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Verfahren zur Herstellung des die erodierende Wirkung von Pepsin auf
die Innenwand des menschlichen Magens inhibierenden neutralen wasserlöslichen Natriumsalzes
eines Polyschwefelsäureesters der Amylose Auf die Bedeutung der nachteiligen Wirkung
von Pepsin hinsichtlich der Ulcusbildung im Magen, besonders bei pH-Werten von 1,1
bis 1,5, ist bereits vor längerer Zeit wiederholt hingewiesen worden. Es ist auch
schon bekannt, daß Ca03, Al(OH)3 und M (OH)2 sowie Na-Laurylsulfat eine Herabsetzung
der Pepsin-Wirkung und gleichzeitig ein Steigen des pH-Wertes im Mageninhalt bewirken.
Diese Erkenntnis hat man auch bereits zur Behandlung von Pepsin-Ulcus (peptic ulcer)
ausgewertet.
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Bekannt ist weiter die Inhibition der proteolytischen Wirkung von
Pepsin durch die sulfatierten Polysaccharide Chondroitinschwefelsäure, Heparin und
Na-Polyhydromannuronsäuresulfat. Von diesen drei Substanzen wirkt Heparin am stärksten,
dann folgt Na-Polyhydromannuronsäuresulfat und an letzter Stelle Chondroitinschwefelsäure.
25 mg Heparin pro Tier bewirkten bei der Shayratte eine merkliche Verminderung der
Bildung von gastrischem Ulcus. Die inhibierende Wirkung auf Pepsin wurde in vitro
und in vivo festgestellt.
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Es hat sich gezeigt, daß noch wirksamer als Heparin das wasserlösliche
Salz eines Polyschwefelsäureesters der Amylose ist, dessen neutrales Natriumsalz
etwa 17010 Schwefel enthält, was bedeutet, daß bei der Herstellung im Durchschnitt
pro Monosaccharideinheit der Amylose 2 Moleküle Schwefelsäure als saure Ester aufgenommen
werden, also der Dischwefelsäureester der Amylose gebildet wird. Diese Feststellung
fußt auf folgenden Vergleichsversuchen in vitro über die inhibierende Wirkung von
Heparin einerseits und von sulfatiertem Natriumsalz mit einem Schwefelgehalt von
170/0, das aus Amylosepolyschwefelsäureester gewonnen war, andererseits.
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Zu jeder Prüfung wurden 5 ml einer 20/0eigen wäßrigen Caseinlösung
benutzt, 2,5 mg Pepsin (1:10000) und 2,5 mg Inhibitor zugegeben. Die Reaktionsmischung
wurde dann 15 Minuten bei einer Temperatur von 38 C, bei einem pH-Wert von 2,5 in
kubiert. Die Pepsinaktivität wurde so bestimmt, daß ein bestimmter Anteil des Inkubates
mit Trichloressigsäure gefällt wurde, wodurch die nicht gespaltenen Eiweißstoffe
ausfielen, während der gespaltene flüssige Anteil (Peptide und Aminosäuren) durch
Filtration abgetrennt wurde. Zum Filtrat wurde Folins Reagens zugegeben und der
Gehalt an Eiweißspaltprodukten kolorimetrisch bestimmt. Auf diese Weise wurde der
Grad der Proteolyse und dadurch die Pepsinaktivität festgestellt.
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Gleichzeitig wurde derselbe Versuch ohne Zugabe von Inhibitoren ausgeführt.
Ist die Pepsinaktivität ohne Zugabe von Inhibitoren gleich 1000/0, dann
wird sie
nach oben durchgeführten Versuchen durch die Zugabe von Heparin auf 7101o, durch
die Zugabe des Natriumsalzes der nach der Erfindung sulfatierten Amylose auf 61
0/o herabgesetzt.
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Versuche an Shayratten zeigten, daß eine Gabe von 12,5 mg bzw. eine
Gabe von 25 mg der sulfatierten Amylose je Tier den Grad der Magengeschwürbeschädigung
von einem ursprünglichen Wert von 88 Einheiten - bei einer Kontrollgruppe ohne Behandlung
- auf 16 Einheiten - bzw. auf 6,6 Einheiten herabsetzte. Jede Versuchsgruppe von
Ratten enthielt vierzehn bis fünfzehn Tiere. Die durch übliche Prüfungen dabei festgestellte
Pepsinaktivität im Magen der Tiere wurde verhältnismäßig wenig reduziert -ursprünglicher
Wert 0,90, nach Verabreichung von 25 mg des wasserlöslichen Salzes des Polyschwefelsäureesters
der Amylose, dessen neutrales Na-Salz etwa 170in Schwefel enthält, war der Wert
0,70.
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Vergleicht man diese Ergebnisse mit der in der Literatur angegebenen
oben zitierten Feststellung, daß 25 mg Heparin pro Tier bei der Shayratte eine merkliche
Verminderung der Bildung von gastrischem Ulcus erkennen ließen, so zeigt sich auch
hier die Überlegenheit von sulfatierter Amylose gegenüber Heparin, weil schon 12,5
mg sulfatierter Amylose eine sehr beachtliche Wirkung hervorbrachten.
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Das wasserlösliche Salz des Polyschwefelsäureesters, dessen neutrales
Na-Salz etwa 170/0 Schwefel enthält, ist nicht toxisch, (LD50 = 14000 mg/kg per
os, Ratte) aus dem Gastrointestinaltrakt nicht resorbierbar, in Wasser gut löslich
und bewirkt keine Nebenerscheinungen, so daß man es in therapeutisch ausreichenden
Gaben zur Inhibierung der erodierenden Wirkung der gesamten Menge von Pepsin verabreichen
kann. Zur klinischen Prüfung der Wirkung des Na-Salzes der sulfatierten Amylose
wurden in einer Klinik für innere Krankheiten getestet: achtundzwanzig Patienten
- dreiundzwanzig Männer und fünf Frauen - die an Magen- oder noch an Duodenalgeschwüren
litten. Das Präparat wurde in einer täglichen Gabe von 3 bis 8 g, am häufigsten
jedoch von 4 bis 6 g verabreicht, immer ein entsprechender Teil der täglichen Gabe
in der Zwischenzeit zwischen zwei Essen. Diese klinische Behandlung dauerte 14 bis
18 Tage; bei zehn Patienten wurde das Präparat auch nach ihrer Entlassung in einer
täglichen Dosis unter 3 g auf die Dauer von 3 Wochen gegeben, bei einem Patienten
sogar auf die Dauer von 3 Monaten.
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Das Verabreichen dieses Präparates wurde grundsätzlich als einzige
Therapie angewendet. Die Verträglichkeit des Präparates war sehr gut, keiner von
den Patienten meldete irgendwelche unangenehmen Schwierigkeiten. Bei allen Patienten
wurde eine übliche klinische Untersuchung durchgeführt.
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Die Patienten, auch diejenigen mit dem Duodenalgeschwür, meldeten
schon nacil einigen Tagen Verschwinden der Schmerzen. Der Appetit hat sich bei allen
Patienten sehr schnell verbessert und alle haben an Gewicht zugenommen. Bei achtzehn
Patienten wurde die Heilung des Geschwüres während ihres Aufenthaltes in der Klinik
erreicht, bei fünf Patienten kam es zur Heilung erst nach weiteren 3 bis 4 Wochen
nach ihrer Entlassung. Einer von ihnen kam etwa nach 3 Monaten mit Exacerbation
des Geschwüres zurück und wurde wieder mit demselben Präparat erfolgreich kuriert.
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Auch bei einem langfristigen Einnehmen des Präparates war seine Verträglichkeit
sehr gut. Das Verschwinden der okkulten Blutung verlief parallel mit dem Rückgang
des Geschwüres. Die Pepsinaktivität im Magen wies keine wesentlichen Änderungen
auf. Im ganzen kann man sagen, daß sich der Heileffekt des Präparates als sehr gut,
ja sogar überratschend gut, erweist.
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Vom Amylosepolyschwefelsäureester allgemein ist bisher nur eine blutkoagulationshemmende
Wirkung und seine Verwendbarkeit als Heparinoid bekannt, wie sie den Polysaccharid-polyschwefelsäureestern
im allgeineinen eigen ist. Die Herstellung von Polysaccharid-polyschwefelsäureestern
bzw. ihrer Salze erfolgte bisher ausschließlich durch Veresterung von Polysacchariden
mit Chlorsulfonsäure in Gegenwart einer tertiären Base, insbesondere von Pyridin
(vgl. die schweizerische Patentschrift 305 572 und »Zeitschrift für physiologische
Chemie«, 1936, S.163 bis 168). Es wird dabei im allgemeinen so vorgegangen, daß
man Chlorsulfonsäure in einen Überschuß von Pyridin unter Kühlung eintropfen läßt,
das Polysaccharid zugibt und das Reaktionsgemisch mehrere Stunden auf 70 bis 100"C
bzw. 45 Minuten bei Wasserbadtemperatur erwärmt. Der Nachteil dieses Verfahrens
besteht im wesentlichen darin, daß sich dabei tiefgefärbte und toxische Zersetzungsprodukte
bilden, die entfernt werden müssen. Aus der schwei-
zerischen Patentschrift 305 572
ist es bekannt, daß man diese Nachteile vermeiden kann, wenn man die Veresterung
in Gegenwart des als gut lösendes oder gelatinierendes Mittel für Polysaccharide
bekannten Formamids vornimmt, wobei man auf den Zusatz einer tertiären Base, wie
z. B. Pyridin, verzichten kann. Zur Herstellung speziell von Amylosepolyschwefelsäureester
nach diesem Verfahren wurden 25 g Amylose unter Rühren in 250 ml Formamid bei Raumtemperatur
gelöst, dann ließ man bei 20 bis 25"C 35 ml Chlorsulfonsäure zutropfen und die Mischung
20 Stunden bei Raumtemperatur stehen, worauf sie in Methanol eingegossen wurde.
Der abgeschiedene Niederschlag wurde zur Reinigung in Wasser gelöst, mit Ammoniak
alkalisch gemacht, dialysiert, eingeengt und in Methanol gefällt. Als Ausbeute ergaben
sich 30 g weißes Pulver mit einem Schwefelgehalt von 13,2 0wo. Diese Substanz stellt
einen Monoschwefelsäureester der Amylose dar.
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Bei einer Untersuchung, wie weit diese Substanz außer einer blutkoagulationshemmellden
Eigenschaft inhibierend auf die Erosion der Innenwand des menschlichen Magens durch
Pepsin wirkt, wurde festgestellt, daß die Pepsininhibition nur ein Drittel der entsprechenden
pharmakologischen Wirksamkeit des Alkalisalzes der erfindungsgemäß sulfatierten
Amylose besitzt.
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Die Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung des die
erodierende Wirkung von Pepsin auf die Innenwand des menschlichen Magens inhibierenden
neutralen wasserlöslichen Natriumsalzes eines Polyschwefelsäureesters der Amylose,
das etwa 170wo Schwefel enthält, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß man reine
Amylose einem auf 90"C erhitzten Gemisch aus Chlorsulfonsäure und Pyridin zugibt,
dann die Temperatur des Gemisches auf 100 bis 105"C erhöht und das Reaktionsgemisch
etwa 30 Minuten unter starkem Rühren auf dieser Temperatur hält, darauf das Reaktionsprodukt
mit heißem Äthanol ausfällt, die ausgefällte Masse in Wasser löst und durch Versetzen
der so erhaltenen wäßrigen Lösung mit Natriumhydroxydlösung bis zu einem pH-Wert
der wäßrigen Lösung von 7,0 bis 7,5 in das Natriumsalz überführt. Bei diesem Verfahren
werden im Durchschnitt pro Monosaccharideinheit der Amylose zwei Moleküle Schwefelsäure
als saure Schwefelsäureestergruppe eingeführt, es wird also der Dischwefelsäureester
der Amylose gebildet.
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Der Unterschied des eriindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den bekannten
Verfahren zur Herstellung von Pepsininhibitoren, insbesondere gegenüber der bekannten
Herstellung von Amylosepolyschwefelsäureester bzw. dessen Alkalisalz besteht in
Folgendem: 1. Während bei der bekannten Herstellung des Polyschwefelsäureesters
der Amylose die Veresterung in Gegenwart von Formamid vorgenommen wird, wird beim
erfindungsgemäßen Verfahren statt Formamid Pyridin verwendet.
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2. Während bei dem bekannten Verfahren die Amylose in Formamid gelöst
und dieser Lösung Chlorsulfonsäure zugetropft wird, wird beim erfindungsgemäßen
Verfahren das wasserfreie Pyridin erst mit Chlorsulfonsäure gemischt, bevor die
Amylose zugefügt wird.
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3. Während bei dem bekannten Verfahren die Amylose bei Raumtemperatur
in Formamid gelöst und die Chlorsulfonsäure dieser Mischung
bei
20 bis 25"C zutropfen gelassen wird, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren das Gemisch
aus Chlorsulfonsäure und Pyridin erst auf 90"C erhitzt, bevor die Amylose zugegeben
wird.
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4. Während bei den bekannten Verfahren das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur
20 Stunden stehengelassen wird, wird erfindungsgemäß das Reaktionsgemisch bei einer
Temperatur von 100 bis 105"C nur etwa 30 Minuten gerührt, bevor man das Reaktionsgemisch
in heißen Äthylalkohol gießt und weiter bearbeitet.
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Für die Bildung des Dischwefelsäureesters der Amylose sind die beiden
letztgenannten Punkte von besonderer Bedeutung. Eine Sulfatierung von 30 Minuten
ist nach den angestellten Versuchsreihen etwa die optimale Zeit zur Veresterung.
Ein weiteres Erhitzen des Sulfatierungsgemisches verursacht Depolymerisation des
Produktes, wie aus nachstehender Tabelle hervorgeht:
| Zeit der Sulfatierung der Amylose Viskositätszahl rl |
| bei 100 bis 1050C des Produktes |
| 30 Minuten 3,4 |
| 60 Minuten 2,0 |
| 120 Minuten 1,3 |
Aus dieser Tabelle ergibt sich, daß mit der Zeitdauer des Erhitzens die Viskositätszahl
Q des Produktes abnimmt. Das bedeutet, daß das durchschnittliche Molekulargewicht
des Produktes gleichfalls abnimmt. Es tritt Depolymerisation ein, infolgedessen
auch Entwertung des Produktes und Herabsetzung seiner Inhibitionswirkung.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein reines Endprodukt erhalten.
Es enthält keine toxischen Zersetzungsprodukte, mit denen man bisher bei der Veresterung
in Gegenwart einer tertiären Base, insbesondere Pyridin, rechnen mußte. Hierzu trägt
außer den oben aufgezählten Punkten bei, daß die Weiterbearbeitung des Niederschlages
und das Waschen zur restlichen Beseitigung der überschüssigen freien Pyridiniumsalze
in heißem Äthanol erfolgt, während bei den bekannten Verfahren Alkohol von Zimmertemperatur
verwendet wurde.
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Beispiel In einem 3000-ml-Dreihalskolben, welcher mit Rührwerk, Thermometer
und Calciumchloridverschluß versehen ist, trägt man 2100 ml wasserfreies Pyridin
und 480 ml Chlorsulfonsäure ein. Dann erhitzt man die Mischung auf 900 C und gibt
unter starkem Rühren 150 g Amylose zu. Dann erhöht man die Temperatur auf 100 bis
105"C und hält sie unter stetigem starken Rühren 30 Minuten ein.
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Danach gießt man die Reaktionsmischung in 4000 ml heißes Äthanol,
wobei sich das Pyridiniumsalz des sauren Amylosedischwefelsäureesters in Form eines
voluminösen Niederschlages abscheidet.
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Das überschüssige freie Pyridiniumchlorsulfonat geht dabei in Lösung.
Man rührt diese Mischung noch 30 Minuten bei 60 bis 700 C und saugt dann den Niederschlag
durch ein Glasfilter (Nr. G 3) ab und wäscht ihn unter denselben Bedingungen noch
einmal mit 3000 ml heißem Äthanol. Schließlich wäscht man zur restlosen Entfernung
von freiem Pyridiniumchlorsulfonat das Sulfatierungsprodukt auf dem Filter noch
zweimal mit je 500 ml heißem Äthanol und saugt es scharf ab. Eine Probe des Produktes
darf nach Auflösen in Wasser, Ansäuern mit Salzsäure und Erwärmen keinen Niederschlag
mit Bariumchlorid bilden.
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Man löst das Sulfatierungsprodukt in 2000ml destilliertem Wasser
und neutralisiert die Lösung durch Zugabe von 4n-Natronlauge bis pH 7,0 bis 7,5.
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In diese Lösung rührt man dann 30 g Aktivkohle ein und filtriert nach
30 Minuten ab. Aus dem klaren Filtrat fällt man nach Zusatz von 0,90/0ihrer Kochsalzlösung
durch 4000 ml Äthanol das Natriumsalz des Amylosepolyschwefelsäureesters aus. Die
flüssige Phase trennt man ab, wäscht mit 500 ml Äther nach und trocknet. Die Ausbeute
beträgt etwa 260 bis 270 g an trockener Substanz. Das Natriumsalz des Amylosepolyschwefelsäureesters
stellt eine gelbliche, vollkommen wasserlösliche Substanz mit einem Schwefelgehalt
von 1701o dar.