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Diagnostiziermittel zur Bestimmung von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten
Der qualitative und quantitative Nachweis von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten,
z. B. im Urin, hat eine große diagnostische Bedeutung, insbesondere bei Nierenerkrankungen,
aber auch bei Kreislaufschwäche, Arteriosklerose, Hypertonie, Diabetes. Es sind
eine Reihe von Methoden zum Nachweis von Eiweiß bekanntgeworden, z. B. die Sulfosalicylsäureprobe,
Essigsäure-Kochprobe, Salpetersäure-Ringprobe, Pikrinsäureprobe; alle diese Methoden
beruhen auf Fällungsreaktionen und sind ohne Laboratoriumsgeräte nicht durchführbar.
Für schnelldiagnostische Zwecke kommen diese Reaktionen daher nicht in Betracht;
hierfür benötigt man eine einfache Farbreaktion, welche auch durch ungeschultes
Personal routinemäßig durchgeführt werden kann, z. B. mit Hilfe von Testpapieren.
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Eine für den Eiweißnachweis geeignete Farbreaktion - wurde erstmals
von F e i g 1 et al. (Mikrochim. Acta, 2, 1937, S. 107) beschrieben. Diese Reaktion
nutzt den bei verschiedenen Indikatoren bekannten sogenannten »Proteinfehler« aus:
Wird der pH-Wert des Reagenzes unterhalb des Indikatorumschlagbereiches gehalten,
so tritt bei Zugabe von Eiweißlösung eine Farbänderung ein, die vom pH-Wert unabhängig
ist und durch den Eiweißgehalt bedingt wird; die Farbintensität der entstehenden
Farbe ist abhängig von der Konzentration des Eiweiß in der zu prüfenden Lösung.
F e i g 1 arbeitete diesen Eiweißnachweis als Tüpfelreaktion aus, wobei er als Reagenzien
das Kaliumsalz des Tetrabromphenolphthaleinäthylesters und Essigsäure verwandte.
Zur Herstellung von Eiweiß-Testpapieren auf Basis der Feigl-Reaktion muß natürlich
die Essigsäure durch eine nichtflüchtige Säure ersetzt werden; nach den Verfahren
der britischen Patentschriften 814 223, 826 066 und 840 362 verwendet man hierfür
zweckmäßig eine saure Puffersubstanz, wie z. B.
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Citratpuffer. Die auf diese Weise erhaltenen Eiweiß-Teststreifen
befriedigen jedoch nicht völlig, da die Farbkontraste von negativer und positiver
Eiweißprobe in Konzentrationsbereichen unterhalb 0,10/, Eiweiß sehr wenig differieren;
der positive Test fällt mehr oder weniger stark gelbgrün aus, der negative Test
ist grüngelb und ist dunkler gefärbt als der trockene Teststreifen.
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Es wurde nun gefunden, daß der genannte Eiweiß-Nachweis wesentlich
empfindlicher wird, wenn man an Stelle der üblichen sauren Puffersubstanzen gewisse
Acylharnstoffderivate verwendet, die zufolge eines beweglichen Wasserstoffatoms
an der Amidfunktion Säureeigenschaften aufweisen. Mit den auf diese Weise erhaltenen
Teststreifen kann Eiweiß noch in einer Konzentration von 0,01 0/o im Urin deutlich
mit einer
blaugrünen Färbung nachgewiesen werden. Eine Konzentration von 1 °/o Eiweiß
im Urin ergibt eine rein blaue Färbung. Bei normalem, eiweißfreiem Urin zeigt der
Streifen dann eine leuchtendgelbe Färbung, nämlich die unveränderte Farbe des Teststreifens.
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Das den Gegenstand der vorliegenden Erfindung: bildende Diagnostiziermittel
zur Bestimmung von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten besteht demgemäß aus einem
Farbstoffindikator, welcher den sogenannten »Proteinfehler« aufweist, einer sauren
Substanz und einem saugfähigen Träger und ist dadurch gekennzeichnet, daß es als
saure Substanz ein Acylharnstoffderivat der Formel R-X-NH-CO-NH-R1, in welcher X
eine Sulfonyl- oder Carbonylgruppe, R einen Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylrest und
R1 Wasserstoff oder einen Alkyl-, Cycloalkyl- oder Acylrest bedeutet, wobei die
beiden Reste R und R1 auch zusammen einen Ring bilden können, enthält.
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Brauchbare Acylharnstoffderivate sind z. B. die Barbitursäure und
ihre C-Substitutionsprodukte, wie Diäthylbarbitursäure und Phenyläthylbarbitursäure,
ferner die verschiedenen Sulfonylharnstoffe, wie Nl - Sulfanilylharnstoff, N1 -
Acetylsulfanilylharnstoff, Bis - acetylsulfanilylharnstoff, Nl - Acetylsulfanilyl-N2
- acetylharnstoff, Bis - p - toluolsulfonylharnstoff, Nl-(p-Toluolsulfonyl)-N2-(n-butyl)-harnstoff,
Nl-Butansulfonylharnstoff, Nl-Butansulfonyl-N2-(n-butyl)-harnstoff, Nl-Cyclohexansulfonyl-N2-(n-butyl)-harnstoff,
Nl-(4-Methyl-metanilyl)-N2-cyclohexylharnstoff.
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Als Farbstoffindikatoren kommen solche in Betracht, die einen großen
Eiweißfehler bei einem Indikatorumschlag im sauren pH-Bereich haben, z. B. Tetrabromphenolphthalein-äthylester
und-butylester, Bromphenolblau, Bromchlorphenolblau, Bromkresolgrün.
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Um einen raschen Farbumschlag bei der Durchführung der Nachweisreaktion
zu erhalten, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das Diagnostiziermittel
neben den relativ schwer löslichen Acylharnstoffderivaten noch eine nichtflüchtige,
mehrwertige, aliphatische Carbonsäure enthält; hierfür haben sich insbesondere Bernsteinsäure,
Citronensäure, Weinsäure und Oxalsäure gut bewährt.
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Die Herstellung der erfindungsgemäßen Diagnostiziermittel erfolgt
in üblicher Weise: Der Farbstoffindikator wird zusammen mit dem Acylharnstoffderivat
(sowie gewünschtenfalls einer nichtflüchtigen mehrwertigen aliphatischen Carbonsäure)
in einem geeigneten leicht flüchtigen organischen Solvens (z. B.
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Methanol, Aceton) gelöst; mit der erhaltenen Lösung imprägniert man
den saugfähigen Träger, z. B. Filterpapier, und trocknet anschließend an der Luft.
Zweckmäßig fügt man der Farbstofflösung eines der üblichen oberflächenaktiven Mittel
zu, z. B. Natriumlaurylsulfat oder Polyoxyäthylensorbitan-monolaurat; hierdurch
wird beim Gebrauch des Testpapieres eine beschleunigte Aufnahme der Testflüssigkeit
und somit eine schnellere und gleichmäßigere Färbung des Reagenzpapiers erzielt.
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In den nachstehenden Beispielen ist die Zusammensetzung der erfindungsgemäßen
Diagnostiziermittel näher erläutert.
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Beispiel 1 Zusammensetzung der Imprägnierlösung Tetrabromphenolphthaleinäthylester
........................ 0,025 g 5,5-Diäthylbarbitursäure ......... 4,0 g Bernsteinsäure
................. 1,25 g Natriumlaurylsulfat ............ 0,025 g Aceton ...................
.... ad 100 ml Mit dieser Lösung werden Filterpapiere imprägniert und an der Luft
getrocknet. Die erhaltenen Teststreifen sind leuchtend gelb gefärbt und geben mit
Eiweißlösungen abgestufte Färbungen (bei 1 0/o Eiweiß blau, bei 0,01 °/o Eiweiß
blaugrün).
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Beispiel 2 Zusammensetzung der Imprägnierlösung Sulfanilylharnstoff
............. 1,0 g Bernsteinsäure ................. 2,0 g Natriumlaurylsulfat .............
0,01 g Tetrabromphenolphthaleinäthylester ....................... 0,025 g Methanol
...................... ad 100 ml
Mit dieser Lösung imprägniertes Papier ist gelb
gefärbt, es entwickelt bei einer Konzentration von 0,01 01o Eiweiß eine Blaugrünfärbung
und bei °/o Eiweiß eine intensive Blaufärbung.
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Beispiel 3 Zusammensetzung der Imprägnierlösung Sulfanilylharnstoff
............. 4,0 g Bernsteinsäure ................. 4,0 g Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat
0,5 g Bromophenolblau ................ 0,01 g Methanol ...................... ad
100 ml Das mit einer derartigen Lösung imprägnierte Papier ist gelb gefärbt; es
entwickelt bei 0,01 °/o Eiweiß eine blaugrüne Färbung und bei 1 01o Eiweiß eine
intensive blaue Farbe.