DE1235933B - Verfahren zur Herstellung des Polypeptids beta-MSH und seiner Salze - Google Patents
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids beta-MSH und seiner SalzeInfo
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Description
BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
il lit?
Int. C:
C07C
C07d
Deutsche Kl.: 12 q-6/01
Nummer: 1 235 933
Aktenzeichen: C 32902 IV b/12 q
Anmeldetag: 15. Mai 1964
Auslegetag: 9. März 1967
U/68 β
Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung des bisher noch nicht synthetisch zugänglichen Hypophysenhormons
/9-MSH und seiner Amide der Formel i.-Asparagyl- (oder L-Asparaginyl)-L-seryl-glycyl-L-pro-]yl-L-tyrosyl-i.-lysyl-i--methionyl-L-glutamyl-(oder
L - glutaminyl) - l - histidyl - l - phenylalanyl - l - arginyl-L
- tryptophyl-glycyl-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl-L-lysyl-L-asparaginsäure
(oder -i.-asparagin) und von Salzen dieser Verbindungen.
In der deutschen Patentschrift 1126 397 ist ein
dem /?-MSH entsprechendes Oktadekapeptid, das an Stelle des ersten Asparaginsäurerestes den Asparaginrest
aufweist, beschrieben. Dieses Produkt war jedoch, wie sich nachträglich herausstellte, nicht in reiner
Form erhalten worden, da die Abspaltung darin verwendeter Schutzgruppen (Tosyl, Methylester) mit
einer teilweisen Zerstörung des Moleküls verbunden war.
Es wurde nun gefunden, daß man die oben genannten Oktadekapeptide in reiner Form und in
guter Ausbeute erhält, wenn man das Hexapeptid Carbobenzoxy-y-tert.-butyl-i.-glutamyl- (oder Carbobenzoxy
-1. - glutaminyl) -1 - histidyl - l - phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin
mit dem Pentapeptid L - Seryl - l - prolyl - l - prolyl - tert. - butyloxycarbonyl-ι.
- lysyl -1. - asparaginsäure - di - tert. - butylester (oder
-L-asparagin-tert.-butylester) zum geschützten Undekapeptidester
kondensiert, aus diesem die Carbobenzoxygruppe abspaltet und den erhaltenen y-tert.-Butyl-L-glutamyl-(oder
l-Glutaminyl)-L-histidylphenylalanyl-L-arginyl-i.-tryptophyl-glycyl-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
(oder -L-asparagin-tert.-butylester)mittert.-Butyloxycarbonyl-/?-tert.-butyl-L-asparagyl-(oder
tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl)-L-seryl-glycyl-i.-prolyl-L-tyrosyl-tert.-butyloxycarbonyl-i.-lysyl-i.-methionin
zum geschützten Oktadekapeptidester kondensiert und die Schutzgruppen abspaltet (vgl. F i g. 1). Darin ist BOC = tert.-Butyloxycarbonyl;
Z = Carbobenzoxy; T = Trityl; tBu = tert.-Butyl; NBzy = p-Nitrobenzyl. Zwecks
Herstellung von Amiden des /J-MSH können eine oder mehrere der Seitenketten-tBu-Gruppen der
Aminosäurenreste 1, 8 und 18 durch NH2-Gruppen
ersetzt werden.
Die Kondensation des Hexapeptids mit dem Pentapeptid zum Undekapeptid wird vorteilhaft in Gegenwart
von Toluolsulfonsäure (und einem Carbodiimid) durchgeführt.
Das als Ausgangsstoff verwendete Hexapeptidderivat Z-GIu(OtBu)- His-Phe-Arg-Try-Gly-OH
kann nach dem in der deutschen Auslegeschrift Verfahren zur Herstellung des
Polypeptids /V-MSH und seiner Salze
Polypeptids /V-MSH und seiner Salze
Anmelder:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)
Vertreter:
Dr.-Ing. Dr. jur. F. Redies,
Dr. rer. nat. B. Redies und Dr. rer. nat. D. Türk,
Patentanwälte, Opladen, Rennbaumstr. 27
Als Erfinder benannt:
Dr. Robert Schwyzer,
Dr. Beat Iselin, Riehen;
Dr. Heini Kappeier, Birsfelden;
Dr. Bernhard Riniker, Reinach;
Dr. Werner Rittel, Basel (Schweiz)
Beanspruchte Priorität:
Schweiz vom 20. Mai 1963 (6279)
210 877 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das in F i g. 1 gezeigte Tripeptidderivat T-Pro-Tyr-Lys(BOC)-OCH3
kann auch durch Kondensation von Z-Pro-Tyr-OH mit LyS(BOC)-OCH3 zum
Z-Pro-Tyr-Lys(BOC)-OCH3, Abspaltung der Carbobenzoxygruppe
und Tritylierung des Tripeptidesters erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat sich als sehr vorteilhaft erwiesen, weil eine größere Anzahl von
Zwischenprodukten in kristallisierter Form gewonnen werden kann.
Das verfahrensgemäß erhaltene /tf-MSH hat in vitro
eine Aktivität von 2 bis 3 · IO9 Einheiten pro Gramm,
wie sie auch das natürliche /S-MSH aufweist. Es kann daher an Stelle von natürlichem /S-MSH als Hormon
verwendet werden. Dem natürlichen /?-MSH gegenüber hat es den Vorteil, daß es frei von anderen Hypophysenhormonen
und sonstigen Nebenprodukten ist. Man kann das Oktadekapeptid und seine Derivate
auch als Zwischenprodukte bei der Synthese von Peptiden mit längerer Aminosäurekette verwenden.
709 518/513
OtBu
BOC
Asp
OH H
- Ser GIy ONBzy T
| OH | H | Tyr | OCH3 | H | BOC I |
OCH3 | H | Met | |
| -Pro | -Lys | ||||||||
OCH3
OtBu
| BOC | -Asp | Ser GIy |
| OtBu | ||
| BOC | I Asp |
Ser GIy |
ONBzy T
OH T
Pro
Pro
Tyr-
Tyr
OCH3
NH NH2(OH)
BOC
| T- | -Pro | Tyr | Lys |
| BOC | |||
| T | Pro | Tyr | Lys |
OCH,
-NH-NH2(OH)
BOC
| Τ | -Pro | Tyr | Lys Met |
| BOC I |
|||
| Η | Pro | Tyr | I Lys Met - |
OtBu
BOC
| BOC | i -Asp |
BOC | I -Asp |
Ser GIy | Pro | Tyr | Lys Met - |
| OtBu I |
BOC | ||||||
| Ser GIy | Pro | Tyr | I Lys Met - |
OCH3
NH Ni
| OtBu I |
Ser GIy | Pro | Tyr | BOC | |
| BOC | j -Asp |
Lys Met | |||
| Ser GIy | Pro | Tyr | |||
| H- | -Asp | Lys Met | |||
ilu His Phe Arg Try GIy
OH Z
OH Z
Pro
OH Z
Pro
BOC
OtBu
OH Z
Lys-
-OH H
Asp
BOC
OtBu
| Z- | Lys | U- | Lys | Asp |
| BOC | OtBu | |||
| Asp |
BOC
OtBu
| - Pro | I Lys |
I Asp - |
| BOC I |
OtBu | |
| Pro | I Lys |
Asp- |
BOC
OtBu
| Pro | I | Asp | |
| Z - Pro | I Lys |
OtBu | |
| Pro | BOC I |
I Asp |
|
| H -(-Pro | I Lys |
||
BOC
OtBu
| Z- | Ser | Pro | Pro | Lys | Asp - |
| BOC I |
OtBu | ||||
| H | -Ser | Pro | Pro | I Lys |
I Asp |
| Bu | Phe Arg Try | GIy | Ser | Pro | Pro | BOC I |
OtBu I |
| u His | Lys | I Asp |
|||||
| Bu | Phe Arg Try | GIy | Ser | Pro | Pro | BOC | OtBu I |
| u His | Lys | I Asp - |
|||||
| Bu I |
Phe Arg Try | GIy | Ser | Pro | Pro | BOC I |
OtBu I |
| Iu His | I Lys |
I Asp |
|||||
| Phe Arg Try | GIy | Ser | Pro | Pro | |||
| u His | Lys | Asp - | |||||
i 235
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen.
Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum
lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet
sind, Salze gewinnen, "wie z. B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogemvasserstoffsäuren, beispielsweise
Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure,Salpetersäure oderThiocyansäure,Schwefel-
oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure,
Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure,
Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure,
Phenylessigsäure, 4-Amino-benzoesäure, 4-Hydroxy-benzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure,
Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxy-benzoesäure,
2-Acetoxy-benzoesäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure,
Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure
oder Sulfanilsäure.
Das verfahrensgemäß erhaltene Oktadekapeptid kann in Form von pharmazeutischen Präparaten
Verwendung finden. Diese enthalten das Peptid in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale
Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe
kommen solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker,
Glukose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohol, Gummi,
Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen
Präparate können z. B. als Tabletten, Dragoes, Pulver, Salben, Cremes, Suppositorien oder in
flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert
und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel.
Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden
angegeben.
Für die Chromatographie werden die folgenden Systeme benutzt:
Nr. 42 = n-Propanol—Äthylacetat—Wasser
(7:1: 2),
Nr. 43 = tert.-Amylalkohol—Isopropanol—
Wasser (100: 40: 55),
Wasser (100: 40: 55),
Nr. 49 — sek.-Butanol—Isopropanol—Triethylamin—Diäthylbarbitursäure—Wasser
(100: 10:0,2:1,8 g: 60),
Nr. 52 = n-Butanol—Essigsäure—Wasser
(100: 10:30),
(100: 10:30),
Nr. 54 = sek.-Butanol—Isopropanol—Mono-
chloressigsäure—Wasser
(70:10:3g:40),
Nr. 56 = sek.-Butanol—Isopropanol—Diäthylbarbitursäure—Natriumsalz—Wasser
(100:15:0,5g: 60),
(100:15:0,5g: 60),
Nr. 87 = Isopropanol—98%ige Ameisen-
säure—Wasser (20: 1: 5),
Nr. 101 = n-Butanol—Pyridin—Eisessig—Wasser
(30: 20: 6: 24).
(30: 20: 6: 24).
Die Papierchromatographie wurde absteigend auf Whatman-Nr. 3-Papier ausgeführt, die Dünnschichtchromatographie
auf Silicagel (Mere k). Anfärbung mit Reindel-Hoppe-Reagens, Ninhydrin (nach Abspaltung
der BOC- bzw. Trityl-Gruppen durch Behandlung der Dünnschichtchromatogramme mit einer
Lösung von Chlorwasserstoff in Essigester) und, bei Anwesenheit von Tyrosin, mit Pauly-Reagens.
1. tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginsäure-/?-tert.-butylester
9,5 g (50 mMol) L-Asparaginsäure-/3-tert.-butylester
werden in 25 ml 2 m-Natronlauge gelöst und mit einer Lösung von 8,6 g (60 mMol) tert.-Butyloxycarbonylazid
in 25 ml Methanol versetzt. Dann werden untei Rühren bei 40° 7,7 ml (55 mMol) Triäthylamin
in 30 ml Methanol innerhalb einer Stunde zugetropft. Nach weiterem Rühren während 2 Stunden bei 40°
und Stehen über Nacht bei 20° wird die Lösung durch Zugabe von 2 η-Salzsäure auf pH 7 gestellt und im
Vakuum bei höchstens 30° von Methanol befreit. Man überschichtet die wäßrige Lösung mit Äther und
säuert bei 0° unter Umschütteln mit 100 ml 1 n-Salzsäure an. Die Ätherphase wird rasch abgetrennt,
mehrmals mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Der erhaltene Rückstand kristallisiert nach Animpfen langsam bei 0° und ergibt nach Verreiben mit Petroläther
12,9 g (89%) Rohprodukt vom F. 59 bis 63", nach Umkristallisieren aus Petroläther 10,0 g (69%)
verfilzte Nadeln vom F. 63 bis 66°; [χψ = j-l,7:t0,5c
(c = 1,9 in Methanol); einheitlich im Dünnschichtchromatogramm:
Rf43 = 0,47, Rf101 = 0,74.
Zur Herstellung von Impfkristallen reinigt man die Verbindung über das Dicyclohexylammoniumsalz:
2,6 g (9 mMol) Rohprodukt werden in 15 ml Äther gelöst und mit 2,1 ml (10 mMol) Dicyclohexylamin
versetzt. Beim Stehen der Lösung fällt langsam ein festes Produkt aus, das nach mehreren Stunden
isoliert wird: 3,65 g: F. 142 bis 144°; umkristallisiert aus Acetonitril: 3,24g (77°/0): F-145 bis 147°;
[Ä]« = +12,7 :t 0,5° {c = 2,8 in Methanol).
Zur Überführung in die freie Säure werden 2,35 g (5 mMol) des Dicyclohexylammoniumsalzes in 50 ml
50%igem Äthanol mit 5 ml Dowex 50 X-8 15 Minuten geschüttelt, filtriert, eingedampft und im Vakuum
getrocknet. Der Rückstand liefert beim Verreiben mit wenig Petroläther 1,28 g (89%) kristallines Produkt
vom F. 64 bis 67°.
2. tert.-Butyloxycarbonyl-iS-tert.-butyl-L-asparagyl-L-seryl-glycin-p-nitrobenzylester
10 g (35 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginsäure-jö-tert.-butylester
und 10,4 g (35 mMol) L-Serylglycin-p-nitrobenzylester
(frisch aus dem Hydrobromid hergestellt) werden in 200 ml Acetonitril
gelöst und unter Rühren bei —5° mit einer vorgekühlten Lösung von 7,8 g (38 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid
in 50 ml Acetonitril versetzt. Nach weiterem Rühren während 30 Minuten bei —5° und
über Nacht bei 0° wird 1 ml Eisessig zugegeben und der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert.
Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen, die Lösung bei 0°
mit 1 n-Salzsäure, 1 n-Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, getrock-
net und im Vakuum eingedampft. Der Ruckstand
liefert nach mehrmaligem Verrühren mit Äther 14,2 g kristallines Produkt vom F. 124 bis 128", nach
Umkristallisieren aus Essigester Nadeln vom F. 131 bis 133°; [λ]£ == - 15,8 ± 0,5c {c - 2,0 in Methanol).
L)V.-Absorption: ).1liax — 267 m\x, e — 9600 (in Feir,-sprit);
einheitlich im Dünnschichtchromatogramm: Rf43 - 0,76. Rf in Benzol—Aceton (1:1)= 0,45.
3. tert.-Butyloxycarbonyl-icf-tert.-butyl-L-asparagyl-L-seryl-glycin
5,7 g (lOmMol) tert.-Butyloxycarbonyl-ß-tert.-butyl-L-asparagyl-L-seryl-glycin-p-nitrobenzylester
werden in 100 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von I g Palladium-Kohle (10%ig) bei Zimmertemperatur und
Normaldruck hydriert, wobei das gebildete Kohlendioxyd in Natronlauge absorbiert wird. Nach Aufnahme
von etwas mehr als 4 Äquivalenten Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Man dampft
die vom Katalysator abfiltrierte Lösung im Vakuum zum Sirup ein, nimmt den Rückstand in Essigester auf
und extrahiert die Lösung bei 0" dreimal mit je 10 ml
1 n-Kaliumbicarbonatlösung. Die vereinigten alkalischen
Extrakte werden mit 150 ml Essigester überschichtet und bei 0c unter Umschütteln tropfenweise
mit 10 ml 5 η-Salzsäure versetzt.
Man trennt die Essigesterphase rasch ab, extrahiert die wäßrige Phase noch zweimal mit kaltem Essigester
und wäscht die vereinigten Essigesterlösungen sofort zweimal mit wenig gesättigter N'atriumchloridlösung,
trocknet und engt im Vakuum auf etwa 10ml ein; nach Zugabe von Petroläther bei 50 kristallisiert das
Reaktionsprodukt bei langsamem Kühlen in Form von verfilzten Nadeln: 4,0g (92%); F. 132 bis 134°;
keine Veränderung des Schmelzpunktes nach Umkristallisieren aus Essigester—Hexan; [«]£5 = —16,9
± 0,5° (c =-· 1,9 in Methanol), - 13,4 ± 0,5' (<· = 2,0
in Eisessig); einheitlich im Dünnschichtchromatogramm: Rf43 = 0,32, Rf101 = 0,65.
Die Spaltung mit Trifluoressigsäure (5 mg Substanz in 0,1 ml Reagens 1 Stunde bei 25°, dann eingedampft
und Rückstand mit Äther verrieben) ergibt chromatographisch einheitliches Tripeptid Asp-Ser-Gly-OH;
im Dünnschichtchromatogramm Rf = 0,20 in System 101; im Papierchromatogramm Rf49 = 0,13, RfM
= 0,33, Rf67 = 0,23.
4. Trityl-L-prolin-benzylester
Eine Lösung von 97 g (0,4 Mol) L-Prolin-benzylester-hydrochlorid
in 800 ml Chloroform wird unter Rühren bei O'~ mit 125 ml (0,88 Mol) Triäthylamin
versetzt. Dann wird bei gleicher Temperatur eine Lösung von 123 g (0,44 Mol) Tritylchlorid in 1,21
Chloroform innerhalb 2 Stunden zugetropft. Nach Stehen über Nacht bei 25° wäscht man die Lösung
unter Eiskühlung mit 1 η-Zitronensäure, I n-Natriumbicarbonatlösung
und Wasser, trocknet, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Äther: 136 g
(76%); F. 117 bis 119°; nach Umkristallisieren aus Äther—Petroläther 124 g; F. 118 bis 119°; [*]£
=■- -67,9 -.κ 0,5r (t· = 2,0 in Chloroform).
5. Trityl-L-prolin
135 g (0,3 Mol) Trityl-i.-prolin-benzylester werden
in 800 ml Essigester gelöst und in Gegenwart von 10 g Palladiummohr bei Zimmertemperatur und Normaldruck
hydriert. Nach Aufnahme von 8 1 Wasserstoff innerhalb 7 Stunden wird die Hydrierung abgebrochen.
Man engt die vom Katalysator und ausgeschiedenem L-Prolin abfiltrierte Lösung im Vakuum auf etwa
100 ml ein, impft an (Impfkristalle aus Äther) und isoliert nach 30 Minuten das ausgeschiedene kristalline
Produkt: 44,6 g (42%); F. etwa 165°, dann Verfestigung und erneutes Schmelzen bei 218 bis 220°; aus
ίο der Mutterlauge werden nach Einengen weitere 8,2 g
Substanz von gleichem Reinheitsgrad erhalten; im Dünnschichtchromatogramm Rf43 — 0,67 (etwa 5%
L-Prolin, Rf43 = 0,09).
1S 6. Trityl-i.-prolyl-L-tyrosin-methylester
90 g (0,25 Mol) rohes Trityl-L-prolin und 49 g (0,25 Mol) L-Tyrosin-methylester werden unter leichtem
Erwärmen in 1,5 1 Acetonitril gelöst und unter Rühren bei —5° mit 58 g (0,28 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid
versetzt.
Man rührt weitere 30 Minuten bei 0° und über Nacht bei Raumtemperatur und versetzt dann zur
Zerstörung von überschüssigem Carbodiimid mit 2 ml Eisessig. Das ausgeschiedene Gemisch von Dicyclohexylhamstoff
und Dipeptidderivat wird abfiltriert, mit Acetonitril gewaschen und mit 500 ml Dimethylformamid
verrührt. Nach Abfiltrieren des unlöslichen DicyclohexylharnstotTs wird das Filtrat im Vakuum
auf etwa 200 ml eingeengt und mit 1 1 Methanol versetzt. Nach Stehen über Nacht bei 0° isoliert man
das ausgeschiedene kristalline Dipeptidderivat: 47,5 g (35%); F. 222 bis 224°; nach Umkristallisieren aus
Dimethylformamid—Methanol: 39 g; F. 226 bis 228°;
[,x]$ = —85,2 ± 0,5° (c = 2 in Dimethylformamid);
im Dünnschichtchromatogramm Rf13 = 0,77, Rf =■ 0,76
in Benzol—Aceton (1: 1).
7. a) Trityl-L-prolyl-L-tyrosin-hydrazid
Eine Lösung von 0,8 g (1,5 mMol) Tntyl-L-prolyl-L-tyrosin-methylester
in 4 ml Dimethylformamid wird mit 0,75 ml (15 mMol) Hydrazinhydrat versetzt, 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und
dann bei 0° allmählich mit 10 ml Wasser versetzt; das anfänglich ölig ausgeschiedene Hydrazid kristallisiert
beim Verreiben. Es wird durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Wasser gut gewaschen: 0,78 g; F. 216
bis 218° (Zersetzung). Zur weiteren Reinigung wird das Rohprodukt aus viel heißem Methanol umkristallisiert:
0,67 g (84%); F. 217 bis 219°; [«]? = -77,0 ± 0,5° (c = 2,0 in Dimethylformamid); einheitlich
im Dünnschichtchromatogramm Rf43 = 0,71.
b) Trityl-L-prolyl-L-tyrosin
40 g (75 mMol) Trityl-i.-prolyl-L-tyrosin-methylester
werden in 400 ml Methanol suspendiert und unter Rühren mit 120 ml 2 n- Natronlauge versetzt, wobei
durch leichte Kühlung die Reaktionstemperatur bei 20° gehalten wird. Das Ausgangsmaterial geht innerhalb
etwa 30 Minuten in Lösung; nach weiteren 30 Minuten wird mit 100 ml Wasser verdünnt, das
Methanol im Vakuum abdestilliert, die wäßrige Lösung mit wenig Essigester extrahiert, bei 0° mit
1 η-Zitronensäure angesäuert und das ausgeschiedene Produkt mit viel Essigester extrahiert. Die mit
1 η-Zitronensäure und gesättigter Natriumchlorid-
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lösung gewaschenen Essigesterauszüge werden getrock- c) A hend von Z-Pro-Tyr-Lys( BOC)-OCH3
net und im Vakuum eingedampft. Nach Verreiben des
net und im Vakuum eingedampft. Nach Verreiben des
festen Rückstands mit wenig Methanol erhält man 14,5 g (35 mMol) Carbobenzoxy-L-prolyl-L-tyrosin
34,7 g (88°/,) kristallines Produkt; F. 163 bis 166° und 9,1 g (35 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-
(Zersetzung). Nach Umkristallisieren aus Methanol 5 methylester werden in 500 ml Acetonitril gelöst, bei
ist der F. 169 bis 171°; [«]$ = -76,7 ± 0,5° (c = 2,0 -5° mit 7,8 g (38 mMol) Dicyclohexyl-carbodiimid
in Dimethylformamid). versetzt und über Nacht bei 0° stehengelassen. Nach
Beim Umkristallisieren aus Methanol wird der Zugabe von 1 ml Eisessig wird vom ausgeschiedenen
Tritylrest teilweise abgespalten. Dicyclohexylhamstoff (7,6 g = 89%) abfiltriert, das
Beim Umkristallisieren aus Tetrahydrofuran—Äther to Filtrat im Vakuum eingedampft, der Rückstand in
(1: 1) erhält man ein Addukt mit 1 Mol Tetrahydro- 500 ml Essigester gelöst, die Lösung bei 0° mit 1 n-Salzfuran,
F. 157 bis 161° (Zersetzung), Rf43 = 0,48, beim säure, 1 n-Natriumbicarbonatlösung und Wasser geUmkristallisieren
aus Aceton ein Addukt mit 1 Mol waschen, getrocknet und auf etwa 150 ml eingeengt.
Aceton, F. 172 bis 175°, aus Dimethylformamid—Äther Das anfänglich gallertartig ausgeschiedene Reaktionsein
Addukt mit 1 bis 2 MoI Dimethylformamid vom 15 produkt wird beim Verreiben mit Äther fest: 18,7 g
F. 132 bis 134°. (82%) amorpher Carbobenzoxy-L-prolyl-L-tyrosyl-
Nfi-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester vom F.
8. Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl- etwa 95°; "acn Umlösen aus Essigester: 15,8 g;
F. 105 bis 108° (Sintern bei etwa 100°); [«]? = -51,5
Νε-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester «o ± 0,3° (c = 4,0 in Äthanol).
\ μ u α jw α j 9>8 g (15 mMol) Carbobenzoxy-L-prolyl-L-tyrosyl-
a) Nach Azid-Methode Νε-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester werden
Eine Lösung von 535 mg (1 mMol) Trityl-L-prolyl- in 150 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,5 g
L-tyrosin-hydrazid in 7,5 ml Dimethylformamid wird Palladium-Kohle (10%ig) bei Zimmertemperatur und
unter Rühren bei —15° mit 2 ml 2 η-Salzsäure und »5 Normaldruck hydriert. Nach Aufnahme der berechanschließend
mit 0,22 ml einer 5normalen wäßrigen neten Menge Wasserstoff innerhalb einer Stunde wird
Lösung von Natriumnitrit versetzt. Nach weiterem die vom Katalysator abfiltrierte Lösung im Vakuum
Rühren während 5 Minuten bei —10° wird über- eingedampft und der Rückstand mit Äther zum
schüssiges Nitrit durch Zugabe einer Lösung von Pulver verrieben: 7,2 g (92%); F. etwa 95 bis 100°;
60 mg Ammoniumsulfamat in 0,3 ml Wasser zerstört 30 einheitlich im Papierchromatogramm: Rf54 — 0,88,
und die Reaktionslösung unter Rühren in 30 ml Rf56 = 0,83. Der L-Prolyl-L-tyrosyl-Ne-tert.-butyloxy-Eiswasser
eingetropft. Man filtriert das in fester Form carbonyl-L-lysin-methylester kristallisiert aus Essigausgeschiedene
Azid ab, wäscht mit Eiswasser, löst in ester. [<%]f? = —16,4 ± 0,9° (c = 1,9 in Äthanol).
30 ml Dimethylformamid und trocknet die Lösung Eine Lösung von 7,2 g (14 mMol) L-Prolyl-L-tyrosylkurz
bei 0° über Magnesiumsulfat. Nach Zugabe von 35 NE-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester in 60 ml
0,26 g (ImMoI) Νε-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin- Chloroform wird mit 2 ml (14 mMol) Triethylamin
methylester in 2 ml Dimethylformamid läßt man die versetzt. Unter Rühren bei 0° gibt man eine Lösung
Reaktionslösung 24 Stunden bei 0° stehen, dampft von 4 g (14 mMol) reinstem Tritylchlorid in 60 ml
dann bei höchstens 35° und 0,1 mm Hg ein, nimmt den Chloroform tropfenweise innerhalb 30 Minuten hinzu,
öligen Rückstand in Essigester auf, wäscht die Lösung *o Nach Stehen während einer Stunde bei 0° und über
bei 0° mit 1 n-Zitronensäure, 0,1 η-Natronlauge und Nacht bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung
Wasser und dampft im Vakuum ein. Verreiben des unter Eiskühlung mit 1 η-Zitronensäure, I n-Natrium-Rückstands
mit Äther ergibt 510 mg festes Produkt bicarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet
vom F. 178 bis 184°. Nach Umkristallisieren aus und im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand
Methanol: 360 mg; F. 204 bis 206°; [<x]!i = — 66,8 45 ergibt nach Aufnehmen in Äther, Animpfen und
±0,5° (c = l,9 in Dimethylformamid); einheitlich längerem Stehen bei 0° 4,7 g kristallinen Tritylim
Dünnschichtchromatogramm: Rf43 = 0,81, Rf L-prolyl-L-tyrosyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-
= 0,62 in Essigester, Rf = 0,74 in Benzol—Aceton methylester vom F. 190 bis 193°; nach Umkristalli-(1:
1), Rf = 0,39 in Benzol—Methanol (9 :1). sieren aus Methanol F. 204 bis 206°; identisch mit
,, ... _ ... ..w . j 50 den nach a) und b) hergestellten Produkten,
b) Nach Carbodiimid-Methode
b) Nach Carbodiimid-Methode
29,6 g (5OmMoI) Trityl-L-prolyl-L-tyrosin (Tetra- KT 9. a) Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-
hydrofuran-Addukt) und 13 g (5OmMoI) Νε-tert.- Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-hydrazid
Butyloxycarbonyl-L-Iysin-methylester werden unter Eine Suspension von 0,76 g (1 mMol) Trityl-
Rühren in einem Gemisch von 250 ml Acetonitril und 55 L-prolyl-L-tyrosyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-
100 ml Dimethylformamid gelöst und bei —5° mit methylester in 15 ml Methanol wird mit 1,5 ml
11,5 g (55 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt; Hydrazinhydrat versetzt und bis zur vollständigen
nach weiterem Rühren während einer Stunde bei —5° Lösung unter Rückfluß erhitzt (etwa 30 Minuten),
und über Nacht bei 0° und anschließender Zugabe Man läßt die Lösung über Nacht stehen, dampft im
von 0,5 ml Eisessig wird der ausgeschiedene Dicyclo- 60 Vakuum ein, verreibt den Rückstand zur Entfernung
hexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat bei 0,1 mm von überschüssigem Hydrazin mehrmals mit Wasser
Hg eingedampft. Man nimmt den Rückstand in Essig- und löst das getrocknete amorphe Produkt (0,73 g) in
ester auf, wäscht die Lösung, wie unter a) angegeben, 10 ml Essigester; bei längerem Stehen scheidet sich
trocknet, dampft im Vakuum ein und verreibt den das Hydrazid in kristalliner Form ab: 0,53 g (70%);
kristallinen Rückstand mit Äther: 32,1g; F. 188 bis 65 F. 142 bis 150° (Sintern bei etwa 130°). Im Dünn-
192°; umkristallisiert aus Methanol: 27,6g; F. 203 schichtchromatogramm Rf43 = 0,79, Rf = 0,08 in
bis 205°; Drehung und Dünnschichtchromatogramm Benzol—Methanol (9:1) etwa 10% Nebenprodukt
identisch mit den unter a) angegebenen Werten. mit Rf = 0,17).
b) Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-Νε-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin
21,5 g (28 mMol) Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-i--lysin-methylester
werden in 150 ml Methanol suspendiert und unter Rühren bei etwa 15° mit 45 ml 2 η-Natronlauge versetzt. Bei weiterem
Rühren bei Zimmertemperatur geht das Ausgangsmaterial in Lösung. Nach einer Stunde verdünnt man
die Lösung mit 100 ml Wasser, befreit im Vakuum vom Methanol, überschichtet die wäßrige Lösung mit
Essigester bei 0° unter Umschütteln, säuert mit überschüssiger 1 η-Zitronensäure an, trennt die Essigesterphase
ab, wäscht mit 1 η-Zitronensäure und zweimal mit Wasser, trocknet und dampft im Vakuum ein. Der
erhaltene zähe Schaum wird zweimal mit Äther extrahiert und mit Petroläther zum Pulver verrieben:
19,5 g (93%) amorphes farbloses Produkt; im Dünnschichtchromatogramm
Rf43 == 0,53 (zusätzlich etwa 5% H-Pro-Tyr-Lys(BOC)-OH, Rf43 = 0,28).
10. Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-Ns-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-methionin-methylester
a) Nach der Azid-Methode
762 mg (1 mMol) rohes Trityl-L-prolyl-i.-tyrosyl-Νε-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-hydrazid
werden in der unter 8, a) angegebenen Weise in das Azid übergeführt. Man filtriert das mit Wasser ausgefällte
Produkt ab, löst es in 40 ml Essigester, wäscht die Lösung unter Eiskühlung mit 1 n-Natriumbicarbonatlösung
und Wasser, trocknet kurz über Magnesiumsulfat und engt auf etwa 10 ml ein. Die Lösung des
Azids wird sofort mit 205 mg (1,25 mMol) L-Methioninmethylester (frisch aus dem Hydrochlorid hergestellt
und destilliert, Kp.0_02 = 58 bis 60°) versetzt und
24 Stunden bei 0° stehengelassen. Man preßt das als Gallerte ausgeschiedene Produkt auf einer kalten
Nutsche gut ab, wäscht mit wenig kaltem Essigester und Äther und kristallisiert aus viel Essigester um:
340 mg verfilzte Nadeln vom F. 172 bis 174°; keine Veränderung des Schmelzpunktes bei nochmaligem
Umkristallisieren aus Methanol; [«]|5 = -60,1 ±0,5°
(c = 2,0 in Dimethylformamid); im Dünnschichtchromatogramm Rf43 = 0,87, Rf = 0,47 in Essigester,
Rf = 0,19 in Benzol—Methanol (9 : 1) (zusätzlich Spuren des Methioninsulfoxydderivats mit den Rf-Werten
0,80, 0,03 und 0,12 in den angegebenen Systemen).
b) Nach der Carbodiimid-Methode
20 g (etwa 26 mMol) rohes Trityl-L-prolyl-i.-tyrosyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin
und 6 g (37 mMol) frisch destillierter L-Methionin-methylester werden in
einem Gemisch von 200 ml Acetonitril und 25 ml Dimethylformamid gelöst, bei —5° mit 6,2g (30 mMol)
Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und während einer Stunde bei —5° und 20 Stunden bei 0° gerührt. Man
filtriert das ausgeschiedene Gemisch von Reaktionsprodukt und DicyclohexylharnstofT ab, verrührt mit
100 ml Dimethylformamid, filtriert vom unlöslichen DicyclohexylharnstorT ab und dampft das Filtrat bei
0,1 mm Hg ein. Der amorphe Rückstand ergibt nach Lösen in 100 ml warmem Essigester und langsamem
Kühlen 9,6 g verfilzte Nadeln vom F. 169 bis 171°. Die ursprüngliche Mutterlauge wird nach Zugabe von
0,2 ml Eisessig im Vakuum eingedampft. Man nimmt den Rückstand in Essigester auf, wäscht die Lösung
wie üblich neutral, trocknet und dampft ein. Der Rückstand wird mehrmals mit Äther extrahiert und
darauf aus wenig Methanol umkristallisiert: 3,1g (13°/0); F. 170 bis 172°; nach nochmaligem Umkristallisieren
der vereinigten Kristallfraktionen: 10,1g (48V0); F. 172 bis 174*; gleiche Drehung und chromatographische
Reinheit im Dünnschichtchromatogramm wie das nach a) hergestellte Produkt.
11. L-Prolyl-L-tyrosyl-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-methionin-methylester
5,8 g (6,5 mMol) Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl
- l - lysyl - l - methionin - methylester werden in 40 ml 75o/o'Ser Essigsäure suspendiert und
1 Stunde bei Zimmertemperatur geschüttelt; dabei geht der Peptidester in Lösung, und gleichzeitig fällt
Tritylcarbinol aus. Nach Zugabe von 20 ml Wasser wird filtriert, das Filtrat im Vakuum eingedampft, der
Rückstand bei 0,1 mm Hg getrocknet und mehrmals
mit Äther verrieben: 4,42 g amorphes Pulver (Acetat).
Zur Überführung des Salzes in den freien Ester wird
das erhaltene Acetat in 25 ml Wasser gelöst, die Lösung mit viel Essigester überschichtet und unter
Umschütteln bei 0° mit überschüssiger 2 n-Kaliumcarbonatlösung alkalisch gestellt. Man trennt die
Essigesterphase ab, extrahiert die wäßrige Lösung noch zweimal mit Essigester und wäscht die vereinigten
Essigesterextrakte mit wenig 1 n-Kaliumcarbonatlösung und zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung,
trocknet kurz und engt im Vakuum auf etwa 100 ml (beginnende Abscheidung von festem Produkt) ein.
Durch allmähliche Zugabe von 200 ml Äther wird die Abscheidung des Reaktionsproduktes vervollständigt:
3,3 g (78°/0); F. 177 bis 180°; im Dünnschichtchromatogramm
Rf43 = 0,52, Rf = 0,32 in System Chloroform—Methanol
(5:1) (Spuren des Methioninsulfoxydderivats mit den Rf-Werten 0,36 und 0,12 in den
angegebenen Systemen). Nach Umkristallisieren aus Acetonitril ist das Produkt einheitlich im Dünnschichtchromatogramm;
F. 181 bis 183°; [\]% = -19,2° (c = 1,5 in Dimethylformamid).
12. tert.-Butyloxycarbonyl-zS-tert.-butyl-L-asparagyl-L
- sery 1 - g lycy 1 - L - proly 1 - l - ty rosyl - N e - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-methionin-methylester
1,52 g (3,5 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-jtf-tert.-butyl-L-asparagyl-L-seryl-glycin
und 2,28 g (3,5 mMol) L-Prolyl-L-tyrosyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-methionin-methylester
werden in einem Gemisch von 50 ml Acetonitril und 10 ml Dimethylformamid unter Rühren gelöst und die Lösung bei —10° mit
0,87 g (4,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach weiterem Rühren unter Stickstoff während einer
Stunde bei —10° und über Nacht bei 0° wird überschüssiges Dicyclohexylcarbodiimid durch Zugabe von
einigen Tropfen Eisessig zerstört, der ausgeschiedene DicyclohexylharnstorT abfiltriert und das Filtrat bei
0,1 mm Hg zum Sirup eingeengt. Man nimmt den Rückstand in viel Essigester auf, wäscht die Lösung
unter Kühlen mit 1 η-Salzsäure, I n-Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung, trocknet
und dampft im Vakuum bis zur beginnenden Ausscheidung des Reaktionsprodukts ein.
Die Lösung (etwa 150 mMol) wird auf 40° erwärmt
und unter Rühren mit 600 ml Äther versetzt. Nach 2 Stunden isoliert man das Produkt: 3,21 g; unscharfer
F. bei 115 bis 125°; nach Umfallen aus Essigester— Äther: 3,13 g (82°/0); F. 123 bis 130°; [«]? = -48,3
± 0,5° (c = 1,9 in Methanol); im Dünnschichtchromatogramm
Rf13 = 0,86, Rf = 0,75 in System Chloroform—Methanol (5:1) (Spuren von Methioninsulfoxydderivat
mit Rf-Werten 0,64 und 0,45 in den angegebenen Systemen).
13. tert. -Butyloxycarbonyl -β-ten. - butyl - l- asparagyl-L
- seryl - glycy 1 -L- proly 1 - l - ty rosyl - Ne - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-methionin-hydrazid
Eine Lösung von 3 g (2,8 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl
- β - tert. - butyl - l - asparagy 1 - l - seryl - glycyl-L-prolyl-L-tyrosyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-methionin-methylester
in 7 ml Methanol wird mit 0,7 ml (5 Äquivalente) Hydrazinhydrat versetzt und unter Stickstoff 4 Stunden stehengelassen. Das als
Gallerte ausgeschiedene Reaktionsprodukt wird durch Verrühren mit 40 ml Äther fein suspendiert, abfiltriert,
mit Äther gewaschen und anschließend zweimal mit je 40 ml Wasser verrührt. Nach Trocknen im Vakuum
bei 30°: 2,47 g; F. 178 bis 183°; im Dünnschichtchromatogramm Rf43 == 0,77, Rf = 0,32 in Chloroform—Methanol
(5:1); enthält zusätzlich wenig Ausgangsmaterial sowie etwa 10% eines Nebenprodukts
mit Rf-Werten 0,65 und 0,0 in den angegebenen Systemen. Durch Umkristallisieren aus 100 ml
Wasser—Methanol wird dieses Nebenprodukt vollständig
abgetrennt; das erhaltene Produkt (1.98 g) schmilzt nach nochmaligem Umfallen aus Methanol—Äther
bei 187 bis 190°; [*]f? = -48,5 ± 0,5° (c = 1,9 in Methanol).
14. /J-tert.-Butyl-L-asparaginsäuretert.-butylester
Hydrochlorid
Hydrochlorid
In einem Druckgefäß werden 3,0 g (22,5 mMol) getrocknete L-Asparaginsäure, 100 ml trockenes Chloroform
und 3 ml konzentrierte Schwefelsäure bei —20° mit 100 ml flüssigem Isobutylen versetzt und die
Mischung unter Druckverschluß bei Raumtemperatur geschüttelt, bis klare Lösung eintritt (2 bis 3 Tage).
Hierauf wird wieder auf —20° gekühlt und das überschüssige Isobutylen im Vakuum unter Feuchtigkeitsausschluß
abdestilliert. Die verbleibende Lösung wird mit weiteren 200 ml Chloroform verdünnt und
hierauf bei 0° mit halbgesättigter Kaliumcarbonatlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und
eingedampft. Der ölige Rückstand wird in Methanol gelöst und bei —20° mit der genau berechneten Menge
Salzsäure in Methanol versetzt. Nach dem Eindampfen gibt man Äther zu; man erhält 4,5 g (71 %)
des Hydrochloride des ß-tert.-Butyl-L-asparaginsäuretert.-butylesters
in Stäbchen vom F. 152 bis 155°. Zur Analyse wird aus Aceton und Aceton—Äther kristallisiert;
F. 156 bis 158°; [<x]% = +6,6 ± 1,1° (c = 0,913
in Methanol). Im Papierchromatogramm zeigt das Hydrochlorid nur einen Fleck; Rf42 = 0,87, Rf87
= 0,85. Der freie Ester wird aus dem Hydrochlorid mittels Äther—Pottasche in einer Ausbeute von 9O°/o
der Theorie dargestellt.
15. N« - Carbobenzoxy - Νε - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
7,81 g (31,9 mMol) ß-tert.-Butyl-L-asparaginsäuretert.-butylester
und 13,4 g (35,2 mMol) N«-Carbobenzoxy-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin
werden in 180 ml Acetonitril gelöst und die auf —20° gekühlte Lösung mit 8,6 g (41,8 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid
versetzt. Nach 30 Minuten Stehen bei —20° und 3 Tagen bei 2° wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff
(7,0 g) abgesaugt und das Filtrat eingedampft. Man nimmt den Rückstand in Essigester
auf und wäscht die Lösung bei 0° wie üblich mit Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbicarbonat-Iösung
und Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Nach Abtrennen des überschüssigen
Dicyclohexylcarbodiimids mittels Petroläther wird der Rückstand aus Äther—Petroläther kristallisiert. Man
ίο kristallisiert aus Methanol—Wasser um und erhält
insgesamt 15,6 g (81%) Diester vom F. 96 bis 99°; [αψ = -14,8 ± 0,5° (c = 2,003 in Methanol). Im
Dünnschichtchromatogramm zeigt die Verbindung einen Fleck; Rf = 0,56 in Butylacetat, Rf = 0,74 in
Essigester, Rf = 0,81 in Chloroform—Methanol (19:1).
16. Νε-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
Man hydriert eine Lösung von 17,2 g (28,3 mMol) NÄ-Carbobenzoxy-Ne-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
in 250 ml Äthanol in Gegenwart von 1,0 g Palladium-Kohle (10% Pd). Das bei der Hydrierung entstehende Kohlendioxyd
wird in einem zweiten, mit Natronlauge gefüllten Hydriergefäß aufgefangen. Nach 50 Minuten und
Aufnahme von 630 ml Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Der Katalysator wird abgetrennt
und das Filtrat eingedampft: 12,7 g (95% der Theorie) farbloses Harz, das sofort weiterverarbeitet wird.
17. Carbobenzoxy -L- prolyl - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
Eine Lösung von 12,5 g (26,4 mMol) Νε-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
und 7,23 (29,1 mMol) Carbobenzoxy-L-prolin in 100 ml Acetonitril wird bei —20° mit 6,53 g(31,7 mMol)
Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und dann 30 Minuten bei —20° und 38 Stunden bei 2° belassen. Nach
Abnutschen des Dicyclohexylharnstoffs wird das Filtrat eingedampft und der Rückstand in Essigester
aufgenommen, die Lösung wie üblich gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird
mehrmals mit Petroläther, dann mit Äther zerrieben und die unlöslichen Anteile aus Essigester—Äther
umgefällt. Dabei werden insgesamt 13,33 g (72% der Theorie) reiner Carbobenzoxy-L-prolyl-tert.-butyloxycarbony
1 -L-lysyl-L- asparaginsäure - d i - tert. - butylester
als festes Pulver vom F. 103 bis 105° erhalten. Zur Analyse wird aus tert.-Butanol—Wasser kristallisiert;
F. 104 bis 105°; [*]? = -43,6 ± 0,6° (c = 1,738 in
Äthanol). Die Substanz zeigt im Dünnschichtchromatogramm einen Fleck; Rf = 0,46 in Essigester,
Rf = 0,64 in Benzol—Aceton (1:1), Rf = 0,78 in
Chloroform—Methanol (19 : 1).
18. L-Prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
12,0 g (17,0 mMol) Carbobenzoxy-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl
- l - lysyl - l - asparaginsäure - di - tert.-butylester
werden in 700 ml Äthanol gelöst und in Gegenwart von Ig Palladium-Kohle (10% Pd), wie
unter 16 beschrieben, hydriert (H2-Aufnähme: 377 ml
innerhalb von 5 Stunden). Analoge Aufarbeitung gibt 9,10 g (94% der Theorie) L-Prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylesterals
farbloses Harz, das sofort weiterverarbeitet wird.
17 18
19. Carbobenzoxy-i-prclyl-i.-prolyl-tert.-butyloxy- Nebenprodukten mit Benzol-Chloroform (1:9)
carbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester Chloroform und Chloroform-Methanol (99 :1) wird
der Carbobenzoxy-L-seryl-L-prolyl-i,-prolyl-tert.-
9,10 g (16,0 mMol) L-Prolyl-tert.-butyloxycarbonyl- butyloxycarbonyl-L-Iy syl-L-asparaginsäure-di-tert.-
L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester und 4,40 g 5 butylester mit Chloroform—Methanol (98 : 2) eluiert.
(17,7 mMol) Carbobenzoxy-i.-prolin werden in 80 ml Man erhält 5,36 g (78% der Theorie) Harz, das nach
Acetonitril gelöst und die Lösung bei —20° mit 4,0 g Dünnschichtchromatogramm einheitlich ist. Zwei-
(19,4 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach maliges Umfallen aus Äther—Petroläther gibt ein
einer Stunde Stehen bei —20" und 3 Tagen bei 2" wird analysenreines amorphes Produkt; [,xfi = —96,6
vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abge- io ± 0,7° (c = 1,397 in Methanol). Rf = 0,22 in
saugt, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in Chloroform—Methanol (19 : 1), Rf = 0,62 in Dioxan,
Essigester aufgenommen. Die Lösung wird wie üblich Rf = 0,66 in Chloroform—Methanol (9: 1).
neutral gewaschen und eingedampft. Zur Abtrennung
neutral gewaschen und eingedampft. Zur Abtrennung
von überschüssigem Dicyclohexylcarbodiimid verreibt 22. L-Seryl-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonylman
den Rückstand mit Petroläther, löst die unlöslichen 15 L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
Anteile (12,81g) in Benzol—Chloroform (1:1) und
bringt sie auf eine Säule von 600 g Silikagel »Mesh 200« 1,778 g Carbobenzoxy-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl-(D
a vi son). Man eluiert das Tetrapeptidderivat tert. -butyloxycarbonyl -L-lysyl-i- - asparaginsäure-dimit
Benzol—Chloroform (1: 4) und (1: 9). Zur tert.-butylester werden in 25 ml Methanol gelöst und
Kristallisation werden diese Fraktionen mit etwas 20 mit 200 mg Palladium-Kohle (10% Pd) in der Schüttel-Petroläther
versetzt und mehrere Tage bei 35 bis 40° ente unter Kohlendioxydabsorption hydriert. Die
belassen, dabei kristallisiert das ungelöste, anfänglich Wasserstoffaufnahme ist nach einer Stunde beendet,
amorphe Material langsam durch. Nach Abgießen der und nach einer weiteren Stunde wird der Katalysator
Petrolätherlösungen werden 9,20 g (72% der Theorie) abfiltriert und die Lösung auf ein kleines Volumen
Carbobenzoxy-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbo- 25 eingeengt. Durch Zugabe von Essigester und Petrolnyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
vom äther wird das Peptid als halbfeste Masse ausgefällt F. 77 bis 84° erhalten. Zur Analyse wird zweimal aus und die überstehende Lösung dekantiert und verÄther
umkristallisiert; F. 78 bis 85°; [α]? =-- —72,9 worfen. Beim Trocknen im Hochvakuum bei 40°
r 0,5° (c = 2,026 in Äthanol). Im Dünnschicht- erhält man 1,483 g (98%) chromatographisch einheitchromatogramm
zeigt die Verbindung einen Fleck; 30 liches H-Ser-Pro-Pro-Lys(BOC)-Asp(OtBu)-OtBu
Rf = 0,17 in Essigester, Rf = 0,47 in Benzol—Aceton mit unscharfem Schmelzpunkt bei etwa 80 bis 90°;
(1 : 1), Rf ==· 0,82 in Dioxan—Wasser (9:1). [«]d = -92 ± 0,5° (r == 2,0 in Methanol); Dünnes 1 ■ 1 . . ■ schichtchromatogramm: Rf52 = 0,26, Rf101 = 0,71.
20. L-Prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-
L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester ,. .. _ . . ,11 ■ , · · . ■
J J y 6 J 35 23. Carbobenzoxy-y-tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-
Eine Lösung von 7,06 g (8,80 mMol) Carbobenzoxy- L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-seryl-
L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-as- L - prolyl - l - prolyl - tert. - butyloxycarbonyl -1, - Iysylparaginsäure-di-tert.-butylester
in 100 ml Methanol L-asparaginsäure-di-tert.-butylester-acetat
wird, wie unter 16 beschrieben, hydriert (H2-Auf-
nahme: 185 ml in 90 Minuten) und analog aufgearbei- 40 1,271 g (1,25 mMol) Carbobenzoxy-y-tert.-butyl-
tet. Man erhält aus Äther 3,65 g kristallinen L-Prolyl- L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryp-
L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparagin- tophyl-glycin und 0,237 g (1,25 mMol) p-Toluol-
säure-di-tert.-butylester in Nadeln vom F. 146 bis sulfonsäure · H2O werden unter Erwärmen auf 50°
149°, aus der Mutterlauge kristallisieren nach Ein- in 3,5 ml absolutem Dimethylformamid gelöst, auf
engen noch weitere 1,54 g vom gleichen Schmelzpunkt 45 20° abgekühlt und mit einer Lösung von 0,89 g
(Ausbeute insgesamt 88% der Theorie). Zur Analyse (1,18 mMol) L-Seryl-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxy-
wird aus Methanol—Äther umkristallisiert; F. 147 carbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
bis 149°; [a]2£ = —73,1 -J; 0,7° (c = 1,381 in Metha- in 3,5 ml Chloroform versetzt. Unter Rühren werden
nol). Im Dünnschichtchromatogramm zeigt die Ver- sodann 0,315 g (1,53 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid
bindung einen Fleck; Rf = 0,12 in Dioxan—Wasser 50 in fester Form zugegeben und die Mischung über
(9 1), Rf = 0,18 in Methanol. Nacht bei 22° und dann noch während 8 Stunden bei
._ _ , , , , , , , 40J gerührt. Nach Abkühlen auf 0° nitriert man den
21. Carbobenzoxy-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl- ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab, engt das
tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparagmsäure-d!- FiUrat -m Wasserstrahlvakuum bei 40° soweit wie
tert.-butylester 55 mögiicn ein und fäut das Reaktionsprodukt durch
Eine auf —20° gekühlte Lösung von 5,18 g (7,75 Zugabe von 35 ml Benzol und 35 ml Petroläther als
mMol) L - Prolyl -L- prolyl - tert. - butyloxycarbonyl- viskose Masse aus. Sie wird wieder in 4 ml Methanol
L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester und 2,22 g gelöst und durch Zugabe von 40 ml Äther als fein-
(9,30 mMol) Carbobenzoxy-L-serin in 60 ml Aceto- pulverige Fällung ausgeschieden, abfiltriert und im
nitril wird mit 2,88 g (14,0 mMol) Dicyclohexyl- 60 Hochvakuum bei 40° getrocknet. Das so erhaltene
carbodiimid versetzt und dann 65 Stunden bei 2° Rohprodukt (2,26 g, Tosylat) wird zur Umwandlung
belassen. Hierauf wird, wie unter 19 beschrieben, auf- in das Acetat in 32 ml Methanol und 16 ml Wasser
gearbeitet. Der Essigesterrückstand (7,75 g) wird zur gelöst und durch eine Säule von schwach basischem
Abtrennung von überschüssigem Dicyclohexylcarbo- Ionenaustauscher (M e r c k Nr. II) in der Acetat-
diimid mit Petroläther zerrieben, die unlöslichen 65 form filtriert [Säulenlänge 15 cm; Durchmesser 2 cm;
Anteile (7,40 g) in Benzol—Chloroform (1: 4) gelöst als Lösungsmittel dient Methanol—·Wasser (1: 1)].
und auf eine Säule von 350 g Silikagel »Mesh 200« Das Eluat wird auf 50 ml konzentriert und dann
gegeben. Nach Eluierung geringer Mengen von lyophilisiert. Man erhält 2,08 g Acetat, das durch eine
19 20
multiplikative Verteilung über 230 Stufen im System gefällt, abfiltriert und getrocknet. Die so erhaltenen
Methanol—0,1 m- Ammoniumacetat (pH 7)-Chloro- 1,88 g werden zur Vorreinigung in 16 ml Methanol
form—Tetrachlorkohlenstoff (2:1:1:1) mit Phasen- gelöst und durch Zugabe von 48 ml Essigester und
volumina von je 25 ml gereinigt wird. Der Inhalt der 80 ml Petroläther wieder ausgefällt. Man erhält dabei
Verteilungselemente Nr. 56 bis 85 (Maximum bei 5 1,63 g Rohprodukt, das zur weiteren Reinigung einer
Nr. 68; K = 0,42) ergibt beim Eindampfen zur multiplikativen Verteilung über 500 Stufen im System
Trockene insgesamt 1,22 g geschütztes Undekapeptid- Methanol—0,1 m-Ammoniumacetat (pH 7)—Chloro-
acetat (57%» bezogen auf eingesetztes Pentapeptid). form—Tetrachlorkohlenstoff (17: 7: 8 : 8) mit Phasen-
Das Produkt weist bei der Chromatographie etwa 5% volumina von je 25 ml unterworfen wird. Aus den
einer Verunreinigung auf und wird in diesem Zustand io Verteilungselementen Nr. 110 bis 149 (Maximum bei
weiterverarbeitet. Dünnschichtchromatographie: Rf52 Nr. 130; K = 0,35) erhält man beim Eindampfen zur
= 0,29, Rf101 = 0,81. Trockene 952 mg geschütztes /9-MSH-Acetat (55°/0,
„. T%i ι I1-Ji ι . . ι bezogen auf eingesetztes Undekapeptid) als weißes
24. y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalany 1- Pulver vom F etwa 220 bis 225o (Zersetzung). Aus
L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl- dem Dunnschichtchromatogramm im System 52 ist
tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsaure-di- dfc Anwesenheit von etwa 10o/# eines Nebenproduktes
teit.-butylester-acetat mit kieinerem Rf.Wert ersichtlich. (Maximum des
1,21 g Carbobenzoxy-undekapeptidester werden in Nebenproduktes etwa Nr. 140, K etwa 0,39). Die
30 ml Methanol in Gegenwart von 0,04 ml Eisessig und Drehung des geschützten /?-MSH-Acetates ist [*]/>
300 mg Palladium-Kohle (10% Pd) bei 30° und 20 = -36 ± 1° (c = 1,06 in Methanol).
Normaldruck in einem Kölbchen mit Magnetrührer ->7in i\
hydriert ohne Absorption des entstehenden Kohlen- <-ΐίβΗΐ9β<ΛβΝ2β;>
(Acetat: 2719,1).
dioxydes^ Der Verlauf der Reaktion wird an Hand Berechnet ... C 56,98, H 7,27, O 21,18, N 13,39,
von Proben mittels Dunnschichtchromatographie ver- s 1 lg Essi äure 2 21 o/
folgt. Nach 4 Stunden ist die Abspaltung der Carbo- 25 >>»>/»
benzoxygruppe beendet, und die Lösung wird nach gefunden ... C 56,53, H 7,55, O 20,84, N 13,10,
Abfiltrieren des Katalysators zur Trockene eingeengt, S 1,28, Essigsäure 2,1 %.
der amorphe Rückstand pulverisiert und im Hochvakuum bei 40° getrocknet. Man erhält 1,076 g (96 %) UV-Absorption in Methanol—1 n-Natronlauge(9:1) Undekapeptidester-acetat, das chromatographisch eine 30 zu λΜαχ = 283 ιημ (ε = 7550), 289 ΐημ (ε = 7400) Reinheit von etwa 95% aufweist. Dünnschichtchro- Try zu Tyr = 1,05. Dünnschichtchromatographie: matographie: Rf52 = 0,12, Rf101 = 0,67. Rf43 = 0,56, Rf52 = 0,45. Nebenprodukt: Rf43 = 0,56,
von Proben mittels Dunnschichtchromatographie ver- s 1 lg Essi äure 2 21 o/
folgt. Nach 4 Stunden ist die Abspaltung der Carbo- 25 >>»>/»
benzoxygruppe beendet, und die Lösung wird nach gefunden ... C 56,53, H 7,55, O 20,84, N 13,10,
Abfiltrieren des Katalysators zur Trockene eingeengt, S 1,28, Essigsäure 2,1 %.
der amorphe Rückstand pulverisiert und im Hochvakuum bei 40° getrocknet. Man erhält 1,076 g (96 %) UV-Absorption in Methanol—1 n-Natronlauge(9:1) Undekapeptidester-acetat, das chromatographisch eine 30 zu λΜαχ = 283 ιημ (ε = 7550), 289 ΐημ (ε = 7400) Reinheit von etwa 95% aufweist. Dünnschichtchro- Try zu Tyr = 1,05. Dünnschichtchromatographie: matographie: Rf52 = 0,12, Rf101 = 0,67. Rf43 = 0,56, Rf52 = 0,45. Nebenprodukt: Rf43 = 0,56,
Rf52 = 0,39.
25. NÄ-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-tert.-butyl-L-aspara-
gyl - L - seryl -glycyl -l -prolyl -l-tyrosy 1 -tert. -butyloxy- 35 26. l- Asparagyl - l - seryl -glycyl - l - prolyl - l - tyrosy 1-
carbonyl-L-lysyl-L-methionyl-y-tert.-butyl-L-glutamyl- L-lysyl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyl-
L - histidyl - l - phenylalanyl - l - arginyl - l - tryptophyl- alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-seryl-L-prolyl-
glycyl-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl- L-prolyl-L-lysyl-L-asparaginsäure
L - lysyl - L - asparaginsäure - di - tert. - butylester - acetat
L - lysyl - L - asparaginsäure - di - tert. - butylester - acetat
40 440 mg geschütztes /?-MSH-Acetat werden in 8,8 ml
814 mg (0,763 mMol) Na-tert.-Butyloxycarbonyl- 97%iger Trifluoressigsäure gelöst und während einer
ß-tert.-butyl-L-asparagyl-L-seryl-glycyl-L-prolyl-L-tyro- Stunde bei 20° im Dunkeln stehengelassen. Die Lösung
syl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-methionin-hydra- wird sodann schonend auf ein kleines Volumen einzid
werden in 8 ml absolutem Dimethylformamid geengt und nach Zugabe von 4 ml Wasser nochmals
gelöst und im Eis-Kochsalz-Bad (—12°) mit 3,05 ml 45 eingeengt und dann lyophilisiert. Man erhält 565 mg
1 η-Salzsäure und 0,632 ml 10%iger Natriumnitrit- Trifluoracetat, das wiederum in Wasser gelöst und
lösung (0,916 mMol) versetzt. Die klare Lösung wird durch Filtration durch eine Säule (/ = 15 cm, Durch-5
Minuten bei —12° stehengelassen und dann das messer = 0,9 cm) mit schwach basischem Ionenentstandene
Azid durch Zugabe von 38 ml auf —12° austauscher (Merck Nr. II) in der Acetatform zum
vorgekühlter 20%iger Kochsalzlösung als flockiger 50 Acetat umgesetzt wird (389 mg). Bei der Chromato-Niederschlag
ausgefällt. Dieser wird bei 0° abfiltriert, graphie (Dünnschichtchromatogramm, System 104)
auf der Nutsche mit 10 ml eiskalter 5%'ger Natrium- zeigt sich folgendes Bild:
bicarbonatlösung und zuletzt mit 4 ml Wasser ge- ._ „
bicarbonatlösung und zuletzt mit 4 ml Wasser ge- ._ „
waschen, dann in noch feuchtem Zustand in 16 ml JH Z η ir Spuren
Dimethylformamid bei 0° gelöst und mit einer Lösung 55 J5, X'^
pure,n nn/ nt u j 1
von 1,07 g (0,635 mMol) y-tert-Butyl-L-glutamyU £ = 0^ etwa 0% Nebenprodukt
L - histidyl - L - phenylalanyl - l - arginyl - l - tryptophyl- ™ ~ J'Jl etwa 85 bis 90 /, £-MSH
glycyl-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyl-oxycarbonyl- Kt ~ υ'52 Spuren
L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester-acetat in Dieses Gemisch wird durch eine multiplikative
10 ml Dimethylformamid vereinigt. Die klare Lösung 60 Verteilung nach Craig im System 0,5% Trichlorwird
während 18 Stunden bei 0° aufbewahrt, dann essigsäure—sek.-Butanol in Stickstoffatmosphäre gewährend
15 Minuten bei 20° im Wasserstrahlvakuum reinigt. Das Phasenvolumen von Ober- und Unterevakuiert
(Entfernung von HN3) und noch während phase beträgt je 10 ml. Nach 1300 Stufen befindet sich
23 Stunden bei 20° stehengelassen. Das Dimethyl- das Maximum bei Verteilungselement Nr. 468 (K
formamid wird sodann im Hochvakuum bei 40° 65 = 0,56). In der Umgebung des Maximums wird die
größtenteils verdampft, der honigartige Rückstand in Lösung in Fraktionen von je fünf Verteilungseinheiten
60 ml heißem Benzol gelöst, durch Zugabe von 60 ml entnommen, im Vakuum schonend auf ein kleines
Petroläther als pulveriger Niederschlag wieder aus- Volumen eingeengt und lyophilisiert. Bei der Dünn-
Schichtchromatographie (System 104) zeigen die Proben aus den Verteilungselementen Nr. 453 bis 487 die
vollständige Abwesenheit des Nebenproduktes mit Rf = 0,26. Dieses ist hauptsächlich in den Elementen
Nr. 408 bis 432 angereichert, in Mischfraktionen zusammen mit /S-MSH (Maximum für das Nebenprodukt
etwa bei Nr. 16: rmax = 416, K = 0,47).
Sämtliche Fraktionen zeigen jedoch wieder, wie schon das eingesetzte Rohprodukt, Spuren von Verunreinigungen
mit Rf == 0,07 und 0,18 (Sulfoxyd), die offenbar im Laufe der Verteilung bzw. während der Aufarbeitung
frisch gebildet worden sind. Die Fraktionen aus den Verteilungselementen Nr. 453 bis 487 werden
vereinigt (Trichloracetat) und mit Hilfe von schwach basischem Ionenaustauscher wiederum in das Acetat
umgewandelt. Zur endgültigen Reinigung wird dieses an einer Säule von schwach saurem Ionenaustauscher
auf der Basis von Dextrangel (Carboxymethyl-Sephadex
C-25, medium grade, Pharmacia, Uppsala) wie folgt Chromatographien: Die Säule (/= 17,5 cm,
Durchmesser = 0,96 cm) wird vorerst mit 0,05 m-Ammoniumacetatpuffer (pH — 5,5) äquilibriert und
nach Auftragen der in 0,5 ml Wasser gelösten Substanz mit weiteren 30 ml 0,05 m-Pufferlösung gewaschen
(Eluat verworfen). Danach wird ein linear steigender Konzentrationsgradient angesetzt, erhalten durch
ίο Mischen des Inhalts von zwei offenen zylindrischen
Gefäßen mit je 80 ml 0,05 m- bzw. 0,6 m-Ammoniumacetatpuffer vom pH 5,5. Die optische Dichte des
Eluates wird mit Hilfe eines »Uvicord«-Gerätes (LKB Produkter A. B., Stockholm) kontinuierlich registriert.
Die verschiedenen Fraktionen werden auf ein kleines Volumen konzentriert, lyophilisiert und chromatographisch
untersucht.
| Fraktion Nr. |
Volumen ml |
Puffer konzentration |
Gewicht mg |
Beurteilung (DS, System 104) |
| 1 2 |
51 9 |
0,05 bis 0,22 0,22 bis 0,25 |
Spuren 4,5 |
/S-MSH (etwa 40%) und Sulfoxyd (etwa 50%) |
| 3 | 15 | 0,25 bis 0,30 | 96 | /3-MSH mit etwa 1 bis 2% Sulfoxyd |
| 4 | 9 | 0,30 bis 0,33 | 94 | reines £-MSH |
| 5 | 8 | 0,33 bis 0.36 | 6 | /S-MSH (etwa 20%) und Nebenprodukte, Rf = 0,07 (etwa 80%) |
| 6 | 9 | 0,36 bis 0,39 | 4,5 | Nebenprodukt, Rf = 0,07 |
| 7 | 18 | 0,39 bis 0,45 | 5 | |
| 8 | 16 | 0,45 bis 0,51 | 2 |
Aus der Fraktion 3 kann das Sulfoxyd durch nochmaliges Chromatographieren an Carboxymethyl-Sephadex
C-25 entfernt werden. Das aus Fraktion 4 nach dem Trocknen während 15 Stunden bei 50° und
0,01 mm Hg über Kaliumhydroxyd erhaltene reine /3-MSH-Acetat enthält noch einige Prozent Wasser
und ist stark hygroskopisch. Es nimmt beim Stehen an der Luft 7,1% Feuchtigkeit auf (Gleichgewichtszustand).
Eine solche Probe zeigt folgende Analysenwerte:
UV-Absorption in 0,1 n-Natronlauge:
UV-Absorption in 0,1 n-Natronlauge:
2,134 mg Substanz, gelöst in 10 ml (MG = 2134),
Αϊ92.4 = 0,380 bis 0,011 (Basisabsorption) = 0,369,
D280'= 0,582 bis 0,013 (Basisabsorption) = 0,569.
Daraus ergibt sich durch Berechnung (G. H.
B e a ν a η und E. R. H ο 1 i d a y, Advances Protein
Chemistry, 7, 319 [1952]):
Λ/Try + MTyr = 1,56 · 10"4 Mol/1,
MTry j 27
6o
Peptidgehalt =
Essigsäurebestimmung durch Destillation mit Schwefelsäure und Titration mit Natronlauge: gefunden
6,5%.
Optische Aktivität: [<*}D = -57,5 ±1° (c =· 0,99
in 1 n-Essigsäure).
AminosäurebestimmungtmTotalhydrolysat.loStunden
bei 110° in 20%iger Salzsäure (in Klammern die theoretischen Werte):
His(l) 1,07, Lys(2) 1,98, Arg(l) 0,96, Asp(2) 2,07, Ser(2) 1,83, GIu(I) 0,97, Pro(3) 3,20, Gly(2) 2,03,
Met(l) 0,91, Tyr(l) 1,05, Phe(l) 1,00.
Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel: Rf101
= 0,23, Rf104 = 0,31.
Papierelektrophorese auf Whatman-Papier Nr. 1: pH 2 (Ameisensäure—Essigsäure), 50 V/cm, 1 Stunde,
—11cm, pH 6,3 (Pyridinacetat), 75 V/cm, 2 Stunden,
—4,9 cm.
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von /S-MSH und seiner Amide der Formel L-Asparagyl- (oder
L - Asparaginy 1) - L- seryl - glycyl - L - prolyl - l - ty rosyl-L-lysyl-L-methionyl-L-glutamyl-(oder
L-glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-i.-arginyl-L-tryptophyl
- glycyl - l - seryl - l - prolyl - l - prolyl - l - lysyl-L-asparaginsäure
(oder -L-asparagin) und Salzen dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet,
daß man das Hexapeptid Carbobenz-oxy-y-tert.-butyl-L-glutamyl-(oder
Carbobenzoxy-L-glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl- L-arginyl-L-tryptophyl-glycin mit dem Pentapeptid
L - Seryl - l - prolyl - L - prolyl - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
(oder -L-asparagin-tert.-butylester) zum geschützten Undekapeptidester kondensiert, aus
diesem die Carbobenzoxygruppe abspaltet und den erhaltenen y-tert-Butyl-L-glutamyl- (oder
L-Glutaminyl-) L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl-tertbutyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert-
butylester (oder -L-asparagin-tert.-butylester) mit
tert. - Buty loxycarbonyl -ß- tert. - butyl - l - asparagyl-(oder
tert. - Butyloxycarbonyl - L - asparaginyl)-L - seryl - glycyl - l - prolyl - l - tyrosyl - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-methionin
zum geschützten Oktadekapeptidester kondensiert und die Schutzgruppen
abspaltet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hexapeptid- und das Pentapeptidderivat
in Gegenwart eines Carbodiimids kondensiert werden.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kondensation
des Hexapeptids mit dem Pentapeptid in Gegenwart von Toluolsulfonsäure durchführt.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Heptapeptid in
Form des Azids mit dem Undekapeptid kondensiert wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem
geschützten Oktadekapeptid die Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäure abspaltet.
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| CH627963A CH444178A (de) | 1963-05-20 | 1963-05-20 | Verfahren zur Herstellung von B-MSH |
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