DE1298100B

DE1298100B - Verfahren zur Herstellung von N-Gentamycinomethyltetracyclinen

Info

Publication number: DE1298100B
Application number: DEM66209A
Authority: DE
Inventors: Dr Helmut; Hepding; Dr Ludwig; Rogalski; Wahlig; Dr Werner
Original assignee: E Merck AG
Current assignee: Merck KGaA
Priority date: 1965-08-04
Filing date: 1965-08-04
Publication date: 1969-06-26
Also published as: US3510555A; GB1073213A; ES329851A1; CH472437A; FR5510M

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotica.

Es wurde gefunden, daß man wertvolle neue Antibiotica erhält, wenn man das Antibioticum Gentamycin (vgl. Science 1964, S. 772) in an sich bekannter Weise mit Tetracyclin oder einem seiner Derivate und mit Formaldehyd umsetzt. Die erhaltenen N-Gentamycinomethyltetracyclinderivate sind wertvolle neue Produkte. An sich hätte angenommen werden müssen, daß das pentamycin als bakterizide Substanz und Tetracyclin bzw. seine Derivate als bakteriostatisch wirkende Verbindungen einen antagonistischen Effekt zeigen würden (vgl. Arch. Int. Med. Bd. 90, 1952, S. 301, und Chemotherapia, Bd. 8, 1964, S. 21).

überraschenderweise weisen jedoch die neuen, nach der Erfindung erhaltenen Produkte einen solchen Antagonismus nicht auf. Sie besitzen im Gegenteil die volle Wirksamkeit der eingesetzten Antibiotica und lassen sogar bei verschiedenen Bakterienstämmen eine Wirkungssteigerung erkennen. Das antibakterielle Spektrum dieser neuen Verbindungen ist außerdem sowohl gegenüber dem des Tetracyclins und seiner Derivate als auch gegenüber demjenigen des Gentamycins erweitert, wie folgende Vergleichsversuche zeigen.

Die folgenden Verbindungen sind getestet worden:

Tetracyclin,
Gentamycin,

Gentamycino-imethyltetracyclin) (I), Gentamycino-bis-fmethyltetracyclin) (II), Gentamycino-tri-fmethyltetracyclin) (III).

Der ungefähre Gehalt an Tetracyclin (T) und Gentamycin (G) in diesen Verbindungen beträgt:

I: TzuG = 1:1,
. II: TzuG = 2:1,

III: TzuG = 3:1.

A. In-vitro-Teste

Die Verbindungen wurden im Röhrchenverdünnungstest (Difco Penn Assay Broth) auf ihre Wirksamkeit gegen eine Anzahl pathogener Bakterien getestet. In der folgenden Tabelle 1 wird die Mindesthemmkonzentration in j</ml für eine Reihe der Testverbindungen angegeben. Mit »Total« ist ihre Wirksamkeit bezeichnet, während T und G die von den einzelnen Bestandteilen entsprechend ihrem Gehalt in den getesteten Verbindungen zur Gesamtwirkung beigesteuerten Wirksamkeiten bezeichnen.

Obwohl die absolute Hemmkonzentration nicht in allen Fällen unter derjenigen der Vergleichssubstanzen Tetracyclin und Gentamycin liegt, geht doch aus den Zahlen ein Anstieg der Wirksamkeit der Testverbindungen hervor, da der Anteil der einzelnen Antibiotica an diesen Testverbindungen berücksichtigt werden muß. So ist z. B. die Wirksamkeit des Bestandteils G (Gentamycin) in Verbindung I, die zur Gesamtaktivität von I beigesteuert wird, merklich erhöht im Hinblick auf die bei Gentamycin allein beobachtete Wirksamkeit. Niedrige Werte bezeichnen hier eine verbesserte Wirksamkeit, da niedrige Konzentrationen einen stärkeren Hemmeffekt bedeuten.

Tabelle 1 Mindesthemmkonzentration (y/ml)

Bakterien	Tetra cyclin	Genta mycin	Total	I T	G	Total	II T	G	Total	III T	G
Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa	64 4 64	2,5 2,5 10	2 2 8	1 1 4	1 1 4	8. 2 32 ν	5,3 1,35 '21.3	2,7 0,67 10,7	4 4 16	3 3 12	1 1 4
Proteus vulgaris

50

B. In-vivo-Teste (Tierversuche)

Die chemotherapeutischen Versuche wurden an der Maus durchgeführt. Methodik und Auswertung erfolgte entsprechend den Angaben in Arzneimittelforschung, Bd. 16, 1966, S. 1 bis 11. .

Die Tabelle 2 gibt die Ergebnisse dieser Untersuchungen wieder sowie die erhöhte Wirksamkeit der entsprechenden Antibiotica in der neuen Verbindung II, die im Hinblick auf die Verabreichung der einzelnen Antibiotica gesteigert ist.

In Tabelle 2 wird die DC₅₀, d. h. die »Dosis curativa 50«, angegeben, die die Mindestmenge angibt,

Bakterien

Strept. pyog. haemolyt.

Pneumoc. mucos

Salm. chol. suis

Proteus vulgaris

	Tabelle 2

racycltn	DC₅₀ in g/kg
0,13	Gentamycin
0,11	0,057
0,05	0,016
0,046	0,0146
0,0215

die nötig ist, um in 50% der Tiere einen Heilerfolg zu erzielen. Die Bezeichnungen »Total, T und G« entsprechen den für Tabelle 1 angegebenen Definitionen.

Die folgenden pathogenen Bakterien wurden verwendet:

Streptococcus pyogenes haemolyticus, Pneumococcus mucosus,
Salmonella chol. suis,
Proteus vulgaris.

Die Verabreichung erfolgte subcutan.

Total

0,066
0,017
0,013
-0,03

II	G
T	0,022
0,044	0,0056
0,0112	0,0043
0,0086	0,01
0,02

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von N-Gentamycinomethyltetracyclinen. das darin besteht, daß man Gentamycin mit 1 bis 4 Mol Tetracyclin oder einem seiner Derivate und 1 bis 4 Mol Formaldehyd in an sich bekannter Weise zu dem entsprechenden Aminomethyltclracyclin umsetzt und das erhaltene Reaktionsprodukt gewünschtenfalls in üblicher Weise in ein Säureadditionssalz mit physiologisch unbedenklichen Säuren überführt.

Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können aus jeder Tetracyclinverbindung vier verschiedene Produkte erhalten werden, und zwar jeweils ein Gentamycinomono-, -bis-, -tri- und -tetra-(methyltelracyclin). Die neuen Verbindungen unterscheiden sich vor allem durch ihre verschiedene Löslichkeit. Die Löslichkeit ist vornehmlich abhängig von der Anzahl der an 1 MoI Gentamycin gebundenen Mole der schwerer löslichen Tetracyclinverbindungen. Für die pharmazeutische Anwendung werden im allge- ^o meinen die leichter löslichen Mono- und Bisverbindungen bevorzugt. Die Verknüpfung zwischen dem Tetracyclinmolekül und dem Gentamycin erfolgt zwischen dem Stickstoff der Carboxamidgruppe des Tetracyclins und einer oder mehreren Amino- ^s gruppen des Gentamycins über eine Methylengruppe. Zur Herstellung der neuen Verbindungen kann sowohl Tetracyclin selbst (als Base oder als Säureadditionssalz) sowie alle Tetracyclin-Derivate, z. B. 7-Chlortetracyclin, 5-Oxytetracyclin, Desmethyltelra- .!o cyclin sowie die Isomeren und Anhydroverbindungen dieser Substanzen, eingesetzt werden.

Auch das Gentamycin kann als Base oder in Form seiner Säureadditionssalze eingesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt mit 1 bis 4 MoI Tetracyclin bzw. eines seiner Derivate und mit 1 bis 4 Mo! Formaldehyd. Im allgemeinen wird man nur eines der beiden Antibiotica in Form eines Säureadditionssalzes einsetzen.

Die Umsetzung erfolgt unter den üblichen Bedingungen einer Mannich-Reaktion. Der zur Aminomethylierung erforderliche Formaldehyd kann sowohl in gelöster als auch in fester (polymerer) Form angewendet werden. Als Lösungsmittel für den Formaldehyd kann sowohl Wasser als auch ein organisches Lösungsmittel, insbesondere Methanol, dienen. Im allgemeinen wird man der Einfachheit halber die üblichen 35%igen wäßrigen Formaldehydlösungen verwenden. Die Menge des für das Verfahren nach der Erfindung zuzusetzenden Formaldehyds (1 bis 4 Mol) richtet sich selbstverständlich nach der Menge der eingesetzten Tetracyclinverbindung (1 bis 4 Mol). Die Kondensation zwischen Tetracyclin bzw. einem seiner Derivate, Gentamycin und Formaldehyd erfolgt entweder in einem alle drei Reaktionskomponenten lösenden Lösungsmittel oder auch in Suspension. Geeignete Lösungsmittel sind z. B. Alkohole, insbesondere Methanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, tertiäres Butanol, cyclische Äther, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, oder auch andere organische Lösungsmittel, wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxyd. Die Reaktion kann sowohl bei Zimmertemperatur als auch bei erhöhten Temperaturen bis zum Siedepunkt des verwendeten Lösungsmittels durchgeführt werden.

Die erhaltenen Verbindungen können anschließend in an sich bekannter Weise in Säureadditionssalze übergeführt werden. Für diese Umsetzung kommen vor allem solche Säuren in Frage, die physiologisch unbedenkliche Salze liefern. So können organische und anorganische Säuren, wie aliphatische, alicyclische, araliphatische, aromatische oder heterocyclische ein- oder mehrbasische Carbon- oder Sulfonsäuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Diäthylessigsäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Pimelinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Aminocarbonsäuren, Benzoesäure, Salicylsäure, Pheny!propionsäure. Citronensäure, Gluconsäure, Ascorbinsäure, Zimtsäure oder Halogenwasserstoffsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, verwendet werden. Diese Säureadditionssalze besitzen im allgemeinen eine bessere Löslichkeit als die entsprechenden Basen.

Die neuen Verbindungen können mit allen üblichen Träger- und Hilfsstoffen zu pharmazeutischen Zubereitungen verarbeitet werden. Diese rollen als Antibiotica in der Veterinär- und Humanmedizin Anwendung finden. Dosis und Anwendungsform weichen im allgemeinen nicht wesentlich von den für die zugrunde liegenden Antibiotica gebräuchlichen ab.

Beispiel 1

6,0 g Gentamycinbase werden in 10 ml Methanol mit 1,3 g einer 35%igen wäßrigen Formaldehvdlösung versetzt. Diese Lösung bleibt 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Sodann wird sie langsam zu einer Lösung von 6,54 g Tetracyclinba^c in 50 ml Isopropanol gegeben. Es wird noch 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und anschließend vom ausgefallenen Kristallisat abgesaugt. einmal mit Isopropanol und mehrmals mit absolutem Äther gut gewaschen und bei 45 C unter vermindertem Druck getrocknet. Es werden 9,8 g (77% der Theorie) des (Gentamycinomono^methyltetracyclins) in Form eines gelben Kristallpulvers erhalten, das sich oberhalb 185 C langsam zu zersetzen beginnt. Das Reaktionsprodukt ist sehr leicht löslich in Wasser, wobei seine Löslichkeit über 1,9 g/ml bei Raumtemperatur liegt. Der pH-Wert einer 2%igen wäßrigen Lösung beträgt 8,4 bis 8,6. [>]?'~ -60,7 (in η 10 methanolischer Salzsäure).

N-Analyse für C₄₀H₃₈N₂O₁₅:
Berechnet: N 9,74%; gefunden: N 10,0",,.

Beispiel 2

Zu einer Lösung von 10,9 g Tetracyclinbase in 130 ml Isopropanol gibt man ein Gemisch von 5,0 g Gentamycinbase und 2,17 g einer 35%igen wäßrigen Formaldehydlösung in 30 ml Isopropanol. Anschließend wird das Gemisch noch 2 Stunden bei Raumtemperatur und unter Stickstoff weitergerührt und sodann das ausgefallene Produkt abgesaugt. Dieses wird einmal mit Isopropanol und mehrmals mit absolutem Äther gründlich gewaschen und bei 45 C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 15,5 g (96% der Theorie) eines blaßgelben Kondensationsproduktes, das aus 2 Mol Tetracyclin und 1 Mol Gentamycin besteht. Das Gentamycino-bis-(methyltetracyclin) zersetzt sich oberhalb 185 C. Es ist noch verhältnismäßig gut wasserlöslich (etwa 600 mg/ml bei Raumtemperatur). Der pH-Wert einer 2%igen wäßrigen Lösung liegt bei 7,3 bis 7,4 [α]? 111,9° (in n/K) methanolischer Salzsäure).

Zusammensetzung: C₆₃H₈₂N₈O₂₁.

Beispiel 3

Eine Mischung aus 5 ml Methanol, 4,06 g Gentamycinbase und 2,65 g einer 35°/_oigen wäßrigen Formaldehydlösung wird langsam zu einer Lösung von 13.29 g Tetracyclinbase in 150 ml Isopropanol gegeben. Es wird noch 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoff weitergerührt und anschließend der Niederschlag abgesaugt. Dieser wird mit Isopropanol und mehrmals mit absolutem Äther gut gewaschen und bei 45 C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 14,4 g (81° „ der Theorie) eines blaßgelben kristallinen Produktes. Das Gentamycino-tri-(methylteträcyclin) zersetzt sich oberhalb 185 C. [.It]O" ~ —140,8 (in η H) methanolischer Salzsäure).

Das Reaktionsprodukt ist im Vergleich zum Mono- und Bis-Produkt kaum noch in Wasser löslich (etwa 4 mg ml bei Raumtemperatur). Der pH-Wert einer 0.2°/_oigen wäßrigen Lösung liegt bei 7,2 bis 7,3.
N-Analyse für Q₆H₁(K₁Ni₀O₃₁:

Berechnet: N 7.88°„: gefunden: N 7,50"„.

Bei

sp

iel 4

IO

Zu einer Lösung von 4,44 g Tetracyclinbase in 60 ml Isopropanol gibt man ein Gemisch von 1,01 g Gentamycinbase und 1,1 ml einer 35%igen wäßrigen Formaldehydlösung in 20 ml Isopropanol. Anschließend wird das Gemisch noch 3 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und sodann das ausgefallene Kondensationsprodukt abgesaugt. Dieses wird einmal mit Isopropanol und mehrmals mit absolutem Äther gewaschen und bei 45° C unter vermindertem Druck getrocknet. Das Produkt zersetzt sich ab 185" C. Ausbeute: 5,4 g (94% der Theorie). Zusammensetzung: C₁₀₉Hi₃₀N₁₂O₃₉;
Molekulargewicht: 2232,34.

Claims

Patentanspruch :

Verfahren zur Herstellung von N-Gentamycinomethyltctracyclinen, dadurch gekennzeichnet, daß man Gentamycin mit 1 bis 4 Mol Tetracyclin oder einem seiner Derivate und 1 bis 4 Mol Formaldehyd in an sich bekannter Weise zu dem entsprechenden Aminomelhyltetracyclin umsetzt und das erhaltene Reaktionsprodukl gewünschtenfalls in üblicher Weise in ein Säureadditionssalz mit physiologisch unbedenklichen Säuren überführt.