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Verfahren zur Herstellung einer L@Leucinamid, Hypertensin und Oxytocin
spaltenden Aminopeptidase Aus Arbeiten von T. Akatsuka und M. Sato (Bull. Arg..Chem.
Soe. Japan, 22, 465 bis 474 (1959)* und 27, 71 bis 75 (1963) ) ist bekannt, daß
verschiedene Aspergillus-Arten, die auf einem Nährboden aus Magermilch und Glukose
gezüchtet werden, neben anderen Proteasen auch eine Aminopolypeptidase erzeugen.
Diese spaltet zwar L..Leucyl-glycyl»glycin, jedoch weder L--Leucinamid noch L-Leucyl.glycin.
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Es wurde nun gefunden, daß Stämme aus verschiedenen Aspera gillus-Gruppen,
darunter die für die technische Herstellung von Proteasen bekannten Stämme, Aspergillus
oryzae, sojae, prasiticus, melleus und Asp. flavus, eine Aminopeptidase erzeugen,
die weder mit der von Akatsuka und Sato isolierten noch mit der aus Schweinenieren
gewonnenen Leucinamino#. peptidase (The Enzymes Editors Boyer, Lardy and Myrbäck
Academie Press, New York and London, h, 37 bis 62, 196O) identisch ist. Die Isolierung
dieser bisher nicht beschriebenen Aminopeptidase ist Gegenstand der vorliegenden
Erfindung. Aus Aspergillusstämmen werden jene Varianten ausgewählt' mit deren Ehzymen
eine Spaltung von L-Leucin-p-nitranilid und L-Cystin-bis@p-nitranilid bei der Durchführung
des von Tuppy et a1. beschriebenen Tests (Hv Tuppy, U. Wiesbauer und E. Wintersberger:
Hoppe-Seglers Zeitschrift für physiologische Chemie, 32 , 278 bis 288 (1962) ) erzielt
wird. Für die technische Gewinnung von Proteasen werden bekanntlich. in erster Linie
Aspergillus parasiticus, Asp. oryzae, Asp. melleus und
Asp. flavus
verwendet.'Die im Sinne der vorliegenden Erfindung auszuwählenden Aspergillus-Varianten
gehören in der Regel zu diesen Stämmen, wobei die Spezifität gegenüber aminoendständigem
L-Leucin bei der von Aspergillus parasiticus erzeugten Aminopeptidase besonders
stark ausgeprägt ist. ° . Aus dem Kulturfiltrat-der nach dem genannten Gesichtspunkt
ausgewählten Aspergilli wird in an sich bekannter Weise durch fraktionierte Lösungsmittelfällung
die zu isolierende Aminopeptidase zusammen mit anderen Peptidasen und Proteinasen
abgeschieden und durch Zentrifugieren oder Filtrieren von der Flüssigkeit getrennt.
Die Technik des Fällens ist den -nachstehenden Beispielen zu entnehmen. Das erhaltene
Enzymgemisch wird in Wasser gelöst und nach Zusatzeines Kobalt.. salzes mindestens
1 Stunde auf 60o erhitzt. Es muß als .
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überraschend bezeichnet werden, daß zwar erwartungsgemäß alle Begleitenzyme
der zu isolierenden Aminopeptidase bei einer so--langen Erwärmung inaktiviert werden,
das gesuchte Enzym jedoch in aktiver Form erhalten bleib t._Es kann aus der wäßrigen
Lösung durch Aussalzen oder durch Lösungsmittelfällung isoliert und als Rohprodukt
zur Durchführung tech@-. -nischer Prozesse verwendet werden. Die Re3@ndarstellüng
eines, elektrophoretisch einheitlichen Produkts, das z. B. dia.-gnostischen oder
therapeutischen Zwecken dienen soll, kann- -in an sich-bekannter Weise chromatographisch,
z. R..-an Cellul.ose- oder Dextrangelaustauschern mit ,funktionellen Gruppen, wie
Diäthylaminoäthyl,-Gruppen,..erfolgen.
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Die beschriebene-Arbeitsweise hat den Vorteil, daß mit der fraktionieren
Lösungsmittelfägliung eine Anreicherung der zu isolierenden Aminopeptidase erreicht
wird und gleich zeitig bei der Fällung noch in Lösung bleibende Prdteasen anschließend
gewonnen werden können. Es ist grundsätzlich
möglich, auf die zur
Anreicherung durchgeführte Fällung zu verzichten, d, h. dem Kulturfiltrat unmittelbar
ein Kobaltsalz zuzusetzen und alle in Lösung befindlichen Enzyme bis auf die zu
isolierende Aminopeptidase thermisch zu inaktivieren. --In diesem Vorgehen ist aufgrund
wirtschaftlicher Überlegungen eine verschlechterte Ausführungsform des Anmeldegegenstands
zu sehen; sie soll ausdrücklich vom nachgesuchten Schutz mitumfaßt werden.
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Im Gegensatz zu der von Akatsuka und Sato isolierten Amino. peptidase
spaltet das erfindungsgemäß hergestellte Enzym L.-Leueinamid. Außer diesem für .die
Unterscheidung wesentlichen Kennzeichen weist die aufgefundene Aminopeptidase ein
technisch bzw. pharmakologisch ausnutzbares Spaltvermögen für das wehenerregende
Hormon Oxytocin und für das blutdrucksteigernde Angiotensin II auf, d. h. diese
physiologisch bedeutsamen Polypeptide können, wenn dies aus medizinischen Gründen
erforderlich ist, durch Geben der erfindungs-. gemäß hergestellten Aminopeptidase
inaktiviert, d. h. es kann in vivo ein Mechanismus in Gang gesetzt werden" den sonst
nur hochspezifische, körpereigene Enzyme oder Enzym systeme auslösen. Die Wirkung
gegenüber Oxytocin konnte am isolierten Rattenuterus und die Wirkung gegenüber Angiotensin
II sowohl in vitro am reinen Polypeptid als auch in vivo an der spinalisierten Katze
nachgewiesen werden. Die-erfindungsgemäß hergestellte Aminopeptidase kann weiterhin
zur Sequenzanalyse oder auch zum Abbau von Polypeptiden im präparativen Maßstab
verwendet werden. Zusammen mit Proteinasen ist sie zum Abbau von Proteinen bis zu
niedermolekularen Peptiden oder Aminosäuren geeignet.
Beispiel
1:
10 1 Kulturfiltrat einer-technischen Züchtung von Asp. oryzae wurden,,innerhalb
von 30 Minuten bei 0 bis 50 unter Rühren mit dem gleichen Volumen an vorgekühltem
Aceton versetzt und nach weiteren 30 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde
mehrmals mit 50-öigem-wäßrigem-Aceton -und zuletzt mit reinem Aceton gewaschen und
an der Luft getrocknet. Ausbeute 69 gw Dieses Produkt wurde sogleich in 1,4 1 dest.
Wasser weitgehend gelöst, bei 0 0 unter Rühren zunächst mit 600 ml Aceton
inaktives Produkt gefällt und zusammen reit den ungelösten Anteilen- abzentrifugiert:
Zur klaren Lösung wurden weitere 550 ml Aceton gegeben, der Niederschlag durch Zentrifugieren
abgeschieden und mit Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen $ g Ausbeute mit einer
spezifischen Aktitität von E = 350/g Präparat.- Aktivitätsausbeute 89 %, bezogen.auf
den Kultursaft.
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Von diesem vorgereinigten Aminopeptidase-Präparat wurde nun eine 1-
ö-ige Lösung in. 10M3 molarer Kobaltaeetatlösung her.» gestellt und zur Entfärbung
etwas Aktivkohle zugesetzt. Diese Lösung wurde-im Wasserbad 90 Minuten auf 60° erhitzt,
auf 0 bis 5 0 abgekühlt und, ähnlich wie im vorigen Absatzbeschrieben, mit
Aceton fraktioniert gef'a'llt. Die Aminopeptidase scheidet sich bei Zusatz. von
35 bis-55 Volumen.% Aceton ab. Ausbeute 2,4 ß aus 7 g.. Spezifische Aktivität E
= 644/g Präparat. Aktivitätsausbeute 63 @. , Zur ehromatographisehen Reinigung wurde
ein 50 cm langes Glasrohr von,2 cm Durchmesser mit DEAE-Cellulose, die in m/15 Phosphatpuffer
PH 7,6 äquilibiert worden war, bis zu einer Höhe von --40 cm gefällt, eine Lösung
von l g der hitze.
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behandelten Peptidase in 40 ml des gleichen Puffers gelöste-und
mit
einem m/15 Phosphatpuffer,-dem 0,05 Mol/1 NaCl zugesetzt worden waren, eluiert.
Inaktives Protein und . andere Verunreinigungen werden zwischen 100 und 200 ml eluiert
oder bleiben an der Säule fixiert. Die,Peptidase erscheint im Eluat zwischen 200
und 400 ml. Diese Fraktionen wurden dialysiert und nach Zugabe von 10 % des Volumens
an m/15 Phosphatpuffer pH 7,6 lyophilisiert. Die so erhaltene Aminopeptidase war
elektrophoretiseh einheitlich. Die spezifische Aktivität betrug E = 6300/g Protein.
Aktivitäts. ausbeute im Eluat 63 @, Beispiel 2:
Die Aufarbeitung eines Kulturfiltrates
(1.550 ml) von Asp. parasitiaus erfolgteanalog dem ersten Beispiel mit dein Unterschied,
daß bei der fraktionierten Acetonfällung die Aminopeptidase zwischen 35 und 50 %
Aceton abgeschieden wurde. Nach der ebenfalls analogen Hitzebehandlung wurden 1,15g
eines Präparates mit E = 950/g erhalten. Die Aktivitäts.-ausbeute, bezogen auf das
Kulturfiltrat, betrug 82 g@.
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Zur weiteren Reinigung wurde an DEAE-Sephadex A 50 chromatographiert.
Das mit m/15 Phosphatpuffer pH 7,6 äquilibierte Dextrangel wurde in ein Glasrohr
von 2 cm Durchmesser 40 cm hoch eingefüllt. Aufgegeben wurden 1,0 g der htzebehandelteh
Peptidase, gelöst in 30 ml Phosphatpuffer. Elüiert wurde zunächst mit 550 m1 m/15
Phosphatpuffer pH 7,6 und an. schließend mit einem Kochsalzgradienten, wobei in
300 ml m/15 Phosphatpuffer eine 1 m Natriumehloridlösung kontinuier. lieh eingetropft
und gemischt wurde. Die Peptidase-wird nach einem Gesamtelutionsvolumen von 700
bis 800 ml Im Bluat erhalten, dialysiert und unter Zusatz von 10 % des Volumens.
| an m/.15 Phosphatpuffer pH 7,6 lyophilisiert. Die spezifische |
| Aktivität der elektrophoretisch einheitlichen Aminopeptidase |
| betrug E = 4000/g Protein. Aktivitätsausbeute im Eluat 56. |
| Anmerkung |
| Zur Verfolgung der Anrei^herung wurde.die enzymatische |
| Aktivität der Aminopeptidase mit L-Leucin-p@nitranilid |
| als Substrat in 1,66 ° 10-3 molarer Lösung,-bei-30 o und |
| pH 8,0 nach Tuppy gemessen.. Als Einheft (E) der enzymatischen |
| Aktivität gilt diejenige Menge an Substrat in /uMol, die pro |
| Minute gespalten wird: |