DE1190139B

DE1190139B - Verfahren zur Isolierung von Plasmin- und Trypsin-Inhibitoren aus menschlichen und tierischen Koerperfluessigkeiten

Info

Publication number: DE1190139B
Application number: DEB73063A
Authority: DE
Inventors: Dr Hermann Eduard Schultze; Dr Hans Gerhard Schwick; Dr Norbert Heimburger; Dr Karl Heide; Heinz Haupt
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1963-08-09
Filing date: 1963-08-09
Publication date: 1965-04-01
Also published as: CH475289A; NL6409086A; GB1074437A; AT250563B; BE651649A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND DEUTSCHES '/MW^ PATENTAMT Int. Cl.:

A61k

AUSLEGESCHRIFT

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

Deutsche Kl.: 30 h - 2/04

1190 139
B 73063IV a/30 h
9. August 1963
1. April 1965

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Plasmin- und Trypsin-Inhibitoren aus menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten. Es ist bisher kein Verfahren bekannt, mit dem Plasmin- und Trypsin-Inhibitoren enthaltende Präparate hergestellt werden können.

Es wurde nun ein Verfahren zur Isolierung von Plasmin- und Trypsin-Inhibitoren aus menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man aus menschliehen oder tierischen Körperflüssigkeiten das Fibrinogen und die Lipoproteine durch Fällung mit Acridinderivaten in einer Konzentration bis 10%. vorzugsweise bis 8 %> bezogen auf den Eiweißgehalt, oder mit Chinolinderivaten in einer Konzentration bis 5%, vorzugsweise bis 2%, durch Fällung mit Alkohol, vorzugsweise Äthanol, in einer Konzentration bis 15%, vorzugsweise bis 12%. oder durch Adsorption an Carboxymethylpolysaccharide entfernt, die Plasmin- und Trypsin-Inhibitoren aus diesen Lösungen mit einem Eiweißfällungsmittel, vorzugsweise Acridinderivaten in einer Konzentration von 10 bis 30%» vorzugsweise bis 28 %> oder mit Alkohol, vorzugsweise Äthanol, in einer Konzentration von 20 bis 30%= vorzugsweise von 25 %> bei erniedrigter Temperatur, vorzugsweise von 0 bis —5°C, oder mit Ammonsulfat nach Abscheidung einer bei 35% Ammonsulfatsättigung anfallenden Vorfraktion in einem Sättigungsbereich von 35 bis 70% ausfällt, den dabei erhaltenen Niederschlag auf bekannte Weise, z. B. durch Zentrifugation, gewinnt, in Wasser auflöst, das darin enthaltene Eiweißfällungsmittel auf bekannte Weise entfernt, aus der fällungsmittelfreien Lösung, die die Inhibitoren enthält, eine Begleitproteine enthaltende Nebenfraktion durch Alkohol, vorzugsweise Äthanol, bis zu einer Konzentration von 12% bei erniedrigter Temperatur, vorzugsweise von 0 bis -5⁰C, ausfällt, vom Überstand trennt, in dem Überstand durch Erhöhen des Alkoholgehaltes auf 20 bis 30%, vorzugsweise 25 %> bei einer Temperatur von —5°C die Plasmin- und Trypsin-Inhibitoren ausfällt, das Fällungsmittel auf bekannte Weise, z. B. durch Dialyse, entfernt und die Lösung gegebenenfalls lyophil trocknet.

Als Ausgangsstoffe kommen menschliche und tierische Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blutplasma und Ascitesflüssigkeit, in Frage. Ausscheidungsflüssigkeiten, wie Milch oder Urin, gehören nicht zu den Körperflüssigkeiten im Sinne der Erfindung.

Zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verfährt man zweckmäßig so, daß man die Körperflüssigkeit auf einen Eiweißgehalt von etwa 5 bis 6,5% Verfahren zur Isolierung von Plasmin- und
Trypsin-Inhibitoren aus menschlichen und
tierischen Körperflüssigkeiten

Anmelder:

Behringwerke Aktiengesellschaft,

Marburg/Lahn

Als Erfinder benannt:

Dr. Hermann Eduard Schultze,

Marbach bei Marburg/Lahn;

Dr. Hans Gerhard Schwick, Marburg/Lahn;

Dr. Norbert Heimburger,

Marbach bei Marburg/Lahn;

Dr. Karl Heide,

Heinz Haupt, Marburg/Lahn

bringt, mit einer verdünnten Säure, ζ. Β. 1 η-Essigsäure auf etwa neutralen pH-Wert einstellt und mit einer wäßrigen Lösung eines Acridinderivates, z. B. 2-Äthoxy-6,9-diamino-acridinlactat, bis zu einer Konzentration von 8 % — bezogen auf die Eiweißmenge — versetzt. Zweckmäßig verwendet man eine 3%ige Lösung des Acridinderivates. Dabei wird eine Vorfraktion, die 17% des in der Lösung enthaltenen Proteins enthält, abgetrennt. Die dabei erhaltene Lösung wird schwach alkalisch gemacht, z. B. auf pH 9,0 eingestellt und wieder Fällungsmittel bis zu einer Konzentration von 28 % zugegeben. Im Niederschlag sind die Plasmin- und Trypsin-Inhibitoren enthalten. Er wird bei pH 5,5 in Wasser gelöst und das Fällungsmittel durch festes Natriumchlorid abgetrennt. Darauf wird die die Inhibitoren enthaltende Lösung gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert, anschließend mit Alkohol bis 12% gefällt — bezogen auf das Volumen —, nach Abtrennung des dabei gebildeten Niederschlages bis 25% Alkohol versetzt. In der Alkoholfraktion von 12 bis 25% sind die OC₁- und a₂-Inhibitoren enthalten. Der Niederschlag wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst, die Lösung gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert und darauf gefriergetrocknet.

Als Verbindungen der Acridin- und Chinolinreihe kommen 3,6-Diamino-lO-methylacridinum-chlorid, 5-Aminoacridin, a,y-Trimethylenglykol-di-(2-methyl-

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4-amino)-6-chinolyläther-diacetat, Di-n-butylmalonsäure-N-N-di-(2-methyl-4-amino-chinolyl-6)-diacetat und vorzugsweise 2-Äthoxy-6,9-diamino-acridinlactat und Bis - (2 - methyl - 4 - amino - chinolyl - 6) - carbamid hydrochlorid in Betracht.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu erblicken, daß die übrigen Serumproteine ohne Einbuße ihrer biologischen Aktivität aus den abgetrennten Fraktionen unter sterilen Bedingungen isoliert werden können. Außerdem erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren, große Mengen des Ausgangsmaterials aufzuarbeiten und dadurch große Mengen der Plasmin- und Trypsin-Inhibitoren zu isolieren.

Das erfindungsgemäß hergestellte Gemisch der Plasmin- und Trypsin-Inhibitoren hat Bedeutung bei der Therapie von Pankreatitiden, Pankreasnekrosen und Verbrennungsschäden.

Beispiel 1

5 1 Humanblutplasma mit einem Eiweißgehalt von 6,2 °/₀ werden mit 1,21 0,85%iger Natriumchloridlösung auf 5% Eiweiß und mit 1 η-Essigsäure auf pH 7,2 eingestellt. Zu dieser Lösung werden unter mechanischem Rühren 830 ml einer 3%igen Lösung von 2-Äthoxy-6,9-diaminoacridinlactat gegeben. Der entstandene Niederschlag, der 17% des eingesetzten Proteins ausmacht, wird durch Zentrifugation von der die übrigen Proteine enthaltenden Lösung abgetrennt. Diese wird mit 1 η-Natronlauge auf pH 9,0 eingestellt. Dann setzt man 2,061 der vorgenannten 3°/oig^en Lösung, bezogen auf Protein, zu. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren von der gammaglobulin- und transferrinhaltigen Lösung abgetrennt. Der Niederschlag, der noch 58 % der Plasmaproteine enthält, wird in 61 Wasser vom pH 5,5 — durch Essigsäure eingestellt — gelöst und das Fällungsmittel durch 300 g festes Natriumchlorid ausgefällt und durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird gegen 0,9%ige Natriumchloridlösung 24 Stunden bei zweimaligem Wechsel dialysiert. Dabei werden 7,341 Lösung mit einem Eiweißgehalt von 2,45 °/₀ erhalten, die bei einer Temperatur von 0 bis -5⁰C unter mechanischem Rühren mit 11 95%igem Äthanol versetzt wird. Der Alkoholgehalt beträgt dann 12%· Der Niederschlag, der das Coeruloplasmin und die ß_tA- und /Sjc-Globuline enthält, wird durch Zentrifugation von der Lösung getrennt, deren Alkoholgehalt bei — 5° C durch Versetzen mit 1,45195%igem Äthanol auf 25% erhöht wird. Durch diese Fällung werden die Ot₁- und «_a-Inhibitoren ausgefällt. Der Niederschlag wird in 85%iger NaCl-Lösung pH 7,0 gelöst, 24 Stunden bei zweimaligem Wechsel gegen 0,85%ige NaCl-Lösung pH 7,0 dialysiert und anschließend lyophil getrocknet. Diese Substanz, die die ganze im Plasma enthaltene Menge der A₁- und «₂-Inhibitoren enthält, besitzt einen Reinheitsgrad von etwa 80% und enthält noch geringe Mengen Albumin.

Beispiel 2

51 Humanblutplasma mit einem Eiweißgehalt von 6,2 % werden mit 1 η-Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt. Zu dieser Lösung werden unter mechanischem Rühren 930 ml einer l%igen Lösung von Bis-(2-methyl - 4 - aminochinolyl - 6) - carbamidhydrochlorid gegeben. Der Gehalt, auf Eiweiß bezogen, beträgt dann 3%· D^er entstandene Niederschlag, der 19% des eingesetzten Proteins ausmacht, wird durch Zentrifugation von der die übrigen Proteine enthaltenden Lösung abgetrennt. Der Fällungsmittelgehalt dieser Lösung wird durch Einrühren von 4,651 der obigen Lösung auf 18%! bezogen auf Protein, erhöht. Auch hierbei entsteht durch das Bis-(2-methyl-4-aminochinolyl-6)-carbamid-hydrochlorid ein Niederschlag, der durch Zentrifugieren von der globulin- und transferrinhaltigen Lösung abgetrennt wird. Der Niederschlag, der 60% der Plasmaproteine enthält, wird in Wasser vom pH 9,0 — durch NaOH eingestellt — gelöst und das Fällungsmittel durch 300 g festes Ammoniumsulfat ausgefällt und durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird gegen 0,9%ige Natriumchloridlösung 24 Stunden in zweimaligem Wechsel dialysiert. Dabei werden 7,341 Lösung mit einem Eiweißgehalt von 2,55% erhalten, die bei einer Temperatur von 0 bis —5°C unter mechanischem Rühren ao mit 11 95 %igem Äthanol versetzt wird. Der Alkoholgehalt beträgt dann 12%· Der Niederschlag, der das Coeruloplasmin und die ß_tA- und /^c-Globuline enthält, wird durch Zentrifugation von der Lösung getrennt, deren Alkoholgehalt bei —5°C durch Veras setzen mit 1,451 95%igem Äthanol auf 25% erhöht wird. Durch diese Fällung werden die Oc₁- und oc_s-Inhibitoren aufgefällt. Der Niederschlag wird in 0,85%iger NaCl-Lösung pH 7,0 gelöst, 24 Stunden bei zweimaligem Wechsel gegen 0,85%ige NaCl-Losung pH 7,0 dialysiert und anschließend lyophil getrocknet. Diese Substanz, die die ganze im Plasma enthaltene Menge der X₁- und «₂-Inhibitoren enthält, besitzt einen Reinheitsgrad von etwa 80% und enthält noch geringe Mengen Albumin.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Isolierung von Plasmin- und Trypsin-Inhibitoren aus menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten, dadurchgekennzeichnet, daß man aus menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten das Fibrinogen und die Lipoproteine durch Fällung mit Acridinderivaten in einer Konzentration bis 10%, vorzugsweise bis 8%, bezogen auf den Eiweißgehalt, oder mit Chinolinderivaten in einer Konzentration bis 5%> vorzugsweise bis 2%> durch Fällung mit Alkohol, vorzugsweise Äthanol, in einer Konzentration bis 15 %, vorzugsweise bis 12%, oder durch Adsorption an Carboxymethylpolysaccharide entfernt, die Plasmin- und Trypsin-Inhibitoren aus diesen Lösungen mit einem Eiweißfällungsmittel, vorzugsweise Acridinderivaten in einer Konzentration von 10 bis 30 %> vorzugsweise bis 28 %, oder mit Alkohol, vorzugsweise Äthanol, in einer Konzentration von 20 bis 30%, vorzugsweise von 25%» bei erniedrigter Temperatur, vorzugsweise von 0 bis —5°C, oder mit Ammonsulfat nach Abscheidung einer bei 35 % Ammonsulfatsättigung anfallenden Vorfraktion in einem Sättigungsbereich von 35 bis 70 % ausfällt, den dabei erhaltenen Niederschlag auf bekannte Weise, z. B. durch Zentrifugation, gewinnt, in Wasser auflöst, das darin enthaltene Eiweißfällungsmittel auf bekannte Weise entfernt, aus der fällungsmittelfreien Lösung, die die Inhibitoren enthält, eine Begleitproteine enthaltende Nebenfraktion durch Alkohol,

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vorzugsweise Äthanol, bis zu einer Konzentration 25°/o> bei einer Temperatur von —5°C die Plasminvon 12% bei erniedrigter Temperatur, Vorzugs- und Trypsin-Inhibitoren ausfällt, das Fällungsweise von 0 bis —5°C, ausfällt, vom Überstand mittel auf bekannte Weise, z. B. durch Dialyse, trennt, in dem Überstand durch Erhöhen des entfernt und die Lösung gegebenenfalls lyophil Alkoholgehaltes auf 20 bis 30%. vorzugsweise 5 trocknet.

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