DE1443315B2

DE1443315B2 - Cyclisches polypeptid und verfahren zu dessen herstellung und dieses enthaltendes mittel

Info

Publication number: DE1443315B2
Application number: DE19601443315
Authority: DE
Inventors: Roger Dr. Bottmirtgen; Guttmann Stephan Dr. Basel; Boissonnas (Schweiz)
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1959-07-24
Filing date: 1960-07-21
Publication date: 1973-05-10
Also published as: DE1443315C3; GB928607A; DE1443315A1; OA01257A; CH376125A; FR726M; US3232923A; ES259803A1

Description

Cys — Phe — Phe — GIu — Asp — Cys — Pro — Lys — GIy — NH₂

durch Oxydation in wäßriger Lösung in das Polypeptid I überführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxydation von III zu I durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff oder durch Zugabe von Wasserstoffperoxyd durchführt.

4. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es das Polypeptid der Formel I enthält.

Gegenstand der Erfindung ist ein cyclisches Polypeptid mit pressorischer Wirkung der Formell

Cys —r- Phe Phe

Cys Asp GIu

Pro

GIy-

NH₉

und ein Verfahren zu dessen Herstellung und dieses enthaltendendes Mittel.

Die Abkürzungen Cys, Phe, GIu, Asp, Pro, Lys, GIy bedeuten L-Cysteinyl, L-Phenylalanyl, L-Glutaminyl, L-Asparaginyl, L-Prolyl, L-Lysyl und Glycinamid.

Das neue Peptid I wird erhalten, indem man erfindungsgemäß das Nonapeptid-Derivat III

Cys — Phe — Phe — GIu — Asp — Cys — Pro — Lys — GIy — NH₂

durch Oxydation in wäßriger Lösung in das Polypeptid I überführt. Das Nonapeptid III wird aus dem Nonapeptid-Derivat II

R"

R'

R"

R — Cys — Phe — Phe — GIu — Asp — Cys — Pro — Lys — GIy — NH₂

erhalten, in welchem R' einen Benzylrest und R" und R'" eine Carbobenzoxygruppe oder eine p-Toluolsulfonylgruppe bedeuten, indem man dieses mit einem Alkalimetall in flüssigem Ammoniak umsetzt. Es wurde gefunden, daß die Verbindung I eine gleich starke vasopressorische Wirkung besitzt wie das natürliche Vasopressin, welches sich von der obigen Formel I dadurch unterscheidet, daß an Stelle von Phenylalanin Tyrosin eingebaut ist.

Nicht vorauszusehen war aber, daß die antidiuretische Wirkung der Verbindung I nur ungefähr V₃ derjenigen des Vasopressins beträgt. Auch beträgt die uterotone Wirkung der Verbindung I nur etwa 2°/„ der bereits schwachen uterotonen Wirkung des Vasopressins.

Die Verbindung I unterscheidet sich somit vom Vasopressin durch eine spezifischere vasopressorische Wirkung.

Diese überraschenden Eigenschaften der Verbindung I stellen bei der Schockbekämpfung, zur Erzeugung von lokaler Blutleere bei Operationen, insbesondere in der Gynäkologie bei vaginalen Operationen, in der Otorhinolaryngologie bei Tonsillektomien und Ohroperationen, in der Chirurgie bei Strumektomien und stärker blutenden urologischen Operationen sowie in der Zahnheilkunde als Beigabe zum Lokalanästheticum einen bedeutenden Vorteil dar. Gegenüber Adrenalin weist die Verbindung I besondere Vorteile auf. Während Adrenalin mit Regelmäßigkeit erhebliche Blutdruck- und PuIs-Steigerungen verursacht, bleiben diese bei der Verbindung I bei mindestens gleichwertiger lokaler Blutleere aus.

Das erfindungsgemäß zu verwendende Ausgangsprodukt wird beispielsweise folgendermaßen erhalten: Bz- Cys — Asp — GIu — Z + Pro — Lys — GIy — NH₂

I I

N₃ IV Tos V

■' z

Bz- Cys — Asp — GIu — Z + Bz — Cys — Phe — Phe — N₃

I ^: ■ ■

Pro — Lys — GIy — NH₂
VI Tos VII

Bz — Cys — Phe — Phe Bz — Cys — Asp — GIu

Pro — Lys — GIy — NH₂ Tos VIII

Z bedeutet die Carbobenzoxygruppe, Bz den Benzylrest und Tos die Tosylgruppe.

Man kondensiert N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-azid (IV) (B ο i ss ο η η a s & coll., HeIv. chim. Acta, 38, 1491 [1955]) mit L-Prolyl-e-N-p-toluolsulfonyl- L-lysyl-glycinamid (V), das durch Abspaltung der Carbobenzoxygruppe von N-Carbobenzoxy-L-prolyl-s-N-p-toluolsulfonyl-L-lysyl-glycinamid (du Vigneaud& coll., J. Amer. ehem. Soc, 78, 5884 [1956]) hergestellt wurde. Das erhaltene Hexapeptid (VI) wird, nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe, mit N-Carbobenzoxy-S-benzyli-cysteinyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-azid (VII) kondensiert. Letzteres wird durch Kondensation von N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-phenylalanin (Jaquenoud & Boissonnas, HeIv. chim. Acta, 42, 788 [1959]) mit L-Phenylalanin-methylester und nachfolgende Überführung in das Azid nach bekannten Methoden erhalten. Das entstehende Nonapeptid-Derivat VIII wird durch Behandlung mit einem Alkalimetall, vorzugsweise Natrium oder Kalium, in flüssigem Ammoniak behandelt, so daß das lineare Nonapeptid III entsteht.

Beispiel 1 a) Z — GIu — Asp — Cys(Bz) — Pro — Lys(e-Tos) — GIy — NH₂

Man löst 200 g Z — Pro — Lys(e-Tos) — GIy (du Vigneaud & coll., J. Amer. ehem. Soc., 78, 5884 [1956]) in 1000 ecm mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure, läßt während einer Stunde bei 20° C stehen und verdampft im Vakuum unterhalb 40⁰C. Der Rückstand wird mit Diäthyläther sorgfältig gewaschen und hierauf zu einer Lösung von 185 g Z — GIu — Asp — Cys(Bz) — azid (B ο i ss ο η η a s & coll., HeIv. chim. Acta, 38, 1491 [1955]) und 48 ecm Triäthylamin in 1500 ecm Dimethylformamid zugegeben. Es wird über Nacht bei 2O⁰C stehen gelassen und die Mischung hierauf in zwei Volumen Aceton gegossen. Man filtriert vom abgeschiedenen Niederschlag ab, wäscht mit Wasser nach und kristallisiert in Dimethylformamid/Aceton um. Man erhält 190g .,·,..·

Z — GIu — Asp — Cys(Bz) — Pro — Lys(s-Tos) — GIy — NH₂ Schmp. 165⁰C (Zersetzung). [tx]V = —38° (c = 2, Dimethylformamid). ■ '

5 6

b) Z — Cys(Bz) — Phe — Phe — azid

Zu einer Mischung von 111 g Bz — Cys(Z) — Phe Der Rückstand wird mit Petroläther gewaschen und

(Jaquenoud & Boissonnas, HeIv. chim. aus heißem Methanol umkristallisiert. Man erhält

Acta, 42, 788 [1959]), 54 g Phe-methylester-chlor- 5 110 g Bz — Cys(Z) — Phe — Phe-methylester (Schmp.

hydrat und 35 ecm Triäthylamiri. in 1250 ecm Aceto- 163⁰C). Dieser wird in einer Lösung von 3500 ecm

nitril und 1000 ecm Pyridin werden 57 g Dicyclo- Methanol und 88 ecm Hydrazinhydrat während

hexylcarbodiimid zugegeben. Man läßt über Nacht 2 Stunden bei 60⁰C erwärmt. Der Niederschlag wird

bei 2O⁰C stehen. Das Reaktionsgemisch wird filtriert abnitriert und mit Wasser und Methanol sorgfältig

und das Filtrat hierauf im Vakuum eingedampft. io gewaschen. Man erhält 91 g

Bz — Cys(Z) — Phe — Phe-hydrazid

(Schmp. 210⁰C). Dieses wird in einer Mischung von 15 wäßrigem Natriumbicarbonat versetzt. Der Nieder-

1100 ecm Dimethylformamid, 830 ecm Isopropanol schlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und

und 69 ecm 12n-wäßriger Salzsäure gelöst. Die unter Vakuum schnell getrocknet. Man erhält .90. g

gekühlte Lösung wird mit 30 ecm 5 n-Natriumnitrit- Azid, die sofort weiterverarbeitet werden,
lösung und nach 10 Minuten mit 4300 ecm 0,2 n-

c) Bz — Cys(Z) — Phe — Phe — GIu — Asp — Bz — Cys — Pro — Lys(8-Tos) — GIy — NH₂

Man löst 50 g

Z — GIu — Asp — Cys(Bz) — Pro — Lys(e-Tos) — GIy — NH₂

in 400 ecm mit Bromwasserstoff gesättigter wasser- Lösung von 32 g Bz — Cys(Z) — Phe — Phe-azidund freier Essigsäure und läßt während 1 Stunde bei 60 ecm Triäthylamin in 500 ecm Dimethylformamid 20° C stehen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels versetzt. Man läßt 2 Tage bei 20° C stehen und verim Vakuum unterhalb 40⁰C wird der Rückstand mit 30 setzt hierauf mit zwei Volumen Essigester und wäscht Diäthyläther sorgfältig gewaschen und mit einer sorgfältig den Niederschlag mit warmem Methanol.

Man erhält 45 g

Bz — Cys(Z) — Phe — Phe — GIu — Asp — Cys(Bz) — Pro — Lys(e-Tos) — GIy — NH₈
Schmp. 222°C, [K]V = —50° (c = 1, Dimethylformamid).

Analyse für C₇₅H₉₁O₁₅N₁₃S₃:

Berechnet:
C 59,6, H 6,1, O15,9, N 12,1, S6,4»/₀;

gefunden:
C 59,4, H 6,4, O 16,0, N 11,7, S 6,5%.

d) Cys — Phe — Phe — GIu — Asp — Cys — Pro — Lys — GIy -NH₂
Man versetzt eine Lösung von 10 g

Bz — Cys(Z) — Phe — Phe — GIu — Asp — Cys(Bz) — Pro — Lys(e-Tos) — GIy — NH₂

in 2500 ecm trockenem flüssigem Ammoniak unter Rühren bei der Siedetemperatur der Lösung mit so viel Natrium- oder Kaliummetall, bis eine beständige blaue Färbung eingetreten ist. Nach Zusatz von 1,8 g Ammoniumchlorid wird die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand enthält das

Cys — Phe — Phe — GIu — Asp — Cys — Pro — Lys — GIy — NH₂

e) Polypeptidverbindung I
Der Rückstand, enthaltend

Cys — Phe — Phe — GIu — Asp — Cys — Pro — Lys — GIy — NH₂

wird in 201 0,01 N Essigsäure gelöst und bei einem pH von 6,5 bis 8,0 durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff im Überschuß während 1 Stunde oxydiert.

Man bringt die Lösung, die die Substanz I enthält, auf einen pH von 4,0 bis 5,0 und dampft nach Zusatz von 100 g Natriumchlorid zur Trockne ein, wobei ein Pulver erhalten wird, das gut haltbar ist; es kann bei Gebrauch in Wasser klar gelöst werden. Man kann jedoch die Lösung direkt verwenden, die durch Gegenstromverteilung in dem System sek.-Butanol/

Wasser/Trifiuoressigsäure 120/1601 und nach Abdampfen des Butanols sowie anschließender Behandlung mit »Amberlit-IRA 410« in der Azetatform gereinigt wird. Die so erhaltene Polypeptidverbindung verhält sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese einheitlich.

Die Totalhydrolyse (16 Stunden, HO⁰C, 6 N HCl) ergibt die folgende Aminosäurezusammensetzung:

	Asp	GIu	Pro	GIy	Cys	Phe	Lys
Berechnet	1,00 1,01	1,00 1,00	1,00 1,02	1,00 0,99	2,00 1,76*)	2,00 1,96	1,02 1,02
Gefunden

*) Cys wurde während der Hydrolyse teilweise zerstört.

Der Peptidgehalt wird durch Aminosäureanalyse nach Stein & Moore (gef. 1,65mg/ml) und durch Stickstoff bestimmung nach Kjeldahl (gef. 1,69 mg/ml) bestimmt. Die Polypeptidverbindung I zeigt folgende biologische Charakteristika:

Oxytocinähnliche Wirkung in IE/mg

Isolierter Rattenuterus 0,3

Blutdruck (Hahn) ~ 0,15

Milchdrüse (Kaninchen) ~ 2,5

Vasopressinähnliche Wirkung in IE/mg

Blutdruck (Ratte) 57±7

Hemmung der Diurese (Ratte) 21±2

(Ausbeute 35 bis 40% ausgehend von

Z — Cys(Bzl) — Phe — Phe — GIu — Asp — Cys(Bzl) — Pro — Lys(e-Tos) — GIy — NH₂)

Beispiel 2

Man verfährt wie im Beispiel 1, Abschnitte a, b, c und d. Man verfährt weiter wie in Abschnitt e, oxydiert durch Zusatz von 15 ecm einer 1 N-Lösung von Wasserstoffperoxyd in Wasser bei einem pH von 4,0 bis 6,0. Die Polypeptidverbindung I zeigt die gleichen Charakteristika wie unter e).

(Ausbeute 35 bis 40% ausgehend von

Z — Cys(Bzl) — Phe — Phe — GIu — Asp — Cys(Bzl — Pro — Ly(e-Tos) — GIy — NH₂)

309519/515

Claims

1. Polypeptid der Formel I,

Patentansprüche:

Cys Phe Phe

Cys Asp GIu

Pro Lys -— GIy — NH₄

in der die Abkürzungen Cys, Phe, GIu, Asp, Pro, Lys, Gly-L-Cysteinyl, L-Phenylalanyl, L-Glutaminyl, L-Asparaginyl, L-Prolyl, L-Lysyl und Glycinamid bedeuten.

2. Verfahren zur Herstellung des Polypeptides nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Nonapeptid III