DE1278440B - Verfahren zur Herstellung von Aquocobalamin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C07d

Deutsche KL: 12 ρ -10/05

Nummer: 1278 440

Aktenzeichen: P 12 78 440.6-44 (G 35228)

Anmeldetag: 15. Juni 1962

Auslegetag: 26. September 1968

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aquocobalamin durch Umsetzung von Cyanocobalamin mit Sulfitionen in wäßriger Lösung, Umsetzung des erzeugten Sulfitocobalamins mit Nitritionen und Überführung des erhaltenen Nitritocobalamins mit einer salpetrigen Säure zersetzenden Verbindung in Aquocobalamin.

Bei der Herstellung von Cobalamin durch Fermentation wird als Substanz normalerweise Cyanocobalamin erzeugt. Nun wurde jedoch in letzter Zeit gefunden, daß Aquocobalamin für medizinische Anwendungen sehr geeignet ist, so daß die Herstellung dieser Substanz an Stelle von Cyanocobalamin wünschenswert erscheint. Die direkte Herstellung von Aquocobalamin durch Fermentation ergibt jedoch Schwierigkeiten, insbesondere im Hinblick auf die Isolierung der Substanz aus dem Fermentationsmedium, so daß es vorzuziehen ist, zuerst Cyanocobalamin herzustellen und dieses dann in Aquocobalamin zu überfuhren.

Es wurde bereits vorgeschlagen, Cyanocobalamin durch Reduktion in Aquocobalamin zu überführen, und zwar entweder durch Hydrieren oder durch chemische Reduktion, gefolgt von einer Rückoxydation, jedoch ergeben solche Verfahren nur verhältnismäßig schlechte Ausbeuten, da sie von unerwünschtem Abbau der gewünschten Substanz begleitet sind. Es wurde auch bereits vorgeschlagen, die gewünschte Umwandlung dadurch zu bewirken, daß man Cyanocobalamin sichtbarem Licht unter schwachsauren Bedingungen unter gleichzeitigem Belüften aussetzt. Diese Umwandlung ist jedoch langsam und unzweckmäßig für die Anwendung im technischen Maßstab. Auch findet dabei gern ein unerwünschter Abbau statt.

Aus Biochem. J., 52, 1952, S. 384 bis 387 und 389 bis 395, ist bereits ein Verfahren bekannt, nach dem Vitamin B₁₂ (Cyanocobalamin) zuerst mit Sulfit

und anschließend mit Nitrit behandelt wird, wobei das entstehende Vitamin B_{12 c} (Nitritocobalamin) dann mit Sulfaminsäure behandelt und das entstehende Vitamin B_12d (Aquocobalamin, Vitamin B₁₂₆) anschließend aufgearbeitet wird. Dabei sind in dieser Literaturstelle jedoch keine genauen Angaben zu den darin angewendeten Verfahrensbedingungen enthalten, insbesondere sind weder die für die Anfangsstufen bevorzugten Bedingungen noch die für die Endstufe der Umsetzung mit Sulfaminsäure bevorzugten pH-Bedingungen angegeben. Das in der ersten Stufe gebildete Sulfitocobalamin wird bei einem pH 3 durch Erhitzen mit Säure teilweise in das auf dieser Stufe unerwünschte Aquocobalamin umgewan-Verfahren zur Herstellung von Aquocobalamin

Anmelder:

Glaxo Laboratories Limited,

Greenford, Middlesex (Großbritannien)

Vertreter:

Dr. F. Zumstein, Dr. E. Assmann

und Dr. R. Koenigsberger, Patentanwälte,

8000 München 2, Bräuhausstr. 4

Als Erfinder benannt:

Ernest Lester Smith, North Harrow, Middlesex

(Großbritannien)

Beanspruchte Priorität:

Großbritannien vom 16. Juni 1961 (21 904)

delt, wodurch eine Mischung aus Sulfitocobalamin und Aquocobalamin entsteht, deren Auftrennung in die Einzelbestandteile mit außerordentlichen Schwierigkeiten verbunden ist. Dieses Verfahren, das außerdem nur geringe Ausbeuten liefert, ist deshalb zur Anwendung in technischem Maßstab nicht geeignet.

Aus der USA.-Patentschrift 2 721162 ist bereits die Umsetzung von Cyanocobalamin mit Bisulfiten zu Sulfitocobalamin bekannt. Auch darin ist jedoch nirgends die Einhaltung bestimmter pH-Bereiche während der Umsetzung geoffenbart.

Der Zweck der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein Verfahren zur Umwandlung von Cyanocobalamin in Aquocobalamin zu schaffen, das bequem im technischen Maßstab anzuwenden ist und bei dem weniger die Gefahr eines Abbaues besteht.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß Cyanocobalamin auf verbesserte Weise in Aquocobalamin übergeführt werden kann, wenn man das Cyanocobalamin zuerst in Sulfitocobalamin überführt, dieses in Nitritocobalamin umwandelt und letzteres dann in das gewünschte Aquocobalamin überführt. Solche Umwandlungen können unter nur geringem Abbau des Cobalamins und in ausgezeichneter Aus-

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beute vorgenommen werden. Nach dem erfindungs- fitocobalamin kann in 6 bis 8 Stunden zu Ende gegemäßen Verfahren können Gesamtausbeuten an führt werden. Am Ende der Umwandlung wird der Aquocobalamin von bis zu 95% erzielt werden. größte Teil des Überschusses an Schwefeldioxyd ent-

Obwohl bereits eine Anzahl von Verfahren zur fernt, indem ein Strom eines inerten Gases durch Herstellung von Aquocobalamin bekannt ist, konnten 5 die Reaktionsmischung geblasen wird, bisher niemals derart hohe Ausbeuten wie bei dem Die Umwandlung von Sulfitocobalamin in Nitrito-

erfindungsgemäßen Verfahren erzielt werden. Es cobalamin wird wiederum in wäßriger Lösung unter war überraschend und aus dem bisherigen Stand der sauren Bedingungen bewirkt, wobei ein pH-Wert von Technik nicht zu entnehmen, daß das erfindungs- weniger als 1 vermieden wird. Der pH-Wert wird gemäße 3-Stufen-Verfahren insgesamt wirksamer io zwischen etwa 1 und 4 gehalten. Die Reaktion kann sein würde als eines der bereits bekannten Verfahren durch Behändem einer wäßrigen Lösung des Sulfito- und zu einer derart hohen Ausbeutesteigerung führen cobalamins mit einem wasserlöslichen Nitrit, beiwürde, spielsweise einem Alkalinitrit wie Natrium- oder Das erfindungsgemäße Verfahren ist nun dadurch Kaliumnitrit, und einer Säure, vorzugsweise einer gekennzeichnet, daß man Cyanocobalamin bei nor- 15 schwachen Säure, wie einer aliphatischen Carbonmaler Raumtemperatur oder darunter in wäßriger säure, z. B. Essigsäure, Propionsäure u. dgl. durchLösung bei einem pH-Wert von etwa 1 bis 4 mit geführt werden. Der Anteil der verwendeten Säure einem mehrfach molaren Überschuß an Sulfitionen übersteigt vorzugsweise den Anteil des verwendeten versetzt und einen Luft- oder Inertgasstrom durch- Nitrits, bezogen auf molare Basis, leitet, dann auf die so entstandene Lösung des SuI- 20 Wahlweise können Stickoxyde, die beispielsweise fitocobalamins bei normaler Raumtemperatur oder durch Umsetzen eines Nitrits mit einer starken Säure darunter und bei einem pH-Wert von etwa 1 bis 4 erzeugt wurden, durch eine wäßrige Lösung des SuI-einen mehrfach molaren Überschuß an Nitritionen fitocobalamins geleitet werden. Bei der Umsetzung einwirken läßt, worauf man dem Nitritocobalamin wird ein Überschuß in Nitritionen verwendet. Die enthaltenden Reaktionsgemisch bei normaler Raum- 25 Umwandlung von Sulfitocobalamin in Nitritocobaltemperatur oder darunter und bei einem pH-Wert amin kann in etwa 6 bis 8 Stunden zu Ende geführt von etwa 1 bis 4 einen mehrfach molaren Überschuß werden. Am Ende der Reaktion kann beim Arbeiten an Harnstoff, Amidosulfonsäure oder Amin zusetzt unter sauren Bedingungen überschüssige salpetrige und einige Stunden einwirken läßt und schließlich Säure entfernt werden, indem ein inertes Gas durch das entstandene Aquocobalamin in bekannter Weise 30 das Reaktionsmedium geblasen wird, isoliert. Die Umwandlung des Nitritocobalamins in Aquo-Bei der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Ver- cobalamin wird durch Umsetzen mit einer im Überfahrens wird das Cyanocobalamin mit Sulfitionen in schuß angewandten Substanz bewirkt, die salpetrige wäßrigen Medien unter sauren Bedingungen umge- Säure zersetzt, wobei die Umsetzung in wäßrigen setzt. Da der Austausch von Sulfitionen mit Cyanid- 35 Medien unter sauren Bedingungen durchgeführt ionen eine reversible Reaktion ist, wird ein beträcht- wird, wobei jedoch pH-Werte von weniger als 1 verlicher Überschuß, beispielsweise die 10 bis 30fache mieden werden müssen. Der pH-Wert wird im Menge (auf Mol-Basis) an Sulfitionen verwendet. Es Bereich von etwa 1 bis 4 gehalten. Harnstoff und werden auch Maßnahmen ergriffen, um die Amidosulfonsäure sind besonders geeignet zur Zer-Cyanidionen (als Cyanwasserstoff) von der Re- 40 Setzung der salpetrigen Säure, jedoch gehören zu aktionszone nach ihrer Freisetzung zu entfernen, in- anderen Substanzen, die beispielsweise verwendet dem man durch das Reaktionsmedium einen Luft- werden können, auch Amine. Amidosulfonsäure ist oder Inertgasstrom leitet. Als inertes Gas kann bei- besonders zweckmäßig. Da bei dieser Verfahrensspielsweise Stickstoff verwendet werden. Die Um- stufe, vor allem bei Verwendung von Amidosulfonsetzung kann beispielsweise durch Behandeln einer 45 säure, das Reaktionsmedium stärker sauer wird wäßrigen Lösung von Cyanocobalamin mit einem (z. B. pH-Wert von 1,5 bis 2,5), ist es im allgemeinen wasserlöslichen Sulfit, beispielsweise einem Alkali- wünschenswert, die Umsetzung so schnell wie mögsulfit wie Natrium- oder Kaliummetabisulfit, und lieh zu beenden, wobei eine Zeit von etwa 2 bis einer Säure und gleichzeitigem Durchblasen eines 3 Stunden üblicherweise genügt, kräftigen Stroms eines inerten Gases durchgeführt 50 Das entstandene Aquocobalamin kann nach werden. Der pH-Wert des Reaktionsmediums darf Wunsch gewonnen und gereinigt werden. So kann nicht unter 1 liegen, um die Gefahr eines uner- es beispielsweise aus dem Reaktionsmedium der wünschten Abbaues zu vermeiden, und daher sollte dritten Stufe durch das bekannte Verfahren der die verwendete Säure vorzugsweise eine schwache g^ Absorption an Aktivkohle, nachfolgendem Eluieren, Säure, wie beispielsweise eine wasserlösliche Carbon- 55 beispielsweise mit wäßrigem Aceton oder durch säure, sein. Der pH-Wert liegt im Bereich von etwa Extraktion mit wäßrigem Phenol, das gewünschten-1 bis 4. Zu geeigneten Säuren gehören insbesondere falls ein weiteres Lösungsmittel, wie Benzol oder aliphatische Carbonsäuren, z.B. Essigsäure, Pro- Tetrachlorkohlenstoff, enthält, und anschließende pionsäure u. dgl. Eine kleine Menge einer starken Rückextraktion in eine wäßrige Phase abgetrennt Säure, wie einer Mineralsäure, beispielsweise Salz- 60 werden. Wahlweise kann, wenn die dritte Stufe des säure oder Schwefelsäure, kann gegen Ende der Verfahrens unter salzfreien Bedingungen durchReaktion zugesetzt werden, um die Vervollständigung geführt wurde, das Reaktionsmedium durch ein der Reaktion zu gewährleisten. basisches Ionenaustauscherharz in der Basenform zur

Wahlweise kann die Reaktion durch Durchleiten Verminderung der Azidität geleitet werden, eines Stroms von Schwefeldioxyd, gewünschtenfalls 65 Eine weitere Reinigung kann durch anschließendes in Mischung mit einem inerten Gas, durch eine Durchleiten durch Diäthylaminoäthyl-Cellulose-Auswäßrige Lösung von Cyanocobalamin bewirkt wer- tauschmaterial bewirkt werden, das zur Entfernung den. Die Umwandlung von Cyanocobalamin in SuI- unerwünschter saurer Abbauprodukte dient.

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Es wurde festgestellt, daß Carboxymethylcellulose Carboxymethylcellulose in der Wasserstofform ge-

und Sulfoäthylcellulose für die Reinigung von leitet. Nach dem Waschen bis die ausfließende

Aquocobalamin besonders geeignet sind, wobei Lösung farblos war, wurde das adsorbierte Aquo-

ersteres zweckmäßiger ist. Diese Substanzen ab- cobalamin mit 0,02 η-Salzsäure eluiert und das Prosorbieren Aquocobalamin in der freien Basenform 5 dukt durch Zugabe von 15 Volumen Aceton zum

aus neutralen salzfreien Lösungen. Anschließendes Eluat kristallisiert. Die Ausbeute betrug 0,36 g. Aus

Eluieren, beispielsweise mit verdünnten Säuren, wie der aus der zweiten Säule ausfließenden Lösung

verdünnter Salzsäure, ergibt ein Material von be- wurden 0,12 g unverändertes Cyanocobalamin

trächtlich gesteigerter Reinheit. zurückgewonnen.

E)as endgültige Kristallisieren des Aquocobalamins io Beisoiel3

kann beispielsweise aus wäßrigem Aceton in be- ^

kannter Weise durchgeführt werden. 250 mg Cyanocobalamin wurden in 62,5 ml Wasser

Die folgenden Beispiele dienen zum besseren Ver- gelöst, und dann wurden 0,428 g Natriummetabisulfit

ständnis der Erfindung, ohne sie jedoch darauf zu und 0,5ml Eisessig zugesetzt. Das Gemisch wurde

beschränken. 15 V* Stunde belüftet, und weitere 0,5 ml Essigsäure wur-

Beispiel 1 ^{den zu}S^esetzt> ™d das Belüften wurde 16 Stunden

fortgesetzt. Dann wurde das Volumen mit Wasser auf

0,5 g Cyanocobalamin und 1 g Kaliummetabisulfit 100 ml aufgefüllt, und 0,125 g Natriumnitrit wurden wurden in 60 ml Wasser gelöst, und 1 ml Eisessig zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht stehenwurde zugesetzt. Insgesamt wurde 6 Stunden lang 20 gelassen. 8 ml einer 25%igen (Gewicht/Volumen) heftig Luft durch die Lösung geblasen und V« Stunde Methylaminlösung wurden zum Gemisch zugegeben, nach Beginn ein zweiter Anteil von 1 ml Essigsäure das über Nacht bei Zimmertemperatur in einer verzugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht im Kühl- schlossenen Flasche stehengelassen wurde. Die sich schrank aufbewahrt. Am nächsten Tag wurde sie auf ergebende Lösung wurde durch Phenol extrahiert Raumtemperatur erwärmt, und es wurden 0,25 g 25 und wieder, wie im Beispiel 1 beschrieben, in Wasser Natriumnitrit zugefügt. Nach 2 Stunden wurden 0,5 g zurückextrahiert. Die wäßrige Lösung wurde mit Sulfaminsäure zugesetzt und die Lösung wurde verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert unter 4 weitere 2 Stunden stehengelassen. angesäuert und dann durch eine Säule von 12,7 cm

Die Lösung wurde dann mit kleinen Anteilen Höhe und 2,54 cm Durchmesser mit Diäthylamino-

einer Phenol-Chloroform-Mischung (2:1 Gewichts- 30 äthylcellulose, die in der Hydroxylform vorlag, ge-

teile) extrahiert, bis praktisch die ganze Farbe ent- leitet. Das Eluat aus dieser Säule wurde dann durch

fernt war. Die vereinigten Extrakte wurden mit etwa eine Carboxymethylcellulosesäule (in der Wasser-

dem halben Volumen an 0,05 η-Salzsäure gewaschen. stofform) von 12,7 cm Höhe und 2,54 cm Durch-

Die Extrakte wurden mit etwa einem Drittel des messer geleitet. Nach dem Waschen, bis das Eluat

Volumens Aceton und 3 Volumen Äther gemischt 35 farblos war, wurde das adsorbierte Aquocobalamin

und mit kleinen Anteilen Wasser geschüttelt, bis mit 0,02 η-Salzsäure eluiert, und das Produkt wurde

praktisch die ganze Farbe entfernt war. Die wäßrigen durch Zugabe von 15 Volumen Aceton zum Eluat

Extrakte wurden durch Zugabe von 12 Volumen kristallisiert. Es wurden 202 mg kristallines Aquo-

Aceton kristallisiert. Die Ausbeute an Aquocobal- cobalamin erhalten,
amin betrug 0,46 g und durch Zugabe von weiterem 40

Aceton zum Filtrat wurden weitere 0,025 g ge- Beispiel 4
wonnen.

Beisoiel2 l>lg Cyanocobalamin wurden in 200ml Wasser

gelöst und dann wurden 2,25 g Natriummetabisulfit

0,5 g Cyanocobalamin wurden in 25 ml Wasser 45 und 2,5 ml Eisessig zugegeben. Das Gemisch wurde gelöst, und eine Mischung von Schwefeldioxyd und Va Stunde belüftet, und weitere 2 ml Eisessig wurden Luft wurde durch die Lösung geleitet. Dies wurde zugegeben, und die Belüftung wurde 16 Stunden fortbewirkt, indem die Luft zuerst durch einen Kolben gesetzt. Das Volumen wurde dann mit Wasser auf gesaugt wurde, der 2,5 g Kaliummetabisulfit in 50 ml 400 ml aufgefüllt, und 0,6 g Natriumnitrit wurden Wasser enthielt, zu dem vier Portionen von jeweils 50 zugesetzt. Nach Stehenlassen des Gemisches über 5 ml 1 η-Schwefelsäure in VäStündigen Abständen Nacht wurden 5 g Harnstoff zugegeben, und die zugefügt wurden. Nach insgesamt 6stündiger Be- erhaltene Lösung wurde bei Zimmertemperatur lüftung wurden Stickoxyde durch die Cobalamin- 6 Stunden stehengelassen. Nach dieser Zeit wurde die lösung geleitet, die aus 0,2 g Natriumnitrit und 5 ml Lösung in Phenol extrahiert und wieder in Wasser 1 η-Schwefelsäure hergestellt worden waren. Die 55 zurückextrahiert, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist. Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur ge- Die wäßrige Lösung wurde mit verdünnter Salzsäure halten. Am folgenden Tag wurden 0,1 g SuIfamin- auf einen pH-Wert gerade unter 4 angesäuert und säure zugefügt und die Lösung weitere 3 Stunden dann durch eine Diäthylaminoäthylcellulosesäule (in stehengelassen. der Hydroxylform) von 12,7 cm Höhe und 2,54 cm

Unter Rühren wurde stark basisches Ionen- 60 Durchmesser geleitet. Der Abfluß aus dieser Säule

austauscherharz in der Hydroxylform zugefügt, bis wurde dann durch eine Carboxymethylcellulosesäule

der pH-Wert auf 4,5 stieg. Das Filtrat wurde durch (in der Wasserstofform) von 12,7 cm Höhe und

eine Säule von Diäthylaminoäthylcellulose in der 2,54 cm Durchmesser geführt. Nach dem Waschen,

Hydroxylform von 12,7 cm Höhe und 2,54 cm bis das Eluat farblos war, wurde das adsorbierte

Durchmesser geleitet und anschließend destilliertes 65 Aquocobalamin mit 0,02 η-Salzsäure eluiert, und das

Wasser durchgeleitet, bis die ausfließende Lösung Produkt wurde durch Zugabe von 15 Volumen

farblos war. Die ausfließende Lösung wurde direkt Aceton zum Eluat kristallisiert. Es wurden 0,94 g

durch eine andere Säule der gleichen Größe mit kristallines Aquocobalamin erhalten.

Beispiel 5

Nitritocobalamin wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 4 hergestellt, wobei von 1,1 g Cyanocobalamin ausgegangen wurde. Nach Stehenlassen der Mischung über Nacht (nachdem Natriumnitrit zugegeben war), wurden 5 g Methylamin-hydrochlorid zugegeben, und die Lösung wurde bei Zimmertemperatur 6 Stunden stehengelassen. Nach dieser Zeitspanne wurde die erhaltene Lösung in Phenol extrahiert und in Wasser zurückextrahiert, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist. Dann wurde, wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben, die Reinigung an Ionenaustauschercellulosen durchgeführt, und das eluierte Aquocobalamin wurde aus wäßrigem Aceton kristallisiert, wobei 0,88 g Substanz erhalten wurden.

Beispiel 6

Nitritocobalamin wurde genau wie im Beispiel 4 hergestellt, wobei von. 1,1 g Cyanocobalamin ausgegangen wurde. Nach Zugabe des Natriumnitrits und Stehenlassen über Nacht wurde die Lösung auf 0° C abgekühlt und 5 g Anilin-hydrochlorid wurden zugefügt. Nach lstündigem Stehenlassen bei 0° C ließ man die Lösung auf Zimmertemperatur kommen. Nach weiteren 4 Stunden wurde das Gemisch in der üblichen Weise mit Phenol extrahiert und in Wasser zurückextrahiert. Nach Reinigung an Ionenaustauschern wurden 0,92 g kristallines Aquocobalamin erhalten.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Aquocobalamin durch Umsetzung von Cyanocobalamin mit Sulfitionen in wäßriger Lösung, Umsetzung des erzeugten Sulfitocobalamins mit Nitritionen und Überführung des erhaltenen Nitritocobalamins mit einer salpetrige Säure zersetzenden Verbindung in Aquocobalamin, dadurch gekennzeichnet, daß man Cyanocobalamin bei normaler Raumtemperatur oder darunter in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von etwa 1 bis 4 mit einem mehrfach molaren Überschuß an Sulfitionen versetzt und einen Luft- oder Inertgasstrom durchleitet, dann auf die so entstandene Lösung des Sulfitocobalamins bei normaler Raumtemperatur oder darunter und bei einem pH-Wert von etwa 1 bis 4 einen mehrfach molaren Überschuß an Nitritionen einwirken läßt, worauf man dem Nitritocobalamin enthaltenden Reaktionsgemisch bei normaler Raumtemperatur oder darunter und bei einem pH-Wert von etwa 1 bis 4 einen mehrfach molaren Überschuß an Harnstoff, Amidosulf onsäure oder Amin zusetzt und einige Stunden einwirken läßt und schließlich das entstandene Aquocobalamin in bekannter Weise isoliert.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   USA.-Patentschriften Nr. 2 721162,2 738 302;
   Biochem. J., 52 (1952), S. 386, 389 und 394.