenylester (hergestellt durch Kondensation von Iv ,N -Dicarbobenzoxy-L-histidin mit p~lTitrophenol in Gegenwart von !^,IT'-Dicyclohexylcarbodiiraid in lithylacetat) in 15 ml Acetonitril zugegeben. Das erhaltene Gemisch Hißt man in einem Kühler 44 Stunden stehen. Der Niederschlag wird atfiltriert, mit kaltem Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,24 g Μ***,Ν m-Dicarbobenzoxy-L-histidyl-L-phenylalanyl-IT^-nitr arginyl-L-tryptophanbenzylester. Das Eiltrat wird unter

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vermindertem Druck eingeengt; der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, mit 1 η Ammoniakwasser, mit 1 η Salzsäure und Wasser - in dieser Reihenfolge - gewaschen, über wasserfreiem natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck eingeengt und stehen gelassen, wobei eine zusätzliche Abscheidung (0,7 g) eintritt.

Die Produkte werden vereinigt, heiß in Äthylacetat gelöst und in einem Kühlschrank stehen gelassen. Die abgetrennten Kristalle werden wiederum mit Äthylaoetat behandelt; man erhält 1,65 g von N ,H m-Dicarbobenzoxyd-L-histidyl-L-phenyl-

alanyl-N -nitro-L-arginyl-L-tryptophanbenzylester. Ep.: 167 - 168⁰G (Zers.).

- 12,3° (c = 2,030 in Dimethylformamid).

0,50 g des so erhaltenen Iv ,'^ m-Dicarbobenzoxy-L-histidyl-L-pheuylalanyl-li -nitro-L-arginyl-L-tryptophanbenzylesters werden in 20 ml 90 ^igem ^itliylacetat gelöst und mit Palladiumschwarz im Wasserstoff strom 18 Stunden behandelt. ITach Abtrennen des Katalysators durch Filtration wird das Filtrat unter vermindertem Druck bei 45⁰O eingeengt. Der Rückstand wird lyophilisiert. l-ian erhält 0,375 g L-Histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophan (acetat).

Das Ausgangsmaterial dieses Beispieles t-Butyloxy-carbonyl-L-phenylalanyl-y^U-nitro-L-arginyl-L-tryptophanbenzylester, kann nach folgendem ileaktionssciiema erhalten v/erden:

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BAD ORIGWAL

N -Mltro-L-arginin (Hoffmann et al.: J.Am.Ohem.Soo., 78 (1956), Seite L-Iryptophan

P-OH₃O₆H₄SO₃H-

I-iDryptophan-

benzyleeter-

p-IoluolBulfonat

N/"

M*^-t-Butyloxyoarbonyl-N -nitro-L-arginin \

K₂OO₃

L-Iryptophan-"benzylester

t-Butyloxycarbnnyl-L·· phenylalanin dicyolohezylamin Salz

Dowex-50w χ 8

t-ButyloxycarlDonyl-L-phenylalanin

N,N·-Dioyolohexylcarbodiimid If^t-Butyloxyoarbonyl-K -

nitro-Ii-arginyl-Ii-tryptophan-

beneyleeter

OP₃OOOH

KnOO.

If -Nitro-L-arginyl-L-tryptophanbenzylester

N^N'-Dioyolohexyloarbodilmid

Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl ginyl-L-tryptophanbenzyleeter

targinyl

.-ir-iiitro-L·-

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Claims

Patentanspruch

Verfahren zur Herstellung von Histidylphenylalanylarginyltryptophan, gekennzeichnet duroh Kondensation einer Histidinverbindung der folgenden formel}

=0H

OH

N-R

P-GH-Q

in der P eine geschützte Amlnogruppe, Q eine Carboxylgruppe oder eine funktionell reaktionsfähige Gruppe, herrührend von der Carboxylgruppe, und B ein Wasserstoffatom oder eine gesohützte Iminogruppe mit einer Phenylalanylarginyltryptophan-

Verbindung folgender Formel bedeutet: HN»C-NH-RV

2 =

• HgNCIHCO-HNCHCO-HNOH-Q'

in der Q* eine Carboxylgruppe oder eine geschützte Carboxylgruppe und R* ein Wasserstoffatom oder eine geschützte Aminogruppe bedeutet, und Abspalten der sohützenden Gruppe (n) in das resultierende Kondensationsprodukt zwecks Erzeugung der ursprünglichen Gruppe (n).

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