DE1243618B - Verfahren zum Abbau von beta-Glucanen, insbesondere Cellulose - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Int. Cl.:

C12b

DEUTSCHES

PATENTAMT 'β 12N 9/4Hi '* r

Deutsche Kl.: 6b-3/01

Lr, 2^Z/

AUSLEGESCHRIFT

0444

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

1243 618
M61327IVa/6b
11. Juni 1964
6. Juli 1967

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abbau von /J-Glucanen, insbesondere Cellulose, mit Hilfe von Pilzen der Gattungsgruppe Polyporus.

Die Fähigkeit, Cellulose und andere 0-Glucane abzubauen, ist bei zahlreichen Mikroorganismen bzw. von ihnen gebildeten Enzymen (beispielsweise Cellulasen) festgestellt worden. Der breiteren Anwendung solcher Cellulasen, ζ. B. in der pharmazeutischen oder in der Papierindustrie, stellte sich bisher jedoch eine Anzahl von Hindernissen entgegen. So zeigen die bisher bekannten Cellulasepräparate keine oder nur geringe Aktivität auf native Cellulose wie Baumwolle, Papier usw. In den meisten Fällen sind die zellfreien Kulturnitrate auch solcher Stämme, die native Cellulose als Kohlenstoffquelle gut verwenden können, wenig aktiv gegenüber dem nativen Substrat. Von rund neunzig Cellulasepräparaten verschiedenen pilzlichen Ursprungs konnte nur bei etwa zehn eine Aktivität auf Baumwoll-Linters und bei etwa fünf eine solche auf Filterpapier nachgewiesen werden, in den meisten *o Fällen jedoch erst nach einer längeren Einwirkungszeit unter optimalen Bedingungen (vgl. J. A. Ga scoigne und M. M. Gascoigne, Biological Degradation of Cellulose, Butterworths, London, 1960, S. 53ff.). Für maximale Enzymausbeuten sind ferner sehr lange Kultivierungszeiten — in der Literatur finden sich Angaben zwischen 7 und 40 Tagen — erforderlich. Schließlich sind einige der celluloseabbauenden Pilze, beispielsweise die als Holzzerstörer bekannten Basidiomyceten, schlecht submers zu kultivieren.

Es wurde nun gefunden, daß bei der Verwendung eines Basidiomyceten der Gattungsgruppe Polyporus, der Gattung Oxyporus (Bourd & Calzin) Donk, nämlich von Oxyporus populinus (Schum. ex Fr.) Donk [syn. Fomes connatus (Fr.) Gillet, Polyporus connatus Fr., Polystictus connatus (Fr.) Quel.], diese Nachteile nicht auftreten und daß das zellfreie Kulturfiltrat dieses Pilzes ferner eine höhere cellulolytische Aktivität besitzt als die bisher verwendeten Kulturfiltrate von celluloseabbauenden Organismen. Es werden nicht nur säure- oder alkaligequollene Cellulosen bzw. Cellulosederivate wie Carboxymethylcellulose, sondern auch Cellulosepulver, Filtrierpapier und Baumwolle angegriffen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Abbau von /2-Glucanen, insbesondere Cellulose, mit Hilfe von Pilzen der Gattungsgruppe Polyporus ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man Myzel, Kulturfiltrat oder Myzelextrakt oder daraus gewonnene Enzyme von mittels cellulosehaltigen! Nährsubstrat gezüchtetem Oxyporus populinus (Schum. ex Fr.) Donk verwendet.

Verfahren zum Abbau von /MHucanen*
insbesondere Cellulose

Anmelder:

E. Merck Aktiengesellschaft,
Darmstadt, Frankfurter Str: 250

Als Erfinder benannt:
Dipl.-Biol. Dr. Hans Bender,
Freiburg (Breisgau); .

Dipl.-Biol. Dr. Harald Metz,. Darmstadt

Auf das vorliegende Verfahren wirkt es sich besonders vorteilhaft aus, daß der Pilz Oxyporus populinus (Schum. ex Fr.) Donk in saprophytischer Kultur Chlamydosporen bildet und dadurch seine Kultivierung einfacher und sicherer möglich ist.

Neben Cellulose können auch andere /9-Glucane durch das erfindungsgemäße Verfahren abgebaut werden, beispielsweise Lichenin oder aus 1,3-verknüpften /S-Glucanen bestehende'Hefezellenwände.

Die Pilze werden vorzugsweise in Malzextrakt-Pepton-Nährlösungen gezüchtet, beispielsweise mit einem Gehalt an 2,0 °/₀ Malzextrakt und 0,02% Pepton (pH 5,8). Bei Verwendung fester Nährböden werden 2°/o Agar-Agar zugesetzt.

Für die Synthese des cellulolytischen Systems ist die Anwesenheit von Cellulose im Nährmedium erforderlich. Eine optimale cellulolytische Aktivität findet man im Kulturfiltrat nach 3- bis 4tägiger Kultivierungsdauer bei etwa 28⁰C, wenn man nach folgendem Schema kultiviert:

a) Stammkultur auf Malzextrakt-Pepton-Nährlösungen (Gehalt: 2,0% Malzextrakt, 0,02% Pepton; pH 5,8) oder Malzextrakt-Pepton-Agar (Gehalt: 2,0% Malzextrakt, 0,02% Pepton, 2% Agar-Agar; pH 5,8);

b) Vorkultur(en)aufMalzextrakt-Pepton-Nährlösung [wie a] und/oder mit einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung (3 bis 8 Tage):

Glucose .'..·. 1,0%

1-Asparagin 0,05%

KH₈PO₄ 0,2%

709 609/143

(₃ 0,2% Beispiel 5

MgS<V7H₈O 0,05% BeISp₁Bl i

FeCl₃ 0,8 mg/1 70 mg mit 32%iger wässeriger Natronlauge vor-

ZnSO₄ · 7 H₂O 0,9 mg/1 behandelter Baumwolle werden mit einem Gemisch

MnSO₄ · H₂O 0,4 mg/1 5 aus 10 ml frischem Kulturnitrat (pH 5,4) und 90 ml

Thiaminhydrochlorid 1,0 mg/1 Wasser 24 Stunden lang bei 40° C gehalten. Auswaage:

α c-Μ j /"· i« i_ w ι 55 mg = 78% der Einwaage; 22% der Einwaagesind

An Stelle der Glucose können auch Maltose, abgebaut
Saccharose, Celluloscpulver, Säure- oder alkaligequollenes Cellulosepulver verwendet werden. Beispiel 6

c) Hauptkultur, vorzugsweise mit einer Nährlösung _lÄ ^Ein Kleinfermenter mit 101 einer sterilen Nährder folgenden Zusammensetzung (3 bis 4 Tage): ^^sunS ^wird ™* ⁶⁰⁰JnI einer Submerskultur von

Oxyporus populinus (Schum. ex Fr.) Donk beimpft.

Cellulosepulver 0,3% _{Dje Nährlösun besteht aus:}

Casemhydrolysat 0,2% 15 _n, _e/ _ ,, , ,

Cornsteeppulver 004% J'JJ/o Cellulosepulyer,

° / Casemhydrolysa

JJJo py

KHPO 0 2°/ °' /° Casemhydrolysat,

*7 H«O θ'θ5% ^⁰⁴"/· Cornsteeppulver,

_ao -, H₂O (pH 5,0).

Die submerse Züchtung der Pilze erfolgt in den oben- Der Pilz wächst bei 28 ⁰C unter Belüftung und

genannten Medien im Schüttelkolben oder im Fer- Rühren. Vom zweiten Tag ab werden ostündlich

menter. Nach 4tägiger Bebrütung bei 28 ⁰C werden Proben mit Hilfe der unten angegebenen Methodik

in den angegebenen Nährlösungen 3 bis 5 g Mycel pro auf ihre Celluloseaktivität geprüft. Nach 64 Stunden

Liter (bezogen auf Trockengewicht) gebildet. 25 ist das Maximum der Aktivität (1 ml der Flüssigkeit

Das Kulturfiltrat aus O. populinus (Schum. ex Fr.) setzt aus Cellulose 28,7 mg reduzierende Substanzen

Donk enthält 12 bis 15 C^-Einheiten, gemessen mit — berechnet als Glycose — frei, = 28,7 Einheiten

»Hercules Cellulose Gum 7 MSXP« (einer Carboxy- pro Milliliter) erreicht. Das Mycel wird abgeschleu-

methylcellulose der Hercules Powder Company, dert, mit Wasser gewaschen und das Waschwasser mit

Wilmington, Delaware) nach E. T. R e e s e und 30 dem klaren Kulturfiltrat vereint. Die Lösung wird im

Levin s on, Physiol. Plantar, Bd. 5, S. 345 (1952). Vakuum bei 30 bis 35⁰C auf ein Zehntel des Aus-

Die folgenden Beispiele erläutern die cellulolytische gangsvolumens eingeengt und das Konzentrat bei

Aktivität des aus O. populinus (Schum. ex Fr.) Donk 5° C mit dem dreifachen Volumen Aceton vermischt.

erhaltenen Kulturfiltrates. Der dabei ausfallende Niederschlag enthält die ge-

..J₁ 35 samte cellulolytische Aktivität. Der Niederschlag

Beispiel 1 ^_nJ _mit Wasser _ext_rahiert und der wässerige Extrakt

Das Kulturfiltrat wird auf ein Fünftel des ur- gefriergetrocknet. Man erhalt 14,5 g eines Enzymsprunglichen Volumens eingeengt und auf pH 4,6 ein- präparats, von dem 100 mg nach der nachstehend gestellt. 500 mg Cellulosepulver (Schleicher & SchüU beschriebenen Methodik aus Cellulose 1,64 g redu-123) werden in 100 ml der so erhaltenen Lösung 40 zierende Substanzen — berechnet als Glucose — frei-48 Stunden lang bei 35⁰C gehalten. Danach wird die setzen (= 16 400 E/g). Demnach sind 83% der im restliche Cellulose abzentrifugiert, getrocknet und Fermenter nachgewiesenen Aktivität isoliert worden, gewogen: Rückstand 234 mg = 46,8 % der Ein- _. , , . ,_T . ,
waage. 53,2% der Einwaage sind also unter diesen ^Die Agenden Handelspraparate:
Bedingungen abgebaut worden. 45 »Cellulase 20 000« von Miles Chem. Corp.,

Elkhart/Indiana (Takamine),

Beispiel 2 »Cellulase (Tech)« von Nutritional Biochemical

500 mg säuregequollenes Cellulosepulver werden Corp., Cleveland/Ohio,

wie im Beispiel 1 behandelt. Auswaage: 42 mg = 8% »Cellulase (crude) Asp. niger« von MAN Reseder Einwaage; 92% der Einwaage sind abgebaut. 50 »eh Laboratorios Inc., New York,

. . erwiesen sich bei der gleichen nachstehend beschrie-

Beispiel i ^_116n prüfmethodik ^auf Cellulaseaktivität als völlig

500 mg Filtrierpapier werden wie im Beispiel 1 inaktiv,
behandelt. Auswaage: 293 mg =58,6% der Einwaage; 41,4 °/o der Einwaage sind abgebaut. 55 Methodik der Prüfung auf Cellulaseaktivität

B e i s ρ i e 1 4 100 mg Enzym werden in 100 ml Pufferlösung vom Ein Baumwollfaden von 8 cm Länge und 23 mg pH 5,5 (0,2molarer Acetatpuffer) gelöst. Von dieser Gewicht wird bei Raumtemperatur 10 Minuten lang Lösung werden Mengen zwischen 2,5 und 20 ml mit mit 32%iger Natronlauge vorbehandelt. Nach gründ- 60 Pufferlösung auf 50 ml aufgefüllt. Dann werden diese lichem Auswaschen wird er dann 24 Stunden lang bei einzelnen Proben jeweils mit 5 ml einer 4%igen 4O⁰C in 100 ml frisches Kulturfiltrat gelegt, und an- Suspension von Cellulosepulver (Schleicher & Schall schließend wird die Abnahme der Reißfestigkeit Nr. 123) versetzt und mit zweifach destilliertem Wasser bestimmt. Der so behandelte Faden reißt bei einer auf 100 ml aufgefüllt. Die einzelnen Proben werden Belastung mit 10 g, während ein ebenso mit Natron- 65 nun unter schwachem Rühren mit einem Magnetlauge vorbehandelter Kontrollfaden, der nicht dem rührer 18 Stunden lang bei 28° C inkubiert. An-Kulturfiltrat ausgesetzt worden war, bei 500 g Be- schließend wird der Gehalt an reduzierenden Stoffen lastung reißt. mit Fehlingscher Lösung festgestellt.

Claims (1)

1. 5 6

   Patentanspruch · Enzyme von mittels cellulosehaltigen! Nährsub$trat

   gezüchtetem Oxyporus populinus (Schum. ex Fr.)

   Verfahren zum Abbau von /3-Glucanen, ins- Donk verwendet.

   besondere Cellulose, mit Hilfe von Pilzen der

   Gattungsgruppe Polyporus, dadurch ge- 5 In Betracht gezogene Druckschriften:

   kennzeichnet, daß man Mycel, Kultur- Prescott — Dunn »Industrial Microbiology«,

   filtrat oder Mycelextrakt oder daraus gewonnene 1949, S. 834.

   709 609/143 «.«7 Q Bundesdruckeici Berlin