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TECHNISCHES GEBIET
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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Chromatographie-Massenspektrometrie und einen Chromatograph-Massenspektrometer.
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STAND DER TECHNIK
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In den letzten Jahren ist die quantitative Analyse mittels eines Flüssigkeitschromatograph-Massenspektrometers häufig verwendet worden, um pharmazeutische Komponenten und Stoffwechselprodukte in Biofluiden bzw. Rückstände in Umweltproben usw. zu analysieren. Als Flüssigkeitschromatograph wird ein HPLC-Typ, bei dem die Trennungszeit an der Säule höchstens Dutzende Minuten dauert, oder ein UHPLC-Typ, bei dem die Trennung in höchstens einige Minuten erfolgt, verwendet. Unter die Massenspektrometer zur Erkennung von getrennten Komponenten fallen z. B. Quadrupol-, lonenfalle- und Flugzeit-Massenspektrometer. Diese kommen dem Analysezwecke entsprechend zur Verwendung, aber meistens wird ein Quadrupol-Massenspektrometer verwendet, wenn die quantitative Analyse bezweckt wird.
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Am Quadrupol-Massenspektrometer kann die Probe durch Abtasten oder SIM (Selected Ion Monitoring) gemessen werden. Das Abtasten wird für die qualitative Analyse von unbekannten Proben usw. verwendet, wobei die lonenmenge für ein Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) in einem vorgegebenen Bereich als Signal erkannt wird. Bei SIM wird die lonenmenge für ein vorherbestimmtes Masse-zu-Ladung-Verhältnis selektiv erkannt. Bei Triple-Quadrupol-Massenspektrometern u. dgl. wird auch SRM (Selected Reaction Monitoring) benutzt, bei dem die Menge der aus dem Zielanalyten erzeugten bestimmten Produktionen selektiv erkannt wird. Durch diese Methoden kann die quantitative Analyse mit hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden, wenn das Masse-zu-Ladung-Verhältnis der aus dem Zielanalyten stammenden Ionen bzw. dessen Produktionen schon bekannt ist.
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Zur Identifizierung der pharmazeutischen Komponenten und Stoffwechselprodukte in Biofluiden bzw. Rückstände in Umweltproben usw. werden durch SIM oder SRM des Flüssigkeitschromatograph-Massenspektrometers Chromatogramme, die die zeitliche Veränderung der Ionenmengen zeigen, gewonnen und daraus die dem Zielanalyten und internen Standardmaterial entsprechenden Peaks erkannt, aus denen die Messwerte gewonnen werden. Bei der Peakerkennung werden im Allgemeinen nach der Beurteilung des Peakstartpunktes und Peakendpunktes die Peakfläche und Peakhöhe als Messwerte berechnet. Mittels der Retentionszeit des Peaks werden der Zielanalyt und das interne Standardmaterial beurteilt, aber die Retentionszeit hängt von der Sorte bzw. dem Zustand der Säule des Flüssigkeitschromatographs und den Trennungsbedingungen ab. Die Peakerkennungsverfahren umfasst die Gradientenerkennung der Datenveränderung usw. Als entwickelte Verfahren davon werden die Schulter-Peak-Erkennung, wie in Patentliteratur 1 gezeigt, die Erkennung durch Anpassung an beliebigen Funktionen, wie in Patentliteratur 2 gezeigt, usw. angeführt.
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LITERATUR DES STANDES DER TECHNIK
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PATENTLITERATUR
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- Patentliteratur 1: JP S61-145457 A
- Patentliteratur 2: JP S63-151851 A
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KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
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DURCH DIE ERFINDUNG ZU LÖSENDE AUFGABE
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Wenn man einen Peak aus einem Chromatogramm identifizieret und die Peakfläche und -höhe berechnet, erkennt man den Peak z. B. mit Hilfe des Verfahrens gemäß Patentliteratur 1 oder 2. Bei der Analyse der pharmazeutischen Komponenten und Stoffwechselprodukte in Biofluiden bzw. Rückstände in Umweltproben usw. ist der Zielanalyt jedoch gegebenenfalls in einer sehr geringen Menge vorhanden. In diesem Fall erscheint kein klarer Peak auf dem Chromatogramm, und somit ist die Erkennung des Peaks schwierig, da dabei zur Erkennung des Zielanalyten die Entfernung von Geräuschen und die hochentwickelte Signalverarbeitung kombiniert werden müssen.
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Bei der chromatographischen Analyse besteht ein Problem der Schwankung der Retentionszeit. Die Verstopfung der Kanäle, Verschlechterung der Säulen und feine Unterschiede der Umgebungstemperatur bzw. Säulentemperatur beeinflussen die Retentionszeit des Zielanalyten. Deshalb wird im Allgemeinen ein Zeitbereich vorgesehen und dann die Peakstelle gesucht, auch wenn die Retentionszeit des Zielanalyten unter vorgegebenen Analysebedingungen bekannt ist. Die Messwerte des Zielanalyten sind noch schwieriger zu berechnen, wenn neben der vorgenannten schwierigen Peakerkennung die Schwankung der Retentionszeit in Betracht gezogen wird.
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Wie oben erwähnt, ist ein Verfahren erforderlich, bei dem auch bei einer geringen Menge am Zielanalyten die Peakstelle genau identifiziert werden kann und die Berechnung der Messwerte ermöglicht wird.
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MITTEL ZUM LÖSEN DER AUFGABE
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Die erfindungsgemäße Chromatographie-Massenspektrometrie umfasst als eine Ausführungsform einen Schritt zum Zusetzen eines internen Standardmaterials zu einer Probe, dessen Retentionszeit derjenigen eines Zielanalyten ähnlich ist und dessen Masse-zu-Ladung-Verhältnis sich von demjenigen des Zielanalyten unterscheidet, einen Schritt zum Messen der Probe mit einem Chromatograph-Massenspektrometer zur Gewinnung eines Chromatogramms des Zielanalyten und eines Chromatogramms des internen Standardmaterials, einen Schritt zum Erkennen eines Peaks aus dem Chromatogramm des internen Standardmaterials zur Ermittlung der Peakstartzeit und Peakendzeit des Peaks und einen Schritt zum Anwenden der ermittelten Peakstartzeit und Peakendzeit auf die Peakstartzeit und Peakendzeit des Chromatogramms des Zielanalyten.
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Der erfindungsgemäße Chromatograph-Massenspektrometer umfasst als eine Ausführungsform einen Chromatograph-Massenspektrometer zum simultanen Messen eines Zielanalyten und eines internen Standardmaterials zur Gewinnung eines Chromatogramms des Zielanalyten und eines Chromatogramms des internen Standardmaterials, wobei der Chromatograph-Massenspektrometer ein Peakerkennungsteil zur Ermittlung eines Peakstartpunktes und Peakendpunktes aus dem Chromatogramm des internen Standardmaterials, ein Peakbereich-Erkennungsteil zum Auszug der Peakstartzeit und Peakendzeit aus dem am Peakerkennungsteil erkannten Peakstartpunkt und Peakendpunkt, und ein Peakbereich-Anwendungsteil zum Anwenden der am Peakbereich-Erkennungsteil ausgezogenen Peakstartzeit und Peakendzeit auf den Peakstartpunkt und Peakendpunkt des Chromatogramms des Zielanalyten aufweist.
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EFFEKTE DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden Erfindung kann man die Messwerte ohne Einflüsse der Qualität des Chromatogramms des Zielanalyten berechnen.
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Die übrigen Aufgaben, Strukturen und Effekte der Erfindung werden durch die nachfolgende Erläuterung der Ausführungsform klargestellt.
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Figurenliste
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- 1: eine Konzeptskizze zur Darstellung eines Beispiels, in dem die Retentionszeit des Peakstartpunktes und -endpunktes des Chromatogramms des internen Standardmaterials auf den Peakstartpunkt und -endpunkt des Chromatogramms des Zielanalyten angewandt wird.
- 2: eine schematische Ansicht zur Darstellung eines Beispiels der Struktur eines Flüssigkeitschromatograph-Massenspektrometers.
- 3: eine Konzeptskizze zur Darstellung von Beispielen der durch das interne Standardverfahren gefertigten Proben und Beispielen der Signalintensitäten bei der Messung der Proben mit dem Massenspektrometer.
- 4: ein Diagramm zur Darstellung eines Beispiels der durch das interne Standardverfahren gebildeten Kalibrierkurve.
- 5: Diagramme zur Darstellung eines Beispiels der Messergebnisdaten von SRM bei unbekannten Proben von Testosteron und Testosteron 13C.
- 6: ein Diagramm zur Darstellung eines Beispiels der graphischen Benutzerschnittstelle.
- 7: Diagramme zur Darstellung eines Beispiels, in dem die Retentionszeit des Peakstartpunktes und -endpunktes von Testosteron d3 auf den Peakstartpunkt und -endpunkt von Testosteron und Testosteron 13C angewandt wird.
- 8: ein Funktionsplan zur Darstellung eines Beispiels der Struktur für die Peakerkennung.
- 9: ein Ablaufdiagramm zur Darstellung des Ablaufs bei der Verarbeitung für die Peakerkennung.
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AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
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Im Folgenden wird die Ausführungsform der Erfindung anhand der Figuren erläutert. Die Ausführungsform der Erfindung wird jedoch nicht auf die später erwähnten Ausführungsbeispiele beschränkt, sondern kann im Bereich deren technischen Begriffs verschiedenartig variiert werden.
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Hierbei wird als Beispiel des Chromatograph-Massenspektrometers ein Flüssigkeitschromatograph-Massenspektrometer angeführt. Die vorliegende Erfindung kann auch auf einen Gaschromatograph-Massenspektrometer angewandt werden, sofern der Zielanalyt und das interne Standardmaterial simultan gemessen werden können.
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(AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 1)
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Mit einer einfachsten Vorrichtungsstruktur eines generellen Flüssigkeitschromatograph-Massenspektrometers wird ein Beispiel zur Erkennung von Testosteron, also ein männliches Hormon, erläutert. 2 ist eine schematische Ansicht zur Darstellung eines Beispiels der Struktur eines Flüssigkeitschromatograph-Massenspektrometers.
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Ein Lösungsmittelförderungsteil 201 fördert Lösungsmittel, wie Wasser, Acetonitril. Im Allgemeinen werden zwei oder mehr Lösungsmittel vorgesehen, wobei die isokratische Elution mit dem fixierten Verhältnis bzw. eine Gradienten-Elution, bei der die Zusammensetzung der Lösungsmittel nach dem Zeitprogramm geändert wird, möglich ist. Durch das Lösungsmittelförderungsteil 201 werden die Lösungsmittel nicht nur während der Analyse, sondern auch stets gefördert, um die Glättung und Stabilisation eines Probetrennungsteils 204 zu erzielen.
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An einem Probeeinführungsteil 202 werden die Proben, die der Analyst analysieren will, vorgesehen und durch den Probeeinführungsmechanismus, der einen Autosampler genannt wird, nach und nach angesogen. Zudem ist es notwendig, Bauteile, wie Nadeln, Probeeinführungskanäle usw. nach jedem Probesaugen zu waschen. Deshalb ist im Allgemeinen ein Waschmechanismus zusätzlich angebracht, dessen Darstellung in der Figur jedoch ausgelassen ist.
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Bei einem Probeeinspritzungsteil 203 handelt es sich um ein Bauteil zur Einspritzung der am Probeeinführungsteil angesogenen Probe in den aus dem Lösungsmittelförderungsteil laufenden Kanal. Dafür wird im Allgemeinen ein 6-Wege-Ventil verwendet, das mit einer Leitung kombiniert ist, die eine Probeschleife genannt wird. Die Probeschleife ist normalerweise mit der Seite des Probeeinführungsteils verbunden. Sie ist derart ausgebildet, dass beim Ansaugen der Probe die durch das Probeeinführungsteil angesogene Probe in die Probeschleife eingeführt und nach der Vollendung der Einführung die mit der Probe gefüllte Probeschleife auf den zum Probetrennungsteil führenden Kanal umgeschaltet wird, damit die Probe in den Kanal, der vom Lösungsmittelförderungsteil 201 zum Probetrennungsteil 204 führt, eingespritzt wird.
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Am Probetrennungsteil 204 ist eine Säule zur Trennung der Probe in einzelne Komponenten vorgesehen. Bei der Säule handelt es sich um einen metallischen Zylinder, der mit einem Füllmaterial, wie Silikagel oder Polymer, gefüllt ist. Von einer Seite der Säule wird die Probe darin eingespritzt, während die Förderung des Lösungsmittels fortgesetzt wird. Dadurch werden die Komponenten jeweils mit einer Geschwindigkeit, die der Affinität zwischen der Komponente und dem Füllmaterial entspricht, in der Säule bewegt. Mittels dieses Prinzips werden die Komponenten getrennt. Die Eigenschaften der Säule unterscheiden sich abhängig von der Sorte und Korngröße des Füllmaterials in hohem Maße, so dass die Säule entsprechend der Sorte der zu trennenden Komponente bzw. dem Zweck geeignet ausgewählt werden muss.
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Bei einem massenspektrometrischen Teil 205 handelt es sich um ein Bauteil, an dem die am Probetrennungsteil 204 getrennten Komponenten ionisiert und entsprechend dem Masse-zu-Ladung-Verhältnis erkannt werden. Unter lonisierungsverfahren fallen die Elektrospray-Ionisierung (ESI), die chemische Ionisierung bei Atmosphärendruck (APCI) usw. Für das massenspektrometrischen Teil werden Quadrupol-, lonenfalle-, Flugzeit-Massenspektrometer im Allgemeinen verwendet. Unter die Quadrupol-Massenspektrometer fallen neben denjenigen, an denen eine Quadrupol-Stufe angeordnet ist, auch Triple-Quadrupol-Massenspektrometer, an denen drei Stufen angeordnet sind. Sie schließen solche ein, an denen die auf der ersten Stufe ausgewählten Ionen auf der zweiten Stufe gespaltet, dann aus den erzeugten Produktionen solche mit einem bestimmten Masse-zu-Ladung-Verhältnis auf der dritten Stufe ausgewählt und gemessen werden können. Dieses Messverfahren wird SRM genannt.
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Die Ionen, die entsprechend dem Masse-zu-Ladung-Verhältnis ausgewählt und in den Detektor eingeführt wurden, werden als ein Signal erkannt, das ihrer Menge entspricht. Ferner wird das Signal der am massenspektrometrischen Teil 205 erkannten lonenmenge einem Analyseteil 206 gesendet und dort als SIM- oder SRM-Chromatogramm verschiedenen Datenverarbeitungen, wie Glättung, Peakerkennung, Fläche- und Höheberechnung usw. unterworfen. Die hier berechnete Peakfläche und Peakhöhe dienen als Messwerte.
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Wenn man den Gehalt und die Konzentration einer bestimmten Komponente in einer unbekannten Probe analysieren will, analysiert man zuerst die im Zielkonzentrationsbereich hergestellten Standardproben in mehreren Konzentrationsreihen mit einem Analysator und leitet aus der Zuordnung der berechneten Messwerte auf die bekannten Konzentrationen ein Diagramm ab, das die Beziehung zwischen den Messwerten und den Konzentrationen zeigt. Dieses Diagramm wird als Kalibrierkurve bezeichnet. Anschließend misst man die unbekannte Probe, berechnet die Messwerte des Zielanalyten und danach berechnet den Konzentrationswert unter Anwendung der Kalibrierkurve. Auf diese Weise kann man durch Bildung der Kalibrierkurve die Probe mit einer unbekannten Konzentration messen und aus der Kalibrierkurve ihre Konzentration für die Messwerte vermuten.
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Bei der quantitativen Analyse mit einem Flüssigkeitschromatograph-Massenspektrometer kommt das interne Standardverfahren im Allgemeinen zur Verwendung. Beim internen Standardverfahren wird z. B. einer aus einem lebenden Körper gewonnenen Probe ein internes Standardmaterial zugesetzt, dessen Retentionszeit derjenigen des Zielanalyten ähnlich ist und dessen Masse-zu-Ladung-Verhältnis sich von demjenigen des Zielanalyten unterscheidet. 3 zeigt eine Konzeptskizze zur Darstellung von Beispielen der durch das interne Standardverfahren gefertigten Proben und Beispielen der Signalintensitäten bei der Messung der Proben mit dem Massenspektrometer. Standardproben 311 bis 313, in denen eine feste Menge eines internen Standardmaterials 302 einem Zielanalyt 301 mit verschiedenen, der Messkonzentrationsreihe entsprechenden Konzentrationen zugesetzt ist, und eine unbekannte Probe 314 werden gemessen. Bei der Datenverarbeitung wird der Peak 321 des Zielanalyten und der Peak 322 des internen Standardmaterials an den einzelnen Standardproben 311 bis 313 jeweils einer Peakerkennung unterworfen und das Verhältnis der Messwerte, d. h. Wert von (Messwerte des Zielanalyten) / (Messwerte des internen Standardmaterials), auf die bekannten Konzentrationen zugeordnet, um eine Kalibrierkurve anzufertigen.
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4 zeigt ein Diagramm zur Darstellung eines Beispiels der durch das interne Standardverfahren gebildeten Kalibrierkurve. Die Messwerte des Zielanalyten der Standardproben 311 bis 313 werden als a1 bis a3 und die Messwerte des internen Standardmaterials als i1 bis i3 jeweils bezeichnet, wobei für die bekannten Konzentrationen c1 bis c3 des in den einzelnen Standardproben enthaltenen Zielanalyten eine Kalibrierkurve 401 gezogen werden kann. Danach wird die unbekannte Probe 314 gemessen, und die Konzentration cu des in der unbekannten Probe enthaltenen Zielanalyten kann aus dem Messwert au des Zielanalyten und dem Messwert iu des internen Standardmaterials berechnet werden. D. h. die Konzentration cu kann ermittelt werden, indem der Wert des Verhältnisses (au / iu) auf die Kalibrierkurve 401 angewandt wird.
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Auf diese Weise hat das interne Standardverfahren, in dem die Berechnung unter Verwendung des Verhältnisses der Messwerte des Zielanalyten und des internen Standardmaterials erfolgt, den Vorteil darin, dass Fehlerfaktoren, wie z. B. Fehler der Einspritzmenge der Probe bzw. Fehler durch verflüchtigte Lösungsmittel, durch Berechnung des Verhältnisses ausgeglichen und somit auf die Ergebnisse keine Einflüsse ausgeübt werden. Deshalb ist es erforderlich, das interne Standardmaterial derart auszuwählen, dass die chemischen Verhalten des Zielanalyten und des internen Standardmaterials möglichst gleich sind.
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Beim Flüssigkeitschromatograph-Massenspektrometer wird im Allgemeinen ein Element, das mit stabilen Isotopen markiert ist, als internes Standardmaterial gegenüber dem Zielanalyten verwendet, um aufgrund des Unterschieds des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses am massenspektrometrischen Teil die Trennung und Erkennung durchzuführen. Konkret wird als internes Standardmaterial eine mit stabilen Isotopen markierte Verbindung verwendet, in der die den Zielanalyten ausbildenden Atome zum Teil durch ein stabiles Stickstoff-Isotop 15N, ein stabiles Kohlenstoff-Isotop 13C, ein stabiles Sauerstoff-Isotop 180, ein stabiles Wasserstoff-Isotop 2H usw. ersetzt sind. Für Testosteron kann z. B. ein solches mit der 13C-Markierung (im nachstehenden als Testosteron 13C bezeichnet) angeführt werden. Ihre Konzentration kann entsprechend der Empfindlichkeit und Genauigkeit des Massenspektrometers auf eine beliebige Größe eingestellt werden und z. B. 500 fmol sein.
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1 zeigt eine Konzeptskizze zur Darstellung eines Ausführungsbeispiels, in dem die Retentionszeit des Peakstartpunktes und -endpunktes des Chromatogramms des internen Standardmaterials auf den Peakstartpunkt und -endpunkt des Chromatogramms des Zielanalyten angewandt wird.
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Bei simultaner Messung des Zielanalyten und des internen Standardmaterials mittels SRM werden zwei Chromatogramme, also Chromatogramm 101 des Zielanalyten und Chromatogramm 102 des internen Standardmaterials, erhalten, wie in 1 gezeigt.
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In diesem Fall wurden bisher die dem Peak 113 des Chromatogramms des internen Standardmaterials entsprechenden Messwerte und Retentionszeit der Peakspitze usw. ermittelt, dann aus dem Chromatogramm 101 des Zielanalyten der Peak(-gruppe) im vorgegebenen Bereich erkannt und seine/ihre Messwerte und Retentionszeit(-kombination) der Peakspitze usw. ermittelt. Aus dem ermittelten Peak(-gruppe) wurde der Peak 123, der der Retentionszeit des Peaks des internen Standardmaterials am nächsten steht, als Zielanalyt ausgewählt. Wenn bei der Erkennung des Peaks ein Kriterium der Signalintensität vorgesehen ist, ist wegen des Kriteriums die Erkennung des Peaks 123 gegebenenfalls unmöglich. Wird das Kriterium daher erniedrigt, wäre es schwierig, zuverlässige Ergebnisse zu gewinnen, da ohne ausreichende Signalintensitäten die komplizierte Verarbeitung zur Peakerkennung, wie z. B. Gradientenerkennung der Veränderung der Signalintensität, Anpassung an die Gaussian-Funktion usw., wiederholt werden muss.
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Wie oben erwähnt, wird das interne Standardmaterial derart ausgewählt, dass dessen chemische Verhalten möglichst gleich wie diejenige des Zielanalyten sind, so dass die Retentionszeiten dieser zwei Chromatogramme im Wesentlichen gleich sind. D. h. es ist anzunehmen, dass die Retentionszeit des Peakstartpunktes und Peakendpunktes auf dem Chromatogramm 101 des Zielanalyten und die Retentionszeit des Peakstartpunktes und Peakendpunktes des internen Standardmaterials ähnlich sind. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird auf diesen Aspekt Aufmerksamkeit gerichtet. Beim Verfahren gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel handelt es sich daher darum, dass die Retentionszeit des Peakstartpunktes 111 und Peakendpunktes 112 des internen Standardmaterials als Retentionszeit des Peakstartpunktes 121 und Peakendpunktes 122 des Zielanalyten betrachtet und damit die Peakfläche und -höhe berechnet wird.
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Es ist wünschenswert, dass die Retentionszeit des internen Standardmaterials identisch mit derjenigen des Zielanalyten ist. Die Abweichung der Retentionszeit des Zielanalyten von derjenigen des internen Standardmaterials hat jedoch kein Problem, soweit ihre Einwirkung auf die Berechnung der Peakfläche und Peakhöhe des Zielanalyten vernachlässigbar ist.
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8 zeigt einen Funktionsplan zur Darstellung eines Beispiels der am Analyseteil 206 des Flüssigkeitschromatograph-Massenspektrometers gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel vorgesehenen Struktur für die Peakerkennung. Die Peakbeurteilung gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wird anhand der 8 erläutert.
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Das durch SIM bzw. SRM erhaltene Chromatogramm des internen Standardmaterials wird an einem Peakerkennungsteil 801 einer Peakbeurteilung unterworfen, wobei ein Peakstartpunkt 806 sowie ein Peakendpunkt 809 und interne Standardpeakteildaten 808 ausgegeben werden. An einem Peakbereich-Erkennungsteil 802 werden eine Peakstartzeit 813 und Peakendzeit 814 aus dem Peakstartpunkt und Peakendpunkt ausgezogen. An einem Peakbereich-Anwendungsteil 803 werden aus dem Chromatogramm des Zielanalyten unter Verwendung der Peakstartzeit und Peakendzeit Analytenpeakteildaten 810 ausgegeben. An einem Peakberechnungsteil 804 werden aus den internen Standardpeakteildaten 808 und Analytenpeakteildaten 810 interne Standardmesswerte (Fläche, Höhe) und Analytenmesswerte (Fläche, Höhe) jeweils ermittelt. Gemäß Ausführungsbeispiel 1 wird am Peakbereich-Erkennungsteil 802 lediglich die Peakstartzeit 813 aus dem Peakstartpunkt 806 und die Peakendzeit 814 aus dem Peakendpunkt 809 ausgezogen. Weitere Funktionen des Peakbereich-Erkennungsteils 802 werden später in Ausführungsbeispiel 2 erläutert.
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9 zeigt ein Ablaufdiagramm zur Darstellung des Ablaufs bei der Verarbeitung für die Peakerkennung. Nach der Datensammlung (S11) erfolgt die Peakerkennung des Chromatogramms des internen Standardmaterials am Peakerkennungsteil 801 (S12). Ferner wird die Peakbereich-Erkennung am Peakbereich-Erkennungsteil 802 ausgeführt (S13). Aufgrund der am Peakbereich-Erkennungsteil 802 ermittelten Peakstartzeit 813 und Peakendzeit 814 erfolgt die Peakbereich-Anwendung auf das Chromatogramm des Zielanalyten am Peakbereich-Anwendungsteil 803 (S14). Die Peakberechnung wird am Peakberechnungsteil 804 ausgeführt (S15). Die hier erhaltenen Werte der Peakfläche bzw. Peakhöhe des Zielanalyten können für die Anfertigung der Kalibrierkurve und die Berechnung der Konzentration benutzt werden, indem das Verhältnis dieser Werte zur Peakfläche bzw. Peakhöhe des internen Standardmaterials ermittelt wird.
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Die Durchführung der oben genannten Schritte ermöglicht die gesicherte Berechnung der Messwerte ohne Einflüsse der An- oder Abwesenheit des aus dem Zielanalyten stammenden Signals bzw. dessen Signalintensität. Jeder Probe enthält das interne Standardmaterial in einer festen Menge, auf dessen SIM- oder SRM-Chromatogramm der Peak sicher erscheint. Als das interne Standardmaterial wird z. B. eine mit stabilen Isotopen markierte Verbindung ausgewählt, deren Retentionszeit derjenigen des Zielanalyten ähnlich ist. Zudem werden die Fläche und Höhe aus dem Chromatogramm des Zielanalyten unter Verwendung der Retentionszeit des Peakstartpunktes und Peakendpunktes des internen Standardmaterials berechnet, wodurch die Messwerte auch bei der schwierigen Peakerkennung des Zielanalyten berechnet werden können.
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Auch wenn das Problem der Schwankung der Retentionszeit, wie oben im Absatz der Aufgabenstellung dargestellt, aufträte, lässt sich annehmen, dass der Zielanalyt und das interne Standardmaterial dieselbe Verhalten zeigen und schwanken. Durch das Verfahren gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel können deshalb die Messwerte richtig berechnet werden, auch wenn die Situation der nicht erkannten Peaks des Zielanalyten, wie oben erwähnt, und die Schwankung der Retentionszeit aufkommen können.
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Bisher war die Peakerkennung gegebenenfalls schwierig, da die Menge des Zielanalyten geringfügig ist, bzw. unmöglich, da die Einwirkung der relativ großen Menge an Verunreinigungen als Geräusch beurteilt wird. Die Beurteilung des Peaks des Zielanalyten aus der Retentionszeit des Peakstartpunktes und Peakendpunktes des internen Standardmaterials ermöglicht die Gewinnung der Messwerte der Zielkomponente auch unter der oben genannten Situation und erzielt die ausgezeichnete Robustheit.
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Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird Testosteron 13C als internes Standardmaterial für den Zielanalyten Testosteron verwendet. D. h. eine feste Menge an Testosteron 13C als internes Standardmaterial wurde der Probe zugesetzt und diese Probe mit dem Flüssigkeitschromatograph-Massenspektrometer gemessen, wodurch das Chromatogramm des Zielanalyten und das Chromatogramm des internen Standardmaterials erhalten wurden.
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Dann werden Beispiele der Analysebedingungen für Testosteron und Testosteron 13C gezeigt. Am Flüssigkeitschromatograph wird eine Wasser/Acetonitril-Lösung in einer Durchflussmenge von 0.2 ml/min und eine C18-Säule (Korngröße 5 µm, Rohrdurchmesser 2.0 mm x 50 mm) als Säule verwendet. Unter diesen Bedingungen kann die Retentionszeit von z. B. 64 Sekunden gezeigt werden. Die getrennte Probe wird z. B. durch eine ESI-Ionenquelle ionisiert und durch SRM mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer gemessen.
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5 zeigt Diagramme zur Darstellung eines Beispiels der Messergebnisdaten von SRM bei unbekannten Proben von Testosteron und Testosteron 13C. Diese Figur zeigt ein Beispiel, in dem die Retentionszeit des Peakstartpunktes und Peakendpunktes von Testosteron 13C auf den Peakstartpunkt und Peakendpunkt von Testosteron angewandt wird. Das Chromatogramm 501 von Testosteron resultiert aus der Komponententrennung und SRM-Messung unter den oben genannten Analysebedingungen, wobei das an Q1 und Q3 einzustellende Masse-zu-Ladung-Verhältnis jeweils 289 und 97 beträgt. Das Chromatogramm 502 von Testosteron 13C resultiert ebenfalls aus der SRM-Messung von Testosteron 13C, wobei das an Q1 und Q3 einzustellende Masse-zu-Ladung-Verhältnis jeweils 292 und 100 beträgt.
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In diesem Beispiel der Analyseergebnisse ist die Konzentration von Testosteron als Zielanalyt klein und der Peak 505 von Testosteron auf dem Chromatogramm 501 nicht klar, so dass eine genaue Peakerkennung schwierig ist. Anderseits ist am Peak 506 von Testosteron 13C, die in einer ausreichenden Menge als internes Standardmaterial zugesetzt wurde, das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) gut, und ein einfach identifizierbarer Peak wird erhalten.
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Gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel erfolgt zuerst die Peakerkennung des Peaks 506 von Testosteron 13C. Dadurch werden der Peakstartpunkt 511 und Peakendpunkt 512 erkannt. Zwischen den zwei Punkten wird eine Grundlinie 504 für Testosteron 13C gezogen und die Fläche und Höhe des Peaks 506 von Testosteron 13C berechnet. Anschließend wird die Retentionszeit des Peakstartpunktes 511 und Peakendpunktes 512, die für den Peak 506 von Testosteron 13C erkannt wurden, auf das Chromatogramm 501 von Testosteron angewandt, um diese Punkte als Peakstartpunkt und Peakendpunkt des Peaks 505 von Testosteron festzusetzen. Die Signalintensitäten an den einzelnen Punkten stellen in der Reihe der Signalintensitäten am Chromatogramm 501 von Testosteron die Werte dar, die den Retentionszeiten des Peakstartpunktes 511 und Peakendpunktes 512 entsprechen. Zwischen den zwei Punkten wird eine Grundlinie 503 für Testosteron gezogen und damit die Fläche und Höhe des Peaks 505 von Testosteron berechnet. Schließlich wird das Flächenverhältnis und Höhenverhältnis zwischen von Testosteron und Testosteron 13C berechnet und die Konzentration aus der Kalibrierkurve berechnet.
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Bei SRM überschneidet sich das Chromatogramm 501 von Testosteron gegebenenfalls nicht mit dem Chromatogramm 502 von Testosteron 13C in der Retentionszeiten an den einzelnen Datenpunkten, da die Erkennung der mehreren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen entsprechenden lonenmengen im Allgemeinen durch das Time-Division-System erfolgt. In diesem Fall können die einzelnen Datenpunkten am Chromatogramm 501 von Testosteron, die den einzelnen, am Peak 506 von Testosteron 13C erkannten Retentionszeiten des Peakstartpunktes 511 und Peakendpunktes 512 am nächsten stehen, als Peakstartpunkt und Peakendpunkt des Peaks 505 für Testosteron verwendet werden.
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Durch die Verwendung des oben erwähnten Verfahrens ist möglich, ohne Peakerkennung des Peaks 505 für Testosteron bei der schwierigen Identifizierung die Grundlinie zu ziehen und damit die Fläche und Höhe zu berechnen. D. h. die Fläche und Höhe des Zielanalyten kann sicherer berechnet werden, auch wenn die Erkennung des Peaks wegen großer Geräusche schwierig ist, und daneben auch wenn das Problem der Schwankung der Retentionszeit auftritt.
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Als weiterer Effekt ist es anzuführen, dass die Belastung bei der Datenanalyse verringert wird, da die Peakerkennung des Zielanalyten unnötig ist. Insbesondere wird das interne Standardmaterial im Allgemeinen in einem Konzentrationsbereich, der mit dem ausreichenden S/N-Verhältnis durch einen Detektor erkennbar ist, gemessen, so dass sein Peakstartpunkt und Peakendpunkt mittels eines relativ einfachen Algorithmus genau berechnet werden können. Wenn die Retentionszeiten dieses Peakstartpunktes und Peakendpunktes auf das Chromatogramm des Zielanalyten nur angewandt werden, kann der Peak des Zielanalyten, dessen Konzentrationsbereich unbekannt ist und dessen Retentionszeit schwankt, sicher erkannt werden, was zur beträchtlichen Verringerung der Belastung bei der Datenanalyse führt.
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6 zeigt ein Diagramm zur Darstellung eines Beispiels der graphischen Benutzerschnittstelle am Analyseteil 206 für die Anweisung des Peakerkennungsverfahrens gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel. Der Zielanalyt und das interne Standardmaterial als Peakerkennungsgegenstände wurden als zu erkennende Zielkomponenten verwendet.
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In 6 wird in der Spalte „ID“ die Nummer der zu erkennenden Zielkomponente ab 1 geordnet, wobei die ID-Nummer dem Messkanal von SRM des Massenspektrometers entspricht. Diese kann den Einstellungsumständen der zu erkennenden Zielkomponente entsprechend automatisch eingegeben werden. Bei „Name“ handelt es sich um einen Namen der zu erkennenden Zielkomponente. In diese Spalte kann der Benutzer beliebige Namen eingeben, aber darf nicht denselben Namen zweimal festsetzen. In der Spalte „Erwartete RZ“ wird die Retentionszeit der Peakspitze der zu erkennenden Zielkomponente festgesetzt. In der Spalte „RZ-Bereich“ wird der Bereich festgesetzt, der als Peak der zu erkennenden Zielkomponente beurteilt wird. Innerhalb des Bereichs der in dieser Zeile festgesetzten Retentionszeiten wird ein Peak mit einer Peakspitze, die der „Erwartete RZ“ am nächsten steht, als Peak der zu erkennenden Zielkomponente beurteilt. Im vorliegenden Beispiel wird der Peak von Testosteron 13C mit ID = 2 im Bereich zwischen (Erwartete RZ - RZ-Bereich) und (Erwartete RZ + RZ-Bereich), d. h. im Bereich der Retentionszeit von 64 ± 10 Sekunden, beurteilt.
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In der Spalte „IS ID“ wird die ID-Nummer des internen Standardmaterials festgesetzt. Für das interne Standardmaterial als solches wird in dieser Spalte ein besonderer Wert 0 festgesetzt. Für den Zielanalyten wird die ID-Nummer des internen Standardmaterials festgesetzt, zu dem das Verhältnis der Fläche und Höhe des Zielanalyten zu ermitteln ist. Im Beispiel gemäß 6 muss als das interne Standardmaterial für das Testosteron mit ID = 1 das Testosteron 13C mit ID = 2 festgesetzt werden, so dass in der Spalte „IS ID“ für das Testosteron 2 festgesetzt wird. Für das Testosteron 13C wird der besondere Wert 0 festgesetzt, da es das interne Standardmaterial als solches ist.
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In der Spalte „Peakerkennungstyp“ wird das Peakerkennungsverfahren gewählt. In dieser Zeile wird aus mehreren Peakerkennungsverfahren ein Zielverfahren alternativ ausgewählt und eingegeben, und zwar aus Auswahlmöglichkeiten, wie z. B. Gradientenerkennung (Alternativname: Delta), Peakerkennung durch Anpassung (Alternativname: Anpassung), Verwendung der Peakstartzeit und -endzeit des internen Standardmaterials (Alternativname: Mit IS) usw. ausgewählt. Bei der Auswahl der Verwendung der Peakstartzeit und -endzeit des internen Standardmaterials (Alternativname: Mit IS) ist die Eingabe in die Spalte „Erwartete RZ“ und „RZ-Bereich“ unnötig, so dass diese Spalten der betreffenden Komponente leer sein können. Es ist wünschenswert, z. B. durch Anzeige von Fehlern oder dgl. die Übereinstimmung zu prüfen, wenn 0 in „IS ID“ festgesetzt, aber „Mit IS“ in der Spalte „Peakerkennnungstyp“ angegeben ist.
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Wie oben erwähnt, ist es möglich, bei der Peakerkennung aus den Chromatogrammen, die durch SRM des Flüssigkeitschromatograph-Massenspektrometers erhaltenen wurden, das Peakerkennungsverfahren am Zielanalyten und internen Standardmaterial festzusetzen.
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(AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 2)
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Bei SRM mit dem Massenspektrometer kann man in Allgemeinen mehrere Kanäle vorsehen. Deshalb wurde bei der Messung von Testosteron gemäß Ausführungsbeispiel 1 Testosteron 13C als internes Standardmaterial simultan gemessen. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird ferner ein Beispiel angeführt, in dem als internes Standardmaterial neben dem im Ausführungsbeispiel 1 gezeigten Testosteron 13C das Testosteron d3, in dem die im Testosteron enthaltenen Wasserstoffatome zum Teil durch Deuterium ersetzt sind, der Probe zugesetzt wird und diese simultan gemessen werden. D. h. es handelt sich um ein Beispiel, in dem der Probe mehrere verschiedene interne Standardmaterialien zugesetzt und mehrere Chromatogramme der internen Standardmaterialien gewonnen werden.
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7 zeigt Diagramme zur Darstellung eines Beispiels, in dem Testosteron, Testosteron d3 und Testosteron 13C simultan gemessen wurden. Hier ist ein Beispiel gezeigt, in dem die Retentionszeit des Peakstartpunktes und die Peakendpunktes von Testosteron d3 auf den Peakstartpunkt und Peakendpunkt von Testosteron und Testosteron 13C angewandt wird. Das Chromatogramm 701 von Testosteron, das Chromatogramm 702 von Testosteron d3 und das Chromatogramm 703 von Testosteron 13C wurden mittels von SRM durch den Massenspektrometer simultan und einzeln gemessen.
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Für das Chromatogramm 701 von Testosteron und das Chromatogramm 703 von Testosteron 13C ist das als SRM-Bedingung festzusetzende Masse-zu-Ladung-Verhältnis gleich wie im Ausführungsbeispiel 1. Das für das Chromatogramm 702 von Testosteron d3 festzusetzende Masse-zu-Ladung-Verhältnis für Q1 und Q3 beträgt jeweils 292 und 97. Unter diesen Analysebedingungen werden Testosteron, Testosteron d3 und Testosteron 13C simultan gemessen und dadurch der Peak 711 von Testosteron, der Peak 712 von Testosteron d3 und der Peak 713 von Testosteron 13C erkannt.
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Bei Testosteron d3 und Testosteron 13C als interne Standardmaterialien wird der Peak relativ deutlich erkannt, wobei das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) des Peaks 712 von Testosteron d3 besser als dasjenige des Peaks 713 von Testosteron 13C ist. In diesem Fall können mittels des Peaks 712 von Testosteron d3, das ein internes Standardmaterial mit dem besten S/N-Verhältnis ist, der Peakstartpunkt 721 und Peakendpunkt 722 erkannt und damit mittels ihrer Retentionszeiten die quantitativen Werte von Testosteron und Testosteron 13C berechnet werden.
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Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wurden zwei interne Standardmaterialien verwendet, aber es ist auch möglich, drei oder mehr interne Standardmaterialien zu verwenden. Im Fall der Verwendung von zwei oder mehr internen Standardmaterialien werden mehrere Chromatogramme der internen Standardmaterialien erhalten. Aus den mehreren Chromatogrammen wird jeweils der Peak erkannt und die Peakstartzeit und Peakendzeit der einzelnen Peaks ermittelt, wodurch mehrere Peakstartzeiten und mehrere Peakendzeiten erhalten werden. Aus den mehreren Peakstartzeiten und mehreren Peakendzeiten wird eine Peakstartzeit-Peakendzeit-Kombination ausgewählt oder berechnet, und diese Peakstartzeit-Peakendzeit-Kombination auf die Peakstartzeit und Peakendzeit des Chromatogramms des Zielanalyten angewandt. Zur Ermittlung der auf das Chromatogramm des Zielanalyten anzuwendenden Peakstartzeit-Peakendzeit-Kombination usw. sind z. B. folgende Verfahren anzuführen.
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(1) z. B. ein Verfahren, in dem das beste S/N-Verhältnis ausgewählt wird. Am Chromatogramm des internen Standardmaterials wird die Zone in der Nähe des Peaks des internen Standardmaterials als Bereich zur Geräuschbeurteilung bestimmt, wobei die Halbwerte der Differenz zwischen dem Maximum und dem Minimum der Signalintensität in der Zone als N und die Höhe des Peaks des internen Standardmaterials als S bezeichnet wird. Aus den Chromatogrammen mehrerer internen Standardmaterialien wird jeweils das S/N-Verhältnis ermittelt, damit die Peakstartzeit-Peakendzeit-Kombination des Peaks des internen Standardmaterials mit dem größten S/N-Verhältnis auf die Peakstartzeit und Peakendzeit des Chromatogramms des Zielanalyten angewandt wird. Dies ermöglicht eine mehr stabilisierte Peakerkennung, so dass Abweichungen bzw. Schwankungen bei der Berechnung der quantitativen Werte verhindert werden können.
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(2) z. B. ein Verfahren, in dem das S/N-Verhältnis, das nicht weniger als das Kriterium ist, ausgewählt wird, wobei als Peakstartzeit und Peakendzeit der Durchschnitt der Peakstartzeiten und Peakendzeiten der einzelnen ausgewählten Peaks verwendet wird.
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Die Chromatogramme der internen Standardmaterialien, deren S/N-Verhältnis nicht weniger als das Kriterium ist, werden ausgewählt und der Durchschnitt der Peakstartzeiten und der Durchschnitt der Peakendzeiten an diesen Chromatogrammen berechnet werden. Diese Werte werden als Peakstartzeit-Peakendzeit-Kombination bestimmt, die auf das Chromatogramm des Zielanalyten anzuwenden ist. Dies kann Einflüsse der Verunreinigungen und Geräusche ausgleichen und trägt damit zur stabilisierten Peakerkennung bei.
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(3) z. B. ein Verfahren, in dem die Peakerkennung an jedem internen Standardmaterial erfolgt, wobei der Peakstartpunkt mit der frühesten Retentionszeit und der Peakendpunkt mit der spätesten Retentionszeit ausgewählt werden.
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Aus mehreren Peakstartzeiten und mehreren Peakendzeiten, ermittelt aus den Chromatogrammen mehrerer internen Standardmaterialien, werden die früheste Peakstartzeit und die späteste Peakendzeit als die Peakstartzeit-Peakendzeit-Kombination ausgewählt, die auf das Chromatogramm des Zielanalyten anzuwenden ist. Durch Auswahl der frühesten Peakstartzeit und der spätesten Peakendzeit wird ein breiterer Bereich als Peak betrachtet, so dass die stabilisierte Peakerkennung gegen die Schwankung des Peakstartpunktes und Peakendpunktes des Zielanalyten ermöglicht wird.
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(4) z. B. ein Verfahren, in dem aus Daten der normalisierten Intensitäten des Chromatogramm des Zielanalyten und des Chromatogramms eines internen Standardmaterials die Differenz zwischen den einzelnen, derselben Retentionszeit entsprechenden Signalintensitäten ermittelt und ihre Verteilung als Rauschwert festgesetzt wird, wobei das interne Standard material mit dem größten Verhältnis zwischen der Peakhöhe und dem Rauschwert ausgewählt wird, um seine Peakstartzeit und Peakendzeit zu wählen.
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Das Maximum und Minimum der einzelnen Signalintensitäten des Chromatogramms des Zielanalyten werden zu 1 und 0 normalisiert, und daneben die einzelnen Signalintensitäten des Chromatogramms des internen Standardmaterials in gleicher Weise zu 1 und 0 normalisiert. Die Differenz zwischen den einzelnen, derselben Retentionszeit entsprechenden Signalintensitäten wird ermittelt und ihre Verteilung als Rauschwert festgesetzt. Die Peakstartzeit und Peakendzeit des internen Standardmaterials mit dem größten Verhältnis zwischen der Peakhöhe und dem Rauschwert werden als Peakstartzeit-Peakendzeit-Kombination ausgewählt, die auf das Chromatogramm des Zielanalyten anzuwenden ist. Durch dieses Verfahren kann das S/N-Verhältnis ermittelt werden, auch wenn die Rauschwellenform nicht stabil erhalten werden kann.
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(5) z. B. ein Verfahren, in dem der quadratische Wert der Signalintensität an jedem Punkt mehrerer Chromatogramme ermittelt und die Peakerkennung des Chromatogramms, an dem die ermittelten Werte als Datenpunkte dienen, durchgeführt wird, wodurch die Peakstartzeit und Peakendzeit ermittelt werden.
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Die Durchführung der Peakerkennung des Chromatogramms, das durch Quadrieren der Signalintensitäten an den einzelnen Retentionszeiten des Chromatogramms des internen Standardmaterials gewonnen wurde, ermöglicht die Peakerkennung unter Geräuschvermeidung. Dieses Verfahren zur Auswahl der Peakstartzeit und Peakendzeit kann zusammen mit den oben genannten Verfahren verwendet werden.
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Wenn zwei oder mehr interne Standardmaterialien verwendet werden, wird das Peakerkennungsteil 801 im Blockdiagramm gemäß 8 mehrere Male angewandt. Daneben werden am Peakbereich-Erkennungsteil 802 anhand mehrerer Peakstartpunkte 806, mehrerer Peakendpunkte 809, und der einzelnen Chromatogramme der internen Standardmaterialien sowie des Chromatogramms des Zielanalyten die Peakstartzeit 813 und Peakendzeit 814 ermittelt.
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Durch die oben erwähnten Verfahren kann man den Peakstartpunkt und Peakendpunkt des Zielanalyten aus den Peakstartpunkten und Peakendpunkten der internen Standardmaterialien richtig erkennen.
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Die vorliegende Erfindung wird nicht auf die oben genannten Ausführungsbeispiele beschränkt, sondern schließt verschiedene Varianten ein. Die beschriebenen Ausführungsbeispiele dienen zur ausführlichen Erläuterung der Erfindung, um sie verständlich darzulegen. Deshalb wird die Erfindung nicht darauf beschränkt, dass alle der beschriebenen Strukturen vorgesehen sind. Zudem kann die Struktur eines Ausführungsbeispiels zum Teil durch die Struktur eines weiteren Ausführungsbeispiels ersetzt werden. Zudem kann die Struktur eines Ausführungsbeispiels der Struktur eines weiteren Ausführungsbeispiels zugesetzt werden. Ferner kann die Struktur der einzelnen Ausführungsbeispiele zum Teil mit einer weiteren Struktur addiert, gestrichen oder ersetzt werden.
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Bezugszeichenliste
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- 101
- Chromatogramm des Zielanalyten
- 102
- Chromatogramm des internen Standardmaterials
- 111
- Peakstartpunkt
- 112
- Peakendpunkt
- 121
- Peakstartpunkt
- 122
- Peakendpunkt
- 201
- Lösungsmittelförderungsteil
- 202
- Probeeinführungsteil
- 203
- Probeeinspritzungsteil
- 204
- Probetrennungsteil
- 205
- massenspektrometrisches Teil
- 206
- Analyseteil
- 511
- Peakstartpunkt
- 512
- Peakendpunkt
- 721
- Peakstartpunkt
- 722
- Peakendpunkt
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- JP 61145457 A [0004]
- JP 63151851 A [0004]