DE1467846C - Verfahren zur Darstellung von follikel stimulierenden Gonadotropinen (Hormon FSH) und Schwangerschaftshormonen (Hormon LH) aus einer Komplexverbindung dieser beiden Hormone - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Darstellung von follikelstimulierenden Gonadotropien (Hormon FSH) und Schwangerschaftshormonen (Hormon LH) aus einer Komplexverbindung dieser beiden Hormone, insbesondere die HMG-Komplexverbindung, die aus dem Urin von Frauen zwischen den Menstruationszeiten oder von kastrierten weiblichen Säugetieren extrahiert worden ist.

Die beiden vorgenannten. Hormone, das Hormon FSH und das Hormon LH, sind in der Hypophyse des Menschen enthalten und werden mit dem Urin ausgeschieden, insbesondere im Urin von Frauen in den Zeiten zwischen der Menstruation oder im Urin kastrierter weiblicher Säugetiere. Die Hypophyse und der Urin sind im wesentlichen die beiden Quellen, aus denen diese beiden Hormone gewonnen werden. Während die Hypophyse des Menschen als Ausgangspunkt schwierig zu erhalten ist, ist der Urin von kastrierten weiblichen Säugetieren bzw. der weibliche Urin zwischen den Zeiten der Menstruation leicht und in ausreichender Menge zu erhalten.

In der Hypophyse liegen die beiden Hormone FSH und LH in freiem Zustand vor, deren Molekulargewichte im allgemeinen als ähnlich betrachtet werden. Es ist bekannt, diese beiden in freier Form vorliegenden Hormone durch Extraktion der Hypophyse abzutrennen. Bei diesem bekannten Verfahren erfolgt eine Chromatographie an einem Anionenausf.auscher, und zwar an Diäthylaminoäthylcellulose, die ein beladener Ionenaustauscher ist. Bei diesem bekannten Verfahren handelt es sich um eine Absorption durch Ionenaustausch zwischen dem Celluloseträger, welcher positiv geladene Diäthylaminoäthylgruppen besitzt, und negativ geladenen Gruppen, die in Lösung vorliegen. Die Diäthylaminoäthylcellulose wird aus Celluloseteilchen gebildet, die in wässrigem Medium ohne Erzeugung eines Gels aufquellen. Kleine und große Moleküle können auf diese Weise durch eine mit Diäthylaminoäthylcellulose gefüllte Kolonne laufen, ohne daß sie dabei durch eine Molekularsiebwirkung aufgehalten werden. Die in freier Form vorliegenden Hormone FSH und LH, deren Molekulargewichte ohnehin sehr eng Beeinander liegen, werden daher bei diesem bekannten Verfahren ausschließlich durch die Anionenaustauschereigenschaften der Diäthylaminoäthylcellulose aus der Hypophyse abgetrennt.

Wie eingangs bereits aufgezeigt, ist jedoch die Hypophyse des Menschen zur Gewinnung der in Rede stehenden Hormone nur schwer und in begrenztem Umfange erhältlich. Der Urin von kastrierten weiblichen Säugetieren bzw. der weibliche Urin zwischen der Zeit der Menstruation dagegen stellt für die Gewinnung der beiden Mormone FSH und LH eine Quelle dar, die in unbegrenzter Menge und leicht erhältlich ist.

Untersuchungen haben ergeben, daß die in Rede stehenden Hormone im Urin in Form eines hormonalen Komplexes vorliegen, der als H MG (»Human Menopausal Gonadotropin«) bezeichnet wird. Der Komplcxzustand der beiden Hormone ist auf Umwandlungen zurückzuführen, welche die Freisetzung tier Hormone aus dem Organismus im Verlauf ihres Stoffwechsels begleiten. Diese Kompiexverbindung, die in Kombination Follikdhormone und Sehwangerschaftshormone enthält, konnte bisher nicht in die beiden Bestandteile FSH und LH aufgetrennt werden.

Da die in Rede stehenden Hormone im Urin in l'orin von Komplexen vorliegen, durch welche ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften maskiert werden, ist eine Auftrennung auf chemischem Wege und mit Hilfe des bekannten Verfahrens nicht möglich. Während bei dem bekannten Verfahren zur Abtrennung der Hormone FSH und LH aus der Hypophyse die Hormone in freier Form vorliegen, und auf Grund der Anionenaustauschereigenschaften der Diäthylaminoäthylcellulöse abgetrennt werden, lassen sich die in komplexer Form im Urin vorliegenden Hormone FSH und LH durch das

ίο bekannte Verfahren nicht trennen.

Es war daher die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe, ein Verfahren zu schaffen, mit welchem die in komplexer Form im Urin vorliegenden Hormone FSH und LH auf einfache Weise getrennt werden können.

Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man eine Lösung der Komplexverbindung in einer Pufferlösung mit einer Ionenstärke von 0,05 bis 0,1 Mol herstellt, diese Lösung auf ein schwach vernetztes Dextran- oder Acrylamidgel gibt, dessen Sieb-

ao eigenschaften so bemessen sind, daß Moleküle miteinem Molekulargewicht von mindestens 30000 bis 100000 hindurchgehen, und das Eluat fraktioniert auffängt.

Die Abtrennung der in Rede stehenden Hormone durch Filtration mittels eines Molekularsiebes ist dadurch möglich, daß die Komplexe von FSH und LH Molekulargewichte besitzen, die für eine derartige Abtrennung weit genug auseinanderliegen. Diese Erkenntnis ist auf Grund des bisherigen Standes der Technik eine völlig unerwartete Tatsache, die es, was bisher noch niemals möglich war, ermöglicht, die beiden Hormone des Komplexes HMG in der Form aufzutrennen, in welcher sie vorliegen. Das vernetzte Dextran- oder Acrylamidgel ist ein reines Molekularsieb ohne jegliche Ionenaustauschereigenschaften, wobei das Gel ein dreidimensionales Gitter bildet, welches Moleküle zurückzuhalten vermag, deren Abmessungen größer sind als seine Maschen.

Besonders gute Ergebnisse werden mit schwach vernetzten Dextranen erreicht, die unter der geschützten Handelsbezeichnung »Sephadex« auf dem Markt sind, speziell mit einem Produkt mit dem geschützten Handelsnamen- »Sephadex G-100«. Es ist zweck- ,· mäßig, daß man das als Molekularsieb zu verwendende > Produkt vor dem Einsatz zum Filtrieren der hormonalen Kompiexverbindung entsprechend den Anweisungen des Fabrikanten anquellen läßt und dann die aus dem Molekularsiebprodukt gebildete Trennsäule mit dem gleichen Lösungsmittel vorbehandelt, in welchem die Komplexverbindung gelöst ist.

Alsdann werden die zweiwertigen Metallionen aus dem Extrakt entfernt in der Weise, daß man sie an Kationen-Austauscherharz adsorbiert. Nach dieser Behandlung wird ein Teil der Verunreinigungen, die üblicherweise an der hormonalen Komplexverbindung anhaften, durch Eingeben in eine Äthanollösung bis zu einer Konzentration von 55°/₀ ausgefällt. Schließlich wird das HMG aus der bei der letzten Verfahrensstufc anfallenden überstehenden Lösung ausgefällt, dadurch, daß man die Konzentration an Alkohol auf 80% erhöht. Man zentrifugiert den . Niederschlag ab, wäscht mit absolutem Alkohol und trocknet unter Vakuum. Dieses Produkt, das als »H MG-Rohprodukt« bezeichnet wird, wird als Ausgangsprodukt /ur erlindungsgemäiJen Gewinnung der Hormone I¹SH und LH eingesetzt.

Nachfolgend wird die Erfindung an Hand eines Beispiels veranschaulicht; in welchem die Trennung die- j

ser Hormone FSH und LH ausgehend von einem solchen Rohprodukt beschrieben ist.

Beispiel

Als Molekularsieb wurde das unter dem geschützten Handelsnamen erhältliche Sephadex G-IOO verwendet. Das Molekularsieb wurde in 0,9%igem Natriumchlorid quellen gelassen, dann wurde das überschüssige Salz nach und nach mit destilliertem Wasser ausgewaschen, und das Gel wurde in eine 7,2 · 107 cm große Säule gefüllt. Es ist wichtig, daß diese aus dem so hergestellten Gel bestehende Säule gleichmäßig über die gesamte Dicke und absolut senkrecht zu der Grundfläche angehäuft ist. Diese Säule wird alsdann mit einer starkionischen Pufferlösung von 0,05 bis 0,1 und einem pH-Wert von 8 bis 9 gewaschen, bis das NaCl ausgewaschen und die Säule äquilibriert ist. Man verwendet dazu vorteilhaft eine Ammoniumbicarbonatlösung von 0,1 Mol und einem pH-Wert von 8,2. Daneben bereitet man eine Lösung aus 3 g eines HMG-Rohproduktes in 40 ml des zuvor genannten Lösungsmittels, stellt dessen pH-Wert auf 8,2 ein und trennt unlösliche Bestandteile, sofern solche vorhanden sind, durch Zentrifugieren ab. Diese Lösung filtriert man bei 4° C durch die aus dem Gel bestehende Säule, und zwar mit einer Ausfiußgeschwindigkeit von 40 bis 50 ml je Stunde. Es werden in einer Sammelvorrichtung für Fraktionen 20-ml-Fraktionen aufgefangen. Man bestimmt die Konzentration an Proteinen mittels optischer Dichtemessungen bei 280 ηιμ in einem Spektrophotometer.. Die biologische Aktivität der die Trennsäule verlassenden Fraktionen ist im allgemeinen so ausreichend hoch, daß es nicht notwendig ist, die Fraktionen vor der Verwendung zu konzentrieren.

Die biologische Aktivität der Fraktionen wurde mittels zwei spezifischen Methoden an nicht geschlechtsreifen Ratten untersucht. Die FSH-Aktivität wurde mittels der Methode von S t e e 1 m a η und P ο h 1 e y geprüft, die in der angelsächsischen wissenschaftlichen Literatur als »augmentation assay« bekannt ist und darauf beruht, daß das Ovarium der Ratte nach Injektion des zu prüfenden Produktes gewichtsmäßig zunimmt, entsprechend einer bestimmten Menge an menschlichem Chorionhormon, das mit der Abkürzung HCG bezeichnet wird. Es werden insgesamt 20 bis 40 internationale Einheiten dieses Hormons Injiziert. Die LH-Aktivität wird gemäß der Methode von P a r 1 ο w bestimmt, die auf der Bestimmung der Abnahme der Ascorbinsäure im Ovar bei im Pseudo-Schwangerschaftszustand befindlichen Ratten beruht. Die Pseudo-Schwangerschaft wird durch eine 21 Tage vorher den Ratten verabreichte Injektion von 50 internationalen Einheiten des von trächtigen Stuten stammenden Hormonserums, das allgemein PMSG genannt wird, und 3 Tage später Verabreichung einer Injektion von 50 internationalen Einheiten von HCG erzielt. 10 Tage nach Beginn dieser Behandlung werden die zu prüfenden Proben injiziert. 3 Stunden nach jeder Injektion wird das Ovar entnommen und sein Gehalt an Ascorbinsäure kolorimetrisch geprüft. Als Standardproben dienen hormonale Produkte amerikanischen Ursprungs, die aus dem Institut Americain de Santeä Bethesda, Maryland, USA., zur Verfugung gestellt werden. Es handelt sich um die Produkte NIH-FSH-Sl für das FSH bzw. NIH-LH-Sl für das LH. Die Einheit der Hormone ist die Aktivität, die einem mg der jeweiligen Standardprobe entspricht.

Der Vergleich der Aktivitäten wird mittels der

ao Methode von Bliss bestimmt entsprechend der Veröffentlichung von C. I. Bliss »The stutistics of Bioassay«, Academic Press, New York, 1952, vorgenom-

• men, und die Ergebnisse werden durch eine Analyse der Veränderungen und eine Analyse der Wirkung

»5 der Dose geprüft. Insbesondere wird für LH eine Kovariance-Analyse durchgeführt, nachdem die einregulierbaren mittleren Werte berechnet worden sind, die sich aus den verschiedenen Vergleichen mittels des Versuches von D u η η e t ergeben, der beschrieben ist von R. G. D. Stell und J. H. To r r i e »Principles and Procedures of Statistics«, Mc Graw-Hill, New York, 1960.

Nachdem mittels dieser spezifischen Untersuchungen die Verschiebung der beiden aktiven Komponenten FSH und LH in dem aus der Trennsäule entnommenen Eluat festgestellt worden ist, werden die interessierenden Fraktionen wieder vereinigt, dialysiert und sofern erforderlich lyophilisiert.
In dem obigen Beispiel lag die LH-Aktivität in den Fraktionen bei 72 bis 80; es wurden 0,263 g eines trockenen Produktes erhalten, was als »Gruppe A« bezeichnet wurde. Die FSH-Aktivität in den Fraktionen wurde zu 89 bis 96 gefunden, mit einer Ausbeute von 0,333 g (»Gruppe C«). Es wurde außerdem eineZwischengruppe (»Gruppe B«) erhalten, und zwar die Fraktionen mit 81 bis 88, in einer Menge von 0,597 g eines Produktes, das eine Mischung dieser beiden Hormone war.

Nachdem die Titer dieser Hormone bestimmt worden waren, wurden die FSH- und LH-Aktivitäten jeder der Gruppen A, B und C redosiert. In der nachstehenden Tabelle ist diese Einstellung aufgezeigt:

Gruppe

LH-Aktivität
R. A.

FSH-AktivitU
R. A.

A 0,0131 (0,0029 —0,0596) 0,49

B 0,0012(0,0005 — 0,0029) 0,41

C 0,0005(0,0001—0,0015) 0,51

R.A. = Angabe der Aktivitäten mit den ermittelten Hcchst- und Tiefwerten für ρ A = Präzisionsgrad.

0,010 (0,005 — 0,019)
0,044 (0,028 — 0,070)
0,062 (0,041 — 0,095)

0,05.

0,22
0,18
0,19

Der Vergleich wurde mit den zuvor erwähnten Standardproben durchgeführt.

Bei Prüfung der Tabelle erkennt man, daß die LH-Aktivität in der Gruppe A sehr konzentriert ist und daß die FSH-Aktivität in der Gruppe C konzentriert ist. Die Gruppe A enthält 48,3⁰/„ LH-Aktivität und 4,9% FSH-Aktivität der in dem HMG-Rohprodukt enthaltenen ursprünglichen Aktivitäten. Dieses Ergebnis ist direkt entgegengesetzt dem Ergebnis der Gruppe C, in der die FSH-Aktivität überwiegt: 38,2% der FSH- und 0,2% der LH-Aktivitat, bezogen auf die Aktivitäten des HMG-Rohproduktes waren in dieser Gruppe vorhanden. Die dazwischenliegende Gruppe B, in denen die Hormone im Gemisch

miteinander zu ungefähr gleichen Teilen vorhanden sind, kann bei einem neuen Filtrationsansatz über das Gel rückgeführt werden.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Darstellung von follikelstimulierenden Gonadotropinen (Hormon FSH) und Schwangerschaftshormonen (Hormon LH) aus einer Komplexverbindung dieser beiden Hormone, insbesondere die HMG-Komplexverbindung, die aus dem Urin von Frauen zwischen den Menstruationszeiten oder von kastrierten weiblichen Säugetieren extrahiert worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung der Komplexverbindung in einer Pufferlösung mit einer Ionenstärke von 0,05 bis 0,1 Mol herstellt, diese Lösung auf ein schwach vernetztes Dextran- oder Acrylamidgel gibt, dessen Siebeigenschaften so bemessen sind, daß Moleküle mit einem Molekulargewicht von mindestens 30000 bis etwa 100000 hindurchgehen, und das Eluat fraktioniert auffängt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die hormonale Komplexverbindung in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8 bis 9 auflöst.