DE1442144A1 - Verfahren zur Herstellung einer L-Leucinamid,Hypertensin und Oxytocin spaltenden Aminopeptidase - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung einer L@Leucinamid, Hypertensin und Oxytocin spaltenden Aminopeptidase Aus Arbeiten von T. Akatsuka und M. Sato (Bull. Arg..Chem. Soe. Japan, 22, 465 bis 474 (1959)* und 27, 71 bis 75 (1963) ) ist bekannt, daß verschiedene Aspergillus-Arten, die auf einem Nährboden aus Magermilch und Glukose gezüchtet werden, neben anderen Proteasen auch eine Aminopolypeptidase erzeugen. Diese spaltet zwar L..Leucyl-glycyl»glycin, jedoch weder L--Leucinamid noch L-Leucyl.glycin.
• Es wurde nun gefunden, daß Stämme aus verschiedenen Aspera gillus-Gruppen, darunter die für die technische Herstellung von Proteasen bekannten Stämme, Aspergillus oryzae, sojae, prasiticus, melleus und Asp. flavus, eine Aminopeptidase erzeugen, die weder mit der von Akatsuka und Sato isolierten noch mit der aus Schweinenieren gewonnenen Leucinamino#. peptidase (The Enzymes Editors Boyer, Lardy and Myrbäck Academie Press, New York and London, h, 37 bis 62, 196O) identisch ist. Die Isolierung dieser bisher nicht beschriebenen Aminopeptidase ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Aus Aspergillusstämmen werden jene Varianten ausgewählt' mit deren Ehzymen eine Spaltung von L-Leucin-p-nitranilid und L-Cystin-bis@p-nitranilid bei der Durchführung des von Tuppy et a1. beschriebenen Tests (Hv Tuppy, U. Wiesbauer und E. Wintersberger: Hoppe-Seglers Zeitschrift für physiologische Chemie, 32 , 278 bis 288 (1962) ) erzielt wird. Für die technische Gewinnung von Proteasen werden bekanntlich. in erster Linie Aspergillus parasiticus, Asp. oryzae, Asp. melleus und Asp. flavus verwendet.'Die im Sinne der vorliegenden Erfindung auszuwählenden Aspergillus-Varianten gehören in der Regel zu diesen Stämmen, wobei die Spezifität gegenüber aminoendständigem L-Leucin bei der von Aspergillus parasiticus erzeugten Aminopeptidase besonders stark ausgeprägt ist. ° . Aus dem Kulturfiltrat-der nach dem genannten Gesichtspunkt ausgewählten Aspergilli wird in an sich bekannter Weise durch fraktionierte Lösungsmittelfällung die zu isolierende Aminopeptidase zusammen mit anderen Peptidasen und Proteinasen abgeschieden und durch Zentrifugieren oder Filtrieren von der Flüssigkeit getrennt. Die Technik des Fällens ist den -nachstehenden Beispielen zu entnehmen. Das erhaltene Enzymgemisch wird in Wasser gelöst und nach Zusatzeines Kobalt.. salzes mindestens 1 Stunde auf 60o erhitzt. Es muß als .
• überraschend bezeichnet werden, daß zwar erwartungsgemäß alle Begleitenzyme der zu isolierenden Aminopeptidase bei einer so--langen Erwärmung inaktiviert werden, das gesuchte Enzym jedoch in aktiver Form erhalten bleib t._Es kann aus der wäßrigen Lösung durch Aussalzen oder durch Lösungsmittelfällung isoliert und als Rohprodukt zur Durchführung tech@-. -nischer Prozesse verwendet werden. Die Re3@ndarstellüng eines, elektrophoretisch einheitlichen Produkts, das z. B. dia.-gnostischen oder therapeutischen Zwecken dienen soll, kann- -in an sich-bekannter Weise chromatographisch, z. R..-an Cellul.ose- oder Dextrangelaustauschern mit ,funktionellen Gruppen, wie Diäthylaminoäthyl,-Gruppen,..erfolgen.
• Die beschriebene-Arbeitsweise hat den Vorteil, daß mit der fraktionieren Lösungsmittelfägliung eine Anreicherung der zu isolierenden Aminopeptidase erreicht wird und gleich zeitig bei der Fällung noch in Lösung bleibende Prdteasen anschließend gewonnen werden können. Es ist grundsätzlich möglich, auf die zur Anreicherung durchgeführte Fällung zu verzichten, d, h. dem Kulturfiltrat unmittelbar ein Kobaltsalz zuzusetzen und alle in Lösung befindlichen Enzyme bis auf die zu isolierende Aminopeptidase thermisch zu inaktivieren. --In diesem Vorgehen ist aufgrund wirtschaftlicher Überlegungen eine verschlechterte Ausführungsform des Anmeldegegenstands zu sehen; sie soll ausdrücklich vom nachgesuchten Schutz mitumfaßt werden.
• Im Gegensatz zu der von Akatsuka und Sato isolierten Amino. peptidase spaltet das erfindungsgemäß hergestellte Enzym L.-Leueinamid. Außer diesem für .die Unterscheidung wesentlichen Kennzeichen weist die aufgefundene Aminopeptidase ein technisch bzw. pharmakologisch ausnutzbares Spaltvermögen für das wehenerregende Hormon Oxytocin und für das blutdrucksteigernde Angiotensin II auf, d. h. diese physiologisch bedeutsamen Polypeptide können, wenn dies aus medizinischen Gründen erforderlich ist, durch Geben der erfindungs-. gemäß hergestellten Aminopeptidase inaktiviert, d. h. es kann in vivo ein Mechanismus in Gang gesetzt werden" den sonst nur hochspezifische, körpereigene Enzyme oder Enzym systeme auslösen. Die Wirkung gegenüber Oxytocin konnte am isolierten Rattenuterus und die Wirkung gegenüber Angiotensin II sowohl in vitro am reinen Polypeptid als auch in vivo an der spinalisierten Katze nachgewiesen werden. Die-erfindungsgemäß hergestellte Aminopeptidase kann weiterhin zur Sequenzanalyse oder auch zum Abbau von Polypeptiden im präparativen Maßstab verwendet werden. Zusammen mit Proteinasen ist sie zum Abbau von Proteinen bis zu niedermolekularen Peptiden oder Aminosäuren geeignet. Beispiel 1: 10 1 Kulturfiltrat einer-technischen Züchtung von Asp. oryzae wurden,,innerhalb von 30 Minuten bei 0 bis 50 unter Rühren mit dem gleichen Volumen an vorgekühltem Aceton versetzt und nach weiteren 30 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde mehrmals mit 50-öigem-wäßrigem-Aceton -und zuletzt mit reinem Aceton gewaschen und an der Luft getrocknet. Ausbeute 69 gw Dieses Produkt wurde sogleich in 1,4 1 dest. Wasser weitgehend gelöst, bei 0 0 unter Rühren zunächst mit 600 ml Aceton inaktives Produkt gefällt und zusammen reit den ungelösten Anteilen- abzentrifugiert: Zur klaren Lösung wurden weitere 550 ml Aceton gegeben, der Niederschlag durch Zentrifugieren abgeschieden und mit Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen $ g Ausbeute mit einer spezifischen Aktitität von E = 350/g Präparat.- Aktivitätsausbeute 89 %, bezogen.auf den Kultursaft.
• Von diesem vorgereinigten Aminopeptidase-Präparat wurde nun eine 1- ö-ige Lösung in. 10M3 molarer Kobaltaeetatlösung her.» gestellt und zur Entfärbung etwas Aktivkohle zugesetzt. Diese Lösung wurde-im Wasserbad 90 Minuten auf 60° erhitzt, auf 0 bis 5 0 abgekühlt und, ähnlich wie im vorigen Absatzbeschrieben, mit Aceton fraktioniert gef'a'llt. Die Aminopeptidase scheidet sich bei Zusatz. von 35 bis-55 Volumen.% Aceton ab. Ausbeute 2,4 ß aus 7 g.. Spezifische Aktivität E = 644/g Präparat. Aktivitätsausbeute 63 @. , Zur ehromatographisehen Reinigung wurde ein 50 cm langes Glasrohr von,2 cm Durchmesser mit DEAE-Cellulose, die in m/15 Phosphatpuffer PH 7,6 äquilibiert worden war, bis zu einer Höhe von --40 cm gefällt, eine Lösung von l g der hitze.
• behandelten Peptidase in 40 ml des gleichen Puffers gelöste-und mit einem m/15 Phosphatpuffer,-dem 0,05 Mol/1 NaCl zugesetzt worden waren, eluiert. Inaktives Protein und . andere Verunreinigungen werden zwischen 100 und 200 ml eluiert oder bleiben an der Säule fixiert. Die,Peptidase erscheint im Eluat zwischen 200 und 400 ml. Diese Fraktionen wurden dialysiert und nach Zugabe von 10 % des Volumens an m/15 Phosphatpuffer pH 7,6 lyophilisiert. Die so erhaltene Aminopeptidase war elektrophoretiseh einheitlich. Die spezifische Aktivität betrug E = 6300/g Protein. Aktivitäts. ausbeute im Eluat 63 @, Beispiel 2: Die Aufarbeitung eines Kulturfiltrates (1.550 ml) von Asp. parasitiaus erfolgteanalog dem ersten Beispiel mit dein Unterschied, daß bei der fraktionierten Acetonfällung die Aminopeptidase zwischen 35 und 50 % Aceton abgeschieden wurde. Nach der ebenfalls analogen Hitzebehandlung wurden 1,15g eines Präparates mit E = 950/g erhalten. Die Aktivitäts.-ausbeute, bezogen auf das Kulturfiltrat, betrug 82 g@.
• Zur weiteren Reinigung wurde an DEAE-Sephadex A 50 chromatographiert. Das mit m/15 Phosphatpuffer pH 7,6 äquilibierte Dextrangel wurde in ein Glasrohr von 2 cm Durchmesser 40 cm hoch eingefüllt. Aufgegeben wurden 1,0 g der htzebehandelteh Peptidase, gelöst in 30 ml Phosphatpuffer. Elüiert wurde zunächst mit 550 m1 m/15 Phosphatpuffer pH 7,6 und an. schließend mit einem Kochsalzgradienten, wobei in 300 ml m/15 Phosphatpuffer eine 1 m Natriumehloridlösung kontinuier. lieh eingetropft und gemischt wurde. Die Peptidase-wird nach einem Gesamtelutionsvolumen von 700 bis 800 ml Im Bluat erhalten, dialysiert und unter Zusatz von 10 % des Volumens.

  an m/.15 Phosphatpuffer pH 7,6 lyophilisiert. Die spezifische

  Aktivität der elektrophoretisch einheitlichen Aminopeptidase

  betrug E = 4000/g Protein. Aktivitätsausbeute im Eluat 56.

  Anmerkung

  Zur Verfolgung der Anrei^herung wurde.die enzymatische

  Aktivität der Aminopeptidase mit L-Leucin-p@nitranilid

  als Substrat in 1,66 ° 10-3 molarer Lösung,-bei-30 o und

  pH 8,0 nach Tuppy gemessen.. Als Einheft (E) der enzymatischen

  Aktivität gilt diejenige Menge an Substrat in /uMol, die pro

  Minute gespalten wird:

Claims (3)

1. Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung einer L-Leucinamid, Hypertensin und Oxytocin spaltenden Aminopeptidase aus dem Kultur-' Filtrat von für die Gerinnung von Protea$en bekannten Aspergillus-Arten durch Ausfällen mit Lösungsmitteln oder Aussalzen, gegebenenfalls durch.anschließende Rein-. darstellung auf ehromatographisehem Wege, dadurch gekennzeichnet, daB aus Aspergilli solche Varianten ausgewählt werden, deren Enzyme L-Leueinamid und nach dem von Tuppy et a1. beschriebenen Test L.Leucin-p-nitranilid und L-Cystin-.bis.-p..nitranilid spalten, aus dem Kulturfiltrat dieser ausgewählten Aspergilli durch fraktionierte Lösungsmittel.. -fällung oder durch fraktioniertes Aussalzen ein Gemisch aus Peptidasen und Proteinasen ausgefällt, der Niederschlag abgeschieden, in Wasser aufgelöst, nach Zusatz eines Kobaltsalzes mindestens 1 Stunde-auf 600 erhitzt und die gesuchte Aminopeptidase in an sieh bekannter Weise aus der wäBrigen Lösung isoliert wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß, die gewonnene Roh-Aminopeptidase auf ehromatographischem Wege als elektrophonetisch einheitliches Produkt hergestellt wird.
3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukt das Kulturfiltrat von zu Asp. parasiticus, Asp. oryzae, Asp. melleus und Asp. flavus gehörenden Aspergilli-Varianten verwendet wird.