WO2018229811A1 - クロマトグラフィー質量分析方法及びクロマトグラフ質量分析装置 - Google Patents

クロマトグラフィー質量分析方法及びクロマトグラフ質量分析装置 Download PDF

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彰 前川
伊藤　伸也
博教 山下
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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    • G01N30/8665—Signal analysis for calibrating the measuring apparatus
    • G01N30/8668—Signal analysis for calibrating the measuring apparatus using retention times

Definitions

  • the present invention relates to a chromatography mass spectrometry method and a chromatographic mass spectrometer.
  • the quadrupole mass spectrometer can measure a sample by scanning or selected ion monitoring (SIM).
  • SIM selected ion monitoring
  • the scan is used for qualitative analysis of an unknown sample, and detects the amount of ions with respect to the mass-to-charge ratio as a signal within a predetermined mass-to-charge ratio (m / z) range.
  • the SIM selectively detects the amount of ions with respect to a mass-to-charge ratio specified in advance.
  • SRM selective reaction monitoring
  • a chromatogram showing changes over time in the amount of ions is obtained by SIM or SRM of a liquid chromatograph mass spectrometer, A peak corresponding to the internal standard is detected to obtain a measured value.
  • peak detection it is generally performed to determine the peak start point and end point and then calculate the peak area and height as measured values.
  • the analysis target component and the internal standard substance are determined based on the peak retention time. The retention time depends on the type and state of the column of the liquid chromatograph and the separation conditions.
  • a peak detection method there is a method of detecting the amount of change in data as a gradient.
  • a shoulder peak detection method as shown in Patent Document 1 and further as shown in Patent Document 2 are used. There is a method of detecting by fitting to an arbitrary function.
  • the peak is detected using the methods disclosed in Patent Documents 1 and 2, for example.
  • the analysis target components may be very small. In this case, a clear peak does not appear on the chromatogram, and it is necessary to detect the component to be analyzed by combining noise removal and advanced signal processing, and it is difficult to detect the peak.
  • the chromatography mass spectrometry method of the present invention includes, as one aspect, a step of adding an internal standard substance having a retention time similar to the analysis target component and having a different mass-to-charge ratio to the sample, and the sample by a chromatographic mass spectrometer.
  • the chromatographic mass spectrometer of the present invention is, as one aspect, a chromatographic mass spectrometer that simultaneously measures an analysis target component and an internal standard substance and obtains a chromatogram of the analysis target component and a chromatogram of the internal standard substance.
  • the peak detector detects the peak start point and peak end point from the chromatogram of the internal standard substance, and the peak range detection extracts the peak start time and peak end time from the peak start point and peak end point detected by the peak detector.
  • a peak range application unit that applies the peak start time and peak end time extracted by the peak range detection unit to the peak start point and peak end point of the chromatogram of the analysis target component.
  • the measured value can be calculated without being affected by the quality of the chromatogram of the analysis target component.
  • the conceptual diagram which shows the example which applies the retention time of the component peak start point and end point of an internal standard substance chromatogram to the peak start point and end point of an analysis object component chromatogram.
  • the schematic diagram which shows the structural example of a liquid chromatograph mass spectrometer.
  • the conceptual diagram which shows the example of the sample produced by the internal standard method, and the example of the signal strength at the time of measuring the said sample with a mass spectrometer.
  • liquid chromatograph mass spectrometer is given as an example of a chromatograph mass spectrometer, but it is sufficient that the component to be analyzed and the internal standard substance are measured simultaneously. Can also be applied.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a configuration example of a liquid chromatograph mass spectrometer.
  • the solvent feeding unit 201 sends a solvent such as water or acetonitrile.
  • a solvent such as water or acetonitrile.
  • isocratic liquid feeding in which two or more solvents are installed and the ratio is fixed, and gradient liquid feeding in which the composition of the solvent is changed by a time program are possible.
  • the solvent feeding unit 201 always feeds the solvent even during the time other than during analysis, so that the sample separation unit 204 is balanced and stabilized.
  • the sample introduction unit 202 installs a sample to be analyzed by an analyst, and sequentially sucks the sample with a sample introduction mechanism called an autosampler. In addition, it is necessary to clean parts such as the needle and the sample introduction channel every time the sample is sucked. For this reason, although not shown in the figure, a cleaning mechanism is generally mounted separately.
  • the sample injection part 203 is a part for injecting the sample sucked by the sample introduction part into the flow path from the solvent feeding part.
  • a six-way valve combined with a pipe called a sample loop is used.
  • the sample loop is usually connected to the sample introduction part side.
  • the sample sucked by the sample introduction unit is introduced into the sample loop, and after the introduction is completed, the sample loop filled with the sample is switched to the flow path to the sample separation unit, so that the sample from the solvent feeding unit 201 The sample is injected into the flow path to the separation unit 204.
  • the sample separation unit 204 is provided with a column for separating the sample for each component.
  • a column is a metal cylinder filled with a filler such as silica gel or polymer.
  • a filler such as silica gel or polymer.
  • the mass analysis unit 205 is a part that ionizes components separated by the sample separation unit 204 and detects them by mass-to-charge ratio.
  • ionization methods include electrospray ionization (ESI) and atmospheric pressure chemical ionization (APCI).
  • ESI electrospray ionization
  • APCI atmospheric pressure chemical ionization
  • a quadrupole type, an ion trap type, a time-of-flight type, or the like is generally used for the mass analysis unit.
  • the quadrupole type there is a triple quadrupole type in which three stages are arranged in addition to one in which the quadrupoles are arranged in one stage. In this, the ion selected in the first stage is cleaved in the second stage, and a product ion having a specific mass-to-charge ratio can be selected and measured in the third stage. .
  • SRM Such a measurement method is called SRM.
  • the ions selected by the mass-to-charge ratio and introduced into the detector are detected as a signal corresponding to the amount. Further, the signal of the amount of ions detected by the mass analysis unit 205 is sent to the analysis unit 206, where various data processing such as smoothing processing, peak detection processing, area and height calculation processing is performed as a chromatogram of SIM or SRM. .
  • the peak area and peak height calculated here are measured values.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram illustrating an example of a sample manufactured by an internal standard method and an example of signal intensity when the sample is measured by a mass spectrometer.
  • the standard samples 311 to 313 and the unknown sample 314 obtained by adding a certain amount of the internal standard substance 302 to the analysis target component 301 having several concentrations corresponding to the series of measured concentrations are measured.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of a calibration curve created by the internal standard method.
  • the measurement values of the analysis target components of the standard samples 311 to 313 are a 1 to a 3 and the measurement values of the internal standard substances are i 1 to i 3
  • the known concentrations c 1 to c of the analysis target components contained in the respective standard samples are drawn for 3 .
  • the unknown sample 314 is measured, and the concentration c u of the analysis target component contained in the unknown sample can be calculated from the measurement value a u of the analysis target component and the measurement value i u of the internal standard substance. That is, the concentration c u can be obtained by applying the ratio value (a u / i u ) to the calibration curve 401.
  • the advantage of the internal standard method that performs the calculation using the ratio between the analysis target component and the measured value of the internal standard substance is that, for example, error factors such as an error in the injection amount of the sample and an error due to the volatilization of the solvent can be obtained by the ratio calculation. They are offset and do not affect the results. For this purpose, it is necessary to select an internal standard substance so that the chemical behavior of the component to be analyzed and the internal standard substance is as equal as possible.
  • an element that is labeled with a stable isotope with respect to a component to be analyzed is generally used as an internal standard substance and separated and detected by a mass spectrometer due to the difference in mass-to-charge ratio.
  • a stable isotope-labeled compound in which a part of atoms constituting the analysis target component is replaced with nitrogen stable isotope 15N, carbon stable isotope 13C, oxygen stable isotope 18O, hydrogen stable isotope 2H, etc. Use as a standard substance.
  • Testosterone for example, those labeled with 13C (hereinafter referred to as Testosterone 13C) can be exemplified.
  • the concentration can be set to an arbitrary amount according to the sensitivity and accuracy of the mass spectrometer, for example, 500 fmol.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing an embodiment in which the retention times of the component peak start point and end point of the internal standard substance chromatogram are applied to the peak start point and end point of the analysis target component chromatogram.
  • the measured value corresponding to the peak 113 of the chromatogram of the internal standard substance and the retention time such as the peak top are obtained, and the peak (group) in a predetermined region is detected from the chromatogram 101 of the analysis target component. Then, the measurement value of them (their) and the retention time (a pair) of the peak top and the like are obtained. From the obtained peak (group), the peak 123 closest to the retention time of the peak of the internal standard substance is selected as the analysis target component.
  • a signal intensity threshold is provided to detect a peak, the peak 123 cannot be detected depending on the threshold. Therefore, if the threshold value is lowered, even if there is not enough signal strength, the method of detecting the amount of change in signal strength and the complicated processing for peak detection such as fitting to the Gaussian function are repeated, and reliable results are obtained. Hard to get.
  • the retention times in these two chromatograms are almost equal. That is, the retention times of the peak start point and peak end point in the chromatogram 101 of the analysis target component are considered to be similar to the retention times of the peak start point and peak end point of the internal standard substance.
  • the present embodiment focuses on this point. Therefore, the retention time of the peak start point 111 and the peak end point 112 of the internal standard substance is the retention time of the peak start point 121 and the peak end point 122 of the analysis target component, and calculating the peak area and height, This is the method of this example.
  • the retention time of the internal standard substance is preferably the same as that of the analysis target component. However, if the influence on the calculation of the peak area and peak height of the analysis target component is negligible, There is no problem even if the retention time of the standard substance is shifted.
  • FIG. 8 is a functional block diagram showing an example of a configuration related to peak detection provided in the analysis unit 206 of the liquid chromatograph mass spectrometer of the present embodiment. The peak determination of the present embodiment will be described with reference to FIG.
  • the chromatogram of the internal standard substance obtained by SIM or SRM is subjected to peak determination by the peak detection unit 801, and the peak start point 806, peak end point 809, and internal standard peak portion data 808 are output.
  • the peak range detection unit 802 extracts a peak start time 813 and a peak end time 814 from the peak start point and the peak end point.
  • the peak range application unit 803 uses the peak start time and the peak end time to output component peak portion data 810 from the analysis target component chromatogram.
  • the peak calculation unit 804 obtains an internal standard measurement value (area, height) and a component measurement value (area, height) from the internal standard peak portion data 808 and component peak portion data 810, respectively.
  • the peak range detection unit 802 only extracts the peak start time 813 from the peak start point 806 and the peak end time 814 from the peak end point 809. Further functions of the peak range detection unit 802 will be described in the second embodiment.
  • FIG. 9 is a flowchart showing the flow of processing for peak detection.
  • the peak detector 801 detects the peak of the chromatogram of the internal standard substance (S12). Further, peak range detection is performed by the peak range detection unit 802 (S13). Based on the peak start time 813 and peak end time 814 obtained by the peak range detection unit 802, the peak range application to the chromatogram of the analysis target component is performed by the peak range application unit 803 (S14), and the peak calculation is performed by the peak calculation unit 804.
  • Implement (S15) The values of the peak area and peak height of the analysis target component obtained here can be used for preparing a calibration curve and calculating the concentration by obtaining a ratio with the peak area and peak height of the internal standard substance.
  • the internal standard substance is contained in a certain amount in all samples, and a peak always appears in the SIM or SRM chromatogram.
  • the internal standard substance for example, a stable isotope-labeled compound having a retention time similar to that of the analysis target component is selected.
  • the retention time of the peak start point and peak end point of the internal standard substance is used to calculate the area and height from the chromatogram of the analysis target component, measurement is possible even when it is difficult to detect the peak of the analysis target component. The value can be calculated.
  • the measured value can be calculated correctly even in the situation where the peak of the analysis target component is not detected and the retention time may vary.
  • the peak to be detected is difficult due to a small amount of components to be analyzed, and where peak detection is not possible due to the influence of a relatively large amount of contaminant components.
  • the measured value of the target component can be obtained even in such a situation, and the robustness is excellent.
  • Testosterone 13C was used as an internal standard for Testosterone, which is a component to be analyzed. Specifically, a certain amount of Testosterone 13C was added to the sample as an internal standard substance, and this sample was measured with a liquid chromatograph mass spectrometer to obtain a chromatogram of the component to be analyzed and a chromatogram of the internal standard substance.
  • test conditions for Testosterone and Testosterone 13C is shown below.
  • the solvent is a water / acetonitrile solution with a flow rate of 0.2 mL / min
  • the column is a C18 column (particle diameter 5 ⁇ m, tube diameter 2.0 mm ⁇ 50 mm).
  • An example of the holding time under this condition is 64 seconds.
  • the separated sample is ionized by, for example, an ESI ion source, and measured by SRM with a triple quadrupole mass spectrometer.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of SRM measurement result data for unknown samples of Testosterone and Testosterone 13C. This figure shows an example in which the retention time of the peak start point and end point of Testosterone 13C is applied to the peak start point and end point of Testosterone.
  • the Testosterone chromatogram 501 is the result of component separation and SRM measurement under the above analysis conditions. The mass-to-charge ratios to be set for Q1 and Q3 at this time are 289 and 97, respectively.
  • Chromatogram 502 of Testosterone 13C is the result of measuring Testosterone 13C by SRM, and the mass-to-charge ratios to be set for Q1 and Q3 at this time are 292 and 100, respectively.
  • the concentration of testosterone, which is a component to be analyzed is low, and the peak 505 of testosterone in the chromatogram 501 is not clear, so that accurate peak detection is difficult.
  • the peak 506 of Testosterone 13C added in a sufficient amount as an internal standard substance has a good signal-to-noise ratio (S / N), and an easily identifiable peak is obtained.
  • peak detection is performed on the peak 506 of Testosterone 13C. Thereby, a peak start point 511 and a peak end point 512 are detected.
  • the base line 504 of Testosterone 13C connecting these two points is drawn, and the area and height of the peak 506 of Testosterone 13C are calculated.
  • the retention times of the peak start point 511 and peak end point 512 detected for the peak 506 of Testosterone 13C are applied to the chromatogram 501 of Testosterone, and the peak start point and peak end point of Testosterone peak 505 To do.
  • the signal intensity at each point is a value corresponding to the retention time of the peak start point 511 and the peak end point 512 in the signal intensity sequence of the testosterone chromatogram 501.
  • the testosterone base line 503 connecting these two points is drawn, and the area and height of the testosterone peak 505 are calculated. Finally, calculate the area ratio and height ratio of Testosterone and Testosterone 13C, and calculate the concentration from the calibration curve.
  • the testosterone chromatogram 501 and the testosterone 13C chromatogram 502 do not match the retention time of each data point. There is. In such a case, each data point of the testosterone chromatogram 501 present closest to each retention time of the peak start point 511 and the peak end point 512 detected with respect to the peak 506 of Testosterone 13C is used as the peak of Testosterone. A peak start point and a peak end point of 505 may be used.
  • the area and height of the analysis target component can be calculated more reliably even when there is a lot of noise and it is difficult to identify the peak and when there is a problem of fluctuations in retention time.
  • the peak detection of the analysis target component becomes unnecessary, the load of data analysis processing is reduced.
  • internal standard substances are generally measured in a concentration range that can be detected by a detector with sufficient S / N, so peak start and end points can be calculated accurately with a relatively simple algorithm. It is. Since the retention time of this peak start point and peak end point only has to be applied to the chromatogram of the analysis target component, it is possible to reliably detect the peak of the analysis target component whose concentration range is unknown and whose retention time varies. This can greatly reduce the load of data analysis processing.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating an example of a graphical user interface in the analysis unit 206 for instructing the peak detection method in the present embodiment. It should be noted that the analysis target component and the internal standard substance to be subjected to peak detection were used as the detection target components.
  • ID designates the detection target component numbers in order from 1, and the ID number corresponds to the SRM measurement channel of the mass spectrometer. This may be automatically input according to the setting state of the detection target component.
  • Name is the name of the detection target component. This item can be freely input by the user, but two or more identical names cannot be set.
  • Exected RT specifies the retention time of the peak top of the detection target component.
  • IS ID specify the ID of the internal standard substance.
  • 0 is set as a special value in this column. If it is a component to be analyzed, the ID of the internal standard substance that should take the ratio of the component to the area and height is designated.
  • Peak Detect Type select the peak detection method. This column is an input location to select the target method from multiple peak detection methods. Examples of options include gradient detection method (option name Delta) and peak detection method by fitting (option name Fitting). Select from using peak start / end times of internal standard (With IS). In addition, when using the peak start / end time of the internal standard substance (With) IS) is selected, it is not necessary to enter the Expected RT and RT Range, so these items of the component may be left blank. Further, when Peak Detect Type is With IS even though IS ID is set to 0, it is desirable to perform a consistency check such as displaying an error.
  • Example 2 In general, an SRM using a mass spectrometer can set a plurality of channels. For this reason, in the measurement of Testosterone of Example 1, Testosterone 13C was simultaneously measured as an internal standard substance. In this example, in addition to Testosterone 13C shown in Example 1, Testosterone d3 in which some hydrogen atoms contained in Testosterone are replaced with deuterium is added to the sample as an internal standard substance, and these are measured simultaneously. An example of That is, in this example, a plurality of different internal standard substances are added to a sample, and a plurality of chromatograms are obtained as chromatograms of the internal standard substance.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example in which Testosterone, Testosterone d3, and Testosterone 13C are measured simultaneously.
  • an example is shown in which the retention times of the peak start point and end point of Testosterone d3 are applied to the peak start point and end point of Testosterone ⁇ TestCone 13C.
  • the testosterone chromatogram 701, the testosterone d3 chromatogram 702, and the testosterone 13C chromatogram 703 were respectively measured simultaneously and individually by SRM using a mass spectrometer.
  • the mass-to-charge ratio to be set as the SRM conditions is the same as in the first embodiment.
  • the mass to charge ratio to be set in the chromatogram 702 of Testosteroneosterd3 is 292 and 97 for Q1 and Q3.
  • Testosterone, Testosterone d3, and Testosterone 13C were measured simultaneously, and Testosterone peak 711, Testosterone d3 peak 712, and Testosterone 13C peak 713 were detected.
  • Testosterone d3 and Testosterone 13C which are internal standards
  • the peaks are relatively clearly detected, but the peak 712 of Testosterone d3 has a better signal-to-noise ratio (S / N) than the peak 713 of Testosterone 13C.
  • S / N signal-to-noise ratio
  • the peak start point 721 and the peak end point 722 are detected using the peak 712 of Testosterone d3 which is the internal standard substance with the best S / N, and Testosterone and Testosterone 13C are detected with their retention times.
  • the quantitative value of can be calculated.
  • two types of internal standard substances are used, but three or more types may be used.
  • a plurality of chromatograms are obtained as chromatograms of the internal standard substances.
  • a peak is detected from each of the plurality of chromatograms and a peak start time and a peak end time of each peak are obtained, a plurality of peak start times and a plurality of peak end times are obtained.
  • One set of peak start time and peak end time is selected or calculated from the plurality of peak start times and the plurality of peak end times, and the peak start time and peak end time group is selected as the peak start of the chromatogram of the analysis target component.
  • Applies to time and peak end time Examples of a method for obtaining a pair of peak start time and peak end time to be applied to the chromatogram of the analysis target component include the following methods.
  • a method of selecting one with the best S / N For example, a method of selecting one with the best S / N.
  • the section near the peak of the internal standard substance is the noise judgment area
  • the half value difference between the maximum value and the minimum value of the signal intensity in that section is N
  • the peak height of the internal standard substance is S.
  • the S / N is obtained from the chromatograms of a plurality of internal standard substances, and the combination of the peak start time and peak end time of the peak of the internal standard substance with the largest value is obtained in the chromatogram of the analysis target component. Applies as peak start time and peak end time. As a result, more stable peak detection is possible, and errors and variations can be suppressed in the calculation of quantitative values.
  • the chromatograms of internal standard substances having S / N equal to or higher than the threshold are selected, and the average value of peak start times and the average value of peak end times in those chromatograms are calculated. Let it be a set of peak start time and peak end time applied to the chromatogram of the analysis target component. Thereby, the influence of a miscellaneous component and noise can be averaged, and it contributes to the stable peak detection.
  • Peak start time that applies the earliest peak start time and the latest peak end time among multiple peak start times and multiple peak end times obtained from chromatograms of multiple internal standards to the chromatogram of the target component And the peak end time.
  • each signal intensity in the chromatogram of the analysis target component is normalized by 1 and 0, and each signal intensity in the chromatogram of the internal standard substance is also normalized by 1 and 0.
  • the difference between the signal intensities corresponding to the same holding time is obtained, and the variance is used as the noise value.
  • the peak start time and peak end time of the internal standard substance having the largest ratio between the peak height and the noise value of the internal standard substance are selected as a pair of peak start time and peak end time applied to the chromatogram of the analysis target component.
  • the peak detector 801 in the block diagram of FIG. 8 is applied multiple times. Further, the peak range detection unit 802 refers to a plurality of peak start points 806, a plurality of peak end points 809, and respective internal standard substance chromatograms and analysis target component chromatograms, so that a peak start time 813 and a peak end time 814 are obtained. Ask for.
  • the peak start point and peak end point of the analysis target component can be correctly detected from the peak start point and peak end point of the internal standard substance.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.
  • Peak start point 512 Peak end point 721 Peak start point 722 Peak end point

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Abstract

分析対象成分と類似する保持時間を有しかつ質量電荷比が異なる内部標準物質を試料に添加する工程と、試料をクロマトグラフ質量分析装置で測定し、分析対象成分のクロマトグラム１０１と内部標準物質のクロマトグラム１０２を得る工程と、内部標準物質のクロマトグラムからピーク１１３を検出し、当該ピークのピーク開始時間とピーク終了時間を求める工程と、求めたピーク開始時間とピーク終了時間を分析対象成分のクロマトグラムのピーク開始時間とピーク終了時間に適用する工程と、を有する。

Description

クロマトグラフィー質量分析方法及びクロマトグラフ質量分析装置
　本発明は、クロマトグラフィー質量分析方法及びクロマトグラフ質量分析装置に関する。
　近年、液体クロマトグラフ質量分析装置を用いた定量分析法が生体試料中の薬剤成分や代謝物、環境試料中の残留物等の分析に多く使用されている。液体クロマトグラフにはカラムでの分離時間が最大数十分の高速型、又は最大数分で分離を行う超高速型などが用いられる。さらに、分離した成分を検出する質量分析装置には、例えば四重極型質量分析装置、イオントラップ型質量分析装置、飛行時間型質量分析装置がある。それらは分析の目的に応じて使い分けられているが、定量を目的とする場合、多くは四重極型質量分析装置が使用される。
　四重極型質量分析装置は、スキャンや選択イオンモニタリング（ＳＩＭ：Selected Ion Monitoring）により試料を測定できる。スキャンは、未知試料の定性分析等に用いられ、所定の質量電荷比（ｍ／ｚ）の範囲において、質量電荷比に対するイオン量を信号として検出する。ＳＩＭは、予め指定された質量電荷比に対するイオン量を選択的に検出する。三連四重極型質量分析装置などでは、分析対象の成分から生じる特定のプロダクトイオンの量を選択的に検出する選択反応モニタリング（ＳＲＭ：Selected Reaction Monitoring）も利用される。分析対象の成分に由来するイオンや、そのプロダクトイオンの質量電荷比が既知の場合、これらの方法によって定量分析を高感度で行うことができる。
　生体試料中の薬剤成分や代謝物、環境試料中の残留物等の確認においては、液体クロマトグラフ質量分析装置のＳＩＭやＳＲＭによりイオン量の経時変化を示すクロマトグラムを取得し、分析対象成分や内部標準物質に対応するピークを検出し測定値を得る。ピーク検出では、ピークの開始点及び終了点を判定した上で、ピークの面積や高さを測定値として算出することが一般的に行われる。なお、ピークの保持時間により、分析対象成分や内部標準物質を判定するが、保持時間は液体クロマトグラフのカラムの種類や状態、分離条件に依存する。ピーク検出法には、データの変化量を勾配検出する方法などがあり、これを発展させた方法として、特許文献１に示されるようなショルダーピーク検出方法、さらには特許文献２に示されるような任意関数へのフィッティングにより検出する方法等がある。
特開昭６１－１４５４５７号公報 特開昭６３－１５１８５１号公報
　クロマトグラムからピークを同定し、ピークの面積や高さを計算する場合、例えば特許文献１，２に示された方法を用いてピークを検出する。しかし、生体試料中の薬剤成分や代謝物、環境試料中の残留物等の分析においては、分析対象成分が極めて微量な場合がある。この場合、クロマトグラム上で明確なピークが現れず、ノイズ除去や高度な信号処理を組み合わせて分析対象成分を検出する必要があり、ピークの検出は困難となる。
　クロマトグラフによる分析においては、保持時間の変動の問題がある。流路の詰まり、カラムの劣化、環境温度やカラム温度の微妙な差異によって、分析対象成分の保持時間は影響を受ける。このため、規定の分析条件における分析対象成分の保持時間が既知であったとしても、時間範囲を設けてピーク位置の探索を行うのが一般的である。前述のピーク検出が困難なケースに加え、保持時間が変動することを考慮した場合、分析対象成分の測定値の算出がより一層困難となる。
　以上のことから、分析対象成分が微量な場合においても、ピーク位置の同定が正確に行え、測定値の算出が可能となる方法が必要である。
　本発明のクロマトグラフィー質量分析方法は、一態様として、分析対象成分と類似する保持時間を有しかつ質量電荷比が異なる内部標準物質を試料に添加する工程と、試料をクロマトグラフ質量分析装置で測定し、分析対象成分のクロマトグラムと内部標準物質のクロマトグラムを得る工程と、内部標準物質のクロマトグラムからピークを検出し、当該ピークのピーク開始時間とピーク終了時間を求める工程と、求めたピーク開始時間とピーク終了時間を分析対象成分のクロマトグラムのピーク開始時間とピーク終了時間に適用する工程と、を有する。
　また、本発明のクロマトグラフ質量分析装置は、一態様として、分析対象成分と内部標準物質を同時に測定し、分析対象成分のクロマトグラムと内部標準物質のクロマトグラムを得るクロマトグラフ質量分析装置であって、内部標準物質のクロマトグラムからピーク開始点とピーク終了点を求めるピーク検出部と、ピーク検出部で検出したピーク開始点とピーク終了点からピーク開始時間とピーク終了時間を抽出するピーク範囲検出部と、ピーク範囲検出部で抽出したピーク開始時間とピーク終了時間を分析対象成分のクロマトグラムのピーク開始点とピーク終了点に適用するピーク範囲適用部と、を有する。
　本発明によると、分析対象成分のクロマトグラムの質に影響を受けずに測定値を算出できる。
　上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
内部標準物質クロマトグラムの成分ピーク開始点及び終了点の保持時間を、分析対象成分クロマトグラムのピーク開始点及び終了点に適用する例を示す概念図。 液体クロマトグラフ質量分析装置の構成例を示す模式図。 内部標準法で作製される試料の例と、当該試料を質量分析装置で測定した際の信号強度の例を示す概念図。 内部標準法で作成した検量線の例を示す図。 Testosterone及びTestosterone 13Cの未知試料におけるＳＲＭの測定結果データの例を示す図。 グラフィカルユーザインターフェイスの一例を示す図。 Testosterone d3のピーク開始点及び終了点の保持時間をTestosterone、Testosterone 13Cのピーク開始点及び終了点へ適用する例を示す図。 ピーク検出にかかる構成の一例を示す機能ブロック。 ピーク検出にかかる処理の流れを示すフローチャート。
　以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明の実施の態様は、後述する実施例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲において、種々の変形が可能である。
　また、ここではクロマトグラフ質量分析装置の例として液体クロマトグラフ質量分析装置を挙げたが、分析対象成分と内部標準物質が同時に測定されるものであればよく、本発明はガスクロマトグラフ質量分析装置にも応用できる。
［実施例１］
　一般的な液体クロマトグラフ質量分析装置における最も簡単な装置構成を用いて、男性ホルモンの一つであるTestosteroneを検出する例について説明する。図２は、液体クロマトグラフ質量分析装置の構成例を示す模式図である。
　溶媒送液部２０１は、水、アセトニトリルといった溶媒を送液する。一般的には、二つ以上の溶媒を設置し、比率を固定したアイソクラティック送液や、タイムプログラムによって溶媒の組成を変化させるグラジェント送液が可能である。溶媒送液部２０１は、分析中以外においても常に溶媒を送液し、試料分離部２０４の平衡化、安定化を図っている。
　試料導入部２０２は、分析者が分析を行いたい試料を設置し、オートサンプラと呼ばれる試料導入機構で順次試料の吸引を行う。また、ニードルや試料導入流路といった部位を試料吸引毎に洗浄する必要がある。このため、図示は省略したが、洗浄機構が別途搭載されているのが一般的である。
　試料注入部２０３は、溶媒送液部からの流路に、試料導入部で吸引した試料を注入する部位である。これは一般的には６方バルブに、サンプルループと呼ばれる配管を組み合わせたものを用いる。サンプルループは通常、試料導入部側に接続されている。試料吸引時は試料導入部により吸引した試料がサンプルループに導入され、導入が完了後、試料が満たされたサンプルループを試料分離部への流路へ切り替えることで、溶媒送液部２０１から試料分離部２０４への流路へ試料が注入される仕組みとなっている。
　試料分離部２０４には、試料を成分ごとに分離するためのカラムを設ける。カラムとは金属筒にシリカゲルやポリマーといった充填剤を充填したものである。ここに片側から試料を注入し、さらに溶媒を送り続けると、成分と充填剤との親和性に応じた速度で、成分がカラム内を移動する。これを利用して成分を分離する。カラムは充填剤の種類や粒径により特性が大きく異なるため、分離したい成分の種類や目的に応じて適切に選択する必要がある。
　質量分析部２０５は、試料分離部２０４で分離した成分をイオン化し、質量電荷比別に検出する部位である。イオン化法としては、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）等がある。また質量分析部には、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型などが一般的に用いられる。四重極型においては、四重極を１段配置したものの他に、３段配置した三連四重極型がある。これには、１段目で選択したイオンを２段目で開裂させ、生成されたプロダクトイオンから特定の質量電荷比のものを３段目で選択して測定することを可能としたものがある。このような測定法をＳＲＭと呼ぶ。
　質量電荷比別に選択され、検出器に導入されたイオンは、その量に対応する信号として検出される。さらに、質量分析部２０５で検出されたイオン量の信号は解析部２０６に送られ、ＳＩＭやＳＲＭのクロマトグラムとして平滑化処理、ピーク検出処理、面積、高さ計算処理といった各種データ処理が行われる。ここで算出したピーク面積やピーク高さが測定値となる。
　未知試料における特定成分の含有量、濃度を分析したい場合には、はじめに目的とする濃度範囲域で作製した複数の濃度系列の標準試料を分析装置で分析し、算出された測定値と既知濃度の対応付けから、測定値と濃度の関係を示すグラフを導出する。このグラフを検量線と呼ぶ。次に未知試料を測定し、分析対象成分の測定値を算出後、検量線に当てはめ濃度値を算出する。このように、検量線を作成すれば、未知の濃度の試料を測定し、その測定値に対して検量線から濃度を推定することができる。
　液体クロマトグラフ質量分析装置で定量分析を行う場合、一般的には内部標準法を用いる。内部標準法の場合、例えば生体から採取した試料に分析対象成分と類似する保持時間を有しかつ質量電荷比が異なる内部標準物質を添加する。図３は、内部標準法で作製される試料の例と、当該試料を質量分析装置で測定した際の信号強度の例を示す概念図である。測定濃度の系列に合わせたいくつかの濃度の分析対象成分３０１に、一定量の内部標準物質３０２を添加した標準試料３１１～３１３及び未知試料３１４を測定する。データ処理においては、まず標準試料３１１～３１３に対して、分析対象成分のピーク３２１と内部標準物質のピーク３２２の各々についてピーク検出を行い、測定値の比、すなわち（分析対象成分の測定値）／（内部標準物質の測定値）の値と既知濃度を対応付け、検量線を作成する。
　図４は、内部標準法で作成した検量線の例を示す図である。標準試料３１１～３１３の分析対象成分の測定値をａ1～ａ3、内部標準物質の測定値をｉ1～ｉ3とすると、各標準試料に含まれる分析対象成分の既知濃度ｃ1～ｃ3に対し、検量線４０１を引くことができる。この後、未知試料３１４を測定し、分析対象成分の測定値ａuと内部標準物質の測定値ｉuから未知試料に含まれる分析対象成分の濃度ｃuが算出できる。すなわち、比の値（ａu／ｉu）を検量線４０１に当てはめることによって濃度ｃuを求めることができる。
　このように、分析対象成分と内部標準物質の測定値の比を用いて計算を行う内部標準法の利点は、例えば試料の注入量の誤差、溶媒の揮発による誤差といった誤差要因を、比率計算によって相殺し、結果に影響を与えない点にある。そのためには、分析対象成分と内部標準物質の化学的挙動が極力等しくなるよう、内部標準物質の選定を行うことが必要となる。
　液体クロマトグラフ質量分析装置では、分析対象成分に対し安定同位体標識された元素を内部標準物質とし、その質量電荷比の違いから質量分析部で分離して検出することが一般的に行われている。具体的には、分析対象成分を構成する原子の一部を窒素安定同位体１５Ｎ、炭素安定同位体１３Ｃ、酸素安定同位体１８Ｏ、水素安定同位体２Ｈなどで置き換えた安定同位体標識化合物を内部標準物質とする。Testosteroneにおいては、例えば１３Ｃ標識を行ったもの（以下、Testosterone 13Cと表記）が例示できる。またその濃度は質量分析装置の感度や精度に応じて任意の量とすることができ、例えば５００ｆｍｏｌを例示することができる。
　図１は、内部標準物質クロマトグラムの成分ピーク開始点及び終了点の保持時間を、分析対象成分クロマトグラムのピーク開始点及び終了点に適用する実施例を示す概念図である。
　ＳＲＭにより分析対象成分及び内部標準物質を同時に測定した場合、図１に示すように、２本のクロマトグラム、すなわち分析対象成分のクロマトグラム１０１と内部標準物質のクロマトグラム１０２が得られる。
　このような場合、従来は内部標準物質のクロマトグラムのピーク１１３に対応する測定値とピークトップなどの保持時間を求め、分析対象成分のクロマトグラム１０１から所定の領域におけるピーク（群）を検出し、それ（それら）の測定値とピークトップなどの保持時間（の組）を求める。求めたピーク（群）から、内部標準物質のピークの保持時間に最も近いピーク１２３を分析対象成分として選択するなどしていた。信号強度の閾値を設けてピークを検出する場合、閾値によってはピーク１２３を検出できない。そこで閾値を下げると、十分な信号強度がないにもかかわらず、信号強度の変化量を勾配検出する方法や、ガウシアン関数へのフィッティングなどピーク検出として煩雑な処理を繰り返すことになり、信頼できる結果を得ることは難しい。
　しかし、前述のとおり内部標準物質は分析対象成分と化学的挙動が極力等しくなるよう選定しているため、これら２本のクロマトグラムにおいて保持時間はほぼ等しい。すなわち、分析対象成分のクロマトグラム１０１においてピーク開始点及びピーク終了点の保持時間は、内部標準物質のピーク開始点及びピーク終了点の保持時間と類似していると考えられる。本実施例は、この点に着目したものである。そこで、内部標準物質のピーク開始点１１１及びピーク終了点１１２の保持時間を、分析対象成分のピーク開始点１２１及びピーク終了点１２２の保持時間とし、ピークの面積、高さを計算することが、本実施例の方法である。
　なお、内部標準物質の保持時間は、分析対象成分と同じであることが望ましいが、分析対象成分のピーク面積、ピーク高さの計算に与える影響が無視できる程度であれば、分析対象成分と内部標準物質の保持時間がずれていても問題ない。
　図８は、本実施例の液体クロマトグラフ質量分析装置の解析部２０６に設けられたピーク検出にかかる構成の一例を示す機能ブロック図である。図８を参照しつつ本実施例のピーク判定について説明する。
　ＳＩＭやＳＲＭで得た内部標準物質のクロマトグラムは、ピーク検出部８０１によってピーク判定され、ピーク開始点８０６とピーク終了点８０９、及び内部標準ピーク部分データ８０８が出力される。ピーク範囲検出部８０２では、ピーク開始点とピーク終了点から、ピーク開始時間８１３とピーク終了時間８１４を抽出する。ピーク範囲適用部８０３ではピーク開始時間とピーク終了時間を利用し、分析対象成分クロマトグラムから成分ピーク部分データ８１０を出力する。ピーク計算部８０４では、内部標準ピーク部分データ８０８と成分ピーク部分データ８１０から、それぞれ内部標準測定値（面積、高さ）及び成分測定値（面積、高さ）を求める。なお、実施例１では、ピーク範囲検出部８０２はピーク開始点８０６からピーク開始時間８１３を、ピーク終了点８０９からピーク終了時間８１４を抽出するのみである。ピーク範囲検出部８０２のさらなる機能については実施例２で説明する。
　図９は、ピーク検出にかかる処理の流れを示すフローチャートである。データ収集（Ｓ１１）の後、ピーク検出部８０１において内部標準物質のクロマトグラムのピーク検出を行う（Ｓ１２）。さらにピーク範囲検出をピーク範囲検出部８０２で実施する（Ｓ１３）。ピーク範囲検出部８０２で求めたピーク開始時間８１３とピーク終了時間８１４に基づき、分析対象成分のクロマトグラムに対するピーク範囲適用をピーク範囲適用部８０３で行い（Ｓ１４）、ピーク計算をピーク計算部８０４において実施する（Ｓ１５）。ここで得られた分析対象成分のピーク面積やピーク高さの値は、内部標準物質のピーク面積やピーク高さとの比を求めることで検量線の作成や濃度の算出に利用することができる。
　以上のステップを踏むことで、分析対象成分に由来する信号の有無や信号強度に影響されず、確実な測定値の算出が可能となる。内部標準物質は全試料に一定量含まれ、そのＳＩＭ又はＳＲＭのクロマトグラムには必ずピークが出現する。また内部標準物質は、例えば分析対象成分と保持時間が類似するような安定同位体標識された化合物を選択する。さらに、内部標準物質のピーク開始点及びピーク終了点の保持時間を用いて、分析対象成分のクロマトグラムから面積や高さを算出することで、分析対象成分のピーク検出が困難なケースにおいても測定値が算出できる。
　また仮に、課題の欄に示したような保持時間の変動の問題が発生した場合においても、分析対象成分と内部標準物質の両方が同じ挙動を示し変動すると考えられる。このため、前記のような分析対象成分のピークが未検出のような状況かつ保持時間の変動が起こりえる場合においても、本実施例の方法によると測定値を正しく算出できる。
　従来、分析対象成分が微量でピーク検出が難しい場合や、比較的多量の夾雑成分の影響でノイズと判定されピーク検出できない場合などがあった。しかし、内部標準物質のピーク開始点及び終了点の保持時間から分析対象成分のピークを判定することにより、そのような状況においても目的とする成分の測定値を得ることができ、ロバストネスに優れる。
　本実施例では、分析対象成分であるTestosteroneに対して、内部標準物質としてTestosterone 13Cを用いた。すなわち、試料に内部標準物質として一定量のTestosterone 13Cを添加し、この試料を液体クロマトグラフ質量分析装置で測定して分析対象成分のクロマトグラムと内部標準物質のクロマトグラムを得た。
　Testosterone及びTestosterone 13Cの分析条件例を示す。液体クロマトグラフでは、溶媒は水／アセトニトリル溶液を０．２ｍＬ／ｍｉｎの流量とし、カラムはＣ１８カラム（粒径５μｍ、管径２．０ｍｍ×５０ｍｍ）を用いる。この条件における保持時間は、例えば６４秒を例示できる。分離した試料は、例えばＥＳＩイオン源によりイオン化し、三連四重極型質量分析装置でＳＲＭにより測定する。
　図５は、Testosterone及びTestosterone 13Cの未知試料におけるＳＲＭの測定結果データの例を示す図である。この図は、Testosterone 13Cのピーク開始点及び終了点の保持時間をTestosteroneのピーク開始点及び終了点へ適用する例を示している。Testosteroneのクロマトグラム５０１は、前記分析条件で成分分離とＳＲＭの測定を行った結果であり、このときのＱ１とＱ３に各々設定すべき質量電荷比は２８９と９７である。またTestosterone 13Cのクロマトグラム５０２は同様にTestosterone 13CをＳＲＭで測定した結果であり、このときのＱ１とＱ３に各々設定すべき質量電荷比は２９２と１００である。
　本分析結果例では分析対象成分であるTestosteroneの濃度が低く、クロマトグラム５０１におけるTestosteroneのピーク５０５が明瞭ではないため、正確なピーク検出が困難である。一方、内部標準物質として十分な量で添加されたTestosterone 13Cのピーク５０６は信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が良好であり、容易に同定可能なピークが得られている。
　本実施例では、まずTestosterone 13Cのピーク５０６に対してピーク検出を行う。これにより、ピーク開始点５１１及びピーク終了点５１２が検出される。この２点を結ぶ、Testosterone 13Cのベースライン５０４を引き、Testosterone 13Cのピーク５０６の面積、高さ計算を行う。次に、Testosterone 13Cのピーク５０６に対して検出されたピーク開始点５１１及びピーク終了点５１２の保持時間を、Testosteroneのクロマトグラム５０１に適用し、Testosteroneのピーク５０５のピーク開始点及びピーク終了点とする。それぞれの点の信号強度は、Testosteroneのクロマトグラム５０１の信号強度の並びにおいて、ピーク開始点５１１とピーク終了点５１２の保持時間に対応する値となる。この２点を結ぶ、Testosteroneのベースライン５０３を引き、Testosteroneのピーク５０５の面積、高さを計算する。最後に、TestosteroneとTestosterone 13Cの面積比、高さ比を算出し、検量線から濃度を算出する。
　なおＳＲＭは、一般的に複数の質量電荷比に対応するイオン量の検出を時分割方式で行うため、Testosteroneのクロマトグラム５０１とTestosterone 13Cのクロマトグラム５０２は各データ点の保持時間が一致しない場合がある。このような場合には、Testosterone 13Cのピーク５０６に対して検出されたピーク開始点５１１及びピーク終了点５１２の各保持時間に最も近く存在するTestosteroneのクロマトグラム５０１の各データ点を、Testosteroneのピーク５０５のピーク開始点及びピーク終了点とすればよい。
　以上の方法を用いることで、同定が困難なケースにおけるTestosteroneのピーク５０５のピーク検出を行うことなしに、ベースラインを引き、面積、高さの算出が可能である。すなわち、ノイズが多くピークの識別が困難な場合、及びそれに加えて保持時間の変動の問題が発生した場合においても、分析対象成分の面積や高さを、より確実に算出できる。
　また他の効果として、分析対象成分のピーク検出が不要となるため、データ解析処理の負荷が軽減する。特に、内部標準物質は検出器で十分なＳ／Ｎをもって検出可能な濃度域で測定することが一般的であるため、比較的簡単なアルゴリズムで正確にピーク開始、終了点を算出することが可能である。このピーク開始点及びピーク終了点の保持時間を分析対象成分のクロマトグラムへ適用すればよいわけであるから、濃度域が未知でかつ保持時間が変動する分析対象成分のピークを確実に検出することができ、大幅なデータ解析処理の負荷軽減となる。
　図６は、本実施例におけるピーク検出法を指示するための、解析部２０６におけるグラフィカルユーザインターフェイスの一例を示す図である。なお、ピーク検出の対象となる分析対象成分と内部標準物質を検出目的成分とした。
　図６において、“ＩＤ”は、検出目的成分の番号を１から順に指定するものであり、ＩＤの番号が質量分析装置のＳＲＭの測定チャンネルと対応している。これは、検出目的成分の設定状況に応じて自動入力となっていてもよい。“Name”は、検出目的成分の名称である。この項目は、ユーザが自由に名称を入力できるが、同一の名称を二つ以上設定することはできない。“Expected RT”には、検出目的成分のピークトップの保持時間を指定する。“RT Range”は、検出目的成分のピークと判定する範囲を指定する。この列に指定された保持時間の範囲において、最もピークトップがExpected RTに近いピークを、検出目的成分のピークと判定する。本例ではＩＤ＝２のTestosterone 13Cのピークを（Expected RT－RT Range）から、（Expected RT＋RT Range）まで、すなわち６４±１０秒の保持時間の範囲において判定する。
　“IS ID”には、内部標準物質のＩＤを指定する。内部標準物質自体である場合は、本列には特別値として０を設定する。また分析対象成分である場合は、その成分と面積、高さの比をとるべき内部標準物質のＩＤを指定する。図６の例では、ＩＤ＝１のTestosteroneはＩＤ＝２のTestosterone 13Cを内部標準と設定する必要があるため、IS IDに２を設定する。またTestosterone 13Cは、内部標準物質であるため特別値の０を設定している。
　“Peak Detect Type”では、ピーク検出方法を選択する。本列は複数のピーク検出方法から目的の方法を択一的に選択する入力箇所であり、選択肢の例としては、たとえば勾配検出法（選択肢名Delta）、フィッティングによるピーク検出法（選択肢名Fitting）、内部標準物質のピーク開始・終了時間を使用する（With IS）などから選択する。なお、内部標準物質のピーク開始・終了時間を使用する（With IS）を選択をした場合、Expected RT及びRT Rangeの入力は不要であるから、当該成分のこれらの項目は空欄でかまわない。さらに、IS IDに０が設定されているにもかかわらずPeak Detect TypeがWith ISとなっている場合は、エラーを表示するなどの整合性チェックを行うことが望ましい。
　以上で、液体クロマトグラフ質量分析装置のＳＲＭで得たクロマトグラムからピーク検出処理を行う際の、分析対象成分と内部標準物質におけるピーク検出法の設定が可能となる。
［実施例２］
　質量分析装置によるＳＲＭでは、複数のチャンネルを設定できることが一般的である。このため、実施例１のTestosteroneの測定においては、内部標準物質としてTestosterone 13Cを同時に測定した。本実施例ではさらに、実施例１に示したTestosterone 13Cに加え、Testosteroneに含まれる水素原子の一部を重水素に置き換えたTestosterone d3を内部標準物質として試料に添加し、これらを同時に測定する場合の例を示す。すなわち、試料に複数の異なる内部標準物質を添加し、内部標準物質のクロマトグラムとして複数のクロマトグラムを得る例である。
　図７は、Testosterone、Testosterone d3、Testosterone 13Cを同時に測定した例を示す図である。ここでは、Testosterone d3のピーク開始点及び終了点の保持時間をTestosterone、Testosterone 13Cのピーク開始点及び終了点へ適用する例を示す。Testosteroneのクロマトグラム７０１、Testosterone d3のクロマトグラム７０２、Testosterone 13Cのクロマトグラム７０３はそれぞれ、質量分析装置によるＳＲＭで同時かつ個別に測定されたものである。
　Testosteroneのクロマトグラム７０１及びTestosterone 13Cのクロマトグラム７０３については、ＳＲＭの条件に設定すべき質量電荷比は実施例１と同様である。Testosterone d3のクロマトグラム７０２に設定すべき質量電荷比は、Ｑ１とＱ３について２９２と９７である。この分析条件において、Testosterone、Testosterone d3、Testosterone 13Cを同時に測定し、Testosteroneのピーク７１１、Testosterone d3のピーク７１２、Testosterone 13Cのピーク７１３を検出している。
　内部標準物質であるTestosterone d3、Testosterone 13Cについては、ピークが比較的明確に検出されているが、Testosterone d3のピーク７１２はTestosterone 13Cのピーク７１３より信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が良好である。このようなケースにおいては、例えばＳ／Ｎが最も良好な内部標準物質であるTestosterone d3のピーク７１２を用いてピーク開始点７２１及びピーク終了点７２２を検出し、それらの保持時間をもってTestosterone及びTestosterone 13Cの定量値を算出することができる。
　内部標準物質は、本実施例では２種類を用いたが、３種類又はそれ以上を用いても良い。２種類以上の内部標準物質を用いた場合には、内部標準物質のクロマトグラムとして複数のクロマトグラムが得られる。それら複数のクロマトグラムからそれぞれピークを検出し、各ピークのピーク開始時間とピーク終了時間を求めると、複数のピーク開始時間及び複数のピーク終了時間が得られる。これら複数のピーク開始時間及び複数のピーク終了時間からピーク開始時間とピーク終了時間の組を１組選別又は算出し、そのピーク開始時間とピーク終了時間の組を分析対象成分のクロマトグラムのピーク開始時間とピーク終了時間に適用する。分析対象成分のクロマトグラムに適用すべきピーク開始時間とピーク終了時間の組を求める方法等については、例えば以下のような方法が挙げられる。
（１）例えば、最もＳ／Ｎのよいものを一つ選択する方法。
　内部標準物質のクロマトグラムにおいて、内部標準物質のピークの近傍の区間をノイズ判定領域とし、その区間の信号強度の最大値と最小値の差の半値をＮ、内部標準物質のピークの高さをＳとする。複数の内部標準物質のクロマトグラムから、それぞれＳ／Ｎを求めて、最もその値の大きいものにおける、内部標準物質のピークのピーク開始時間とピーク終了時間の組を、分析対象成分のクロマトグラムにおけるピーク開始時間とピーク終了時間として適用する。これにより、より安定したピーク検出が可能となり、定量値の算出において誤差やばらつきを抑えることができる。
（２）例えば、Ｓ／Ｎが閾値以上の値を持つものを選別し、ピーク開始時間、ピーク終了時間については、選別した各ピークのピーク開始時間、ピーク終了時間の平均値を用いる方法。
　閾値以上のＳ／Ｎを有する内部標準物質のクロマトグラムを選別し、それらのクロマトグラムにおけるピーク開始時間の平均値及びピーク終了時間の平均値を算出する。それを分析目的成分のクロマトグラムに適用するピーク開始時間とピーク終了時間の組とする。これにより、夾雑成分やノイズの影響を平均化でき、安定したピーク検出に寄与する。
（３）例えば、すべての内部標準物質のピーク検出を行い、そのなかで最も早い保持時間のピーク開始点及び最も遅い保持時間のピーク終了点を選択する方法。
　複数の内部標準物質のクロマトグラムから求められた複数のピーク開始時間と複数のピーク終了時間のうち最も早いピーク開始時間と最も遅いピーク終了時間を、分析目的成分のクロマトグラムに適用するピーク開始時間とピーク終了時間の組として選別する。最も早いピーク開始時間と最も遅いピーク終了時間を選択することによって、より広い範囲をピークとみなすことになり、分析対象成分のピーク開始点や終了点の変動に対して安定したピーク判定が可能となる。
（４）例えば、分析対象成分のクロマトグラムと、ある内部標準物質のクロマトグラムの強度を正規化したデータにおいて、同じ保持時間に相当する各信号強度の差を求め、その分散をノイズ値としたとき、内部標準物質のピーク高さとノイズ値の比が最も高い内部標準物質を選び、そのピーク開始時間、ピーク終了時間を選択する方法。
　分析対象成分のクロマトグラムにおける各信号強度の最大値と最小値を１と０で正規化し、さらに内部標準物質のクロマトグラムにおける各信号強度も同様に１と０で正規化する。同じ保持時間に相当する各信号強度の差を求め、その分散をノイズ値とする。内部標準物質のピーク高さとノイズ値の比が最も大きい内部標準物質のピーク開始時間とピーク終了時間を、分析目的成分のクロマトグラムに適用するピーク開始時間とピーク終了時間の組として選別する。この方法により、安定してノイズの波形が得られない場合にもＳ／Ｎを求めることができる。
（５）例えば、複数のクロマトグラムの各点における信号強度の２乗の値を求め、その算出された値をデータ点とするクロマトグラムのピーク検出を行い、ピーク開始時間とピーク終了時間を求める方法。
　内部標準物質のクロマトグラムの各保持時間における信号強度を２乗して得たクロマトグラムに対してピーク判定を行うことにより、ノイズを抑止したピーク判定が可能となる。ピーク開始時間とピーク終了時間の選択に関するこの方法は、前述の方法と併用することができる。
　２種類以上の内部標準物質を用いた場合、図８のブロック図のピーク検出部８０１を複数回適用する。さらに、ピーク範囲検出部８０２において、複数のピーク開始点８０６、複数のピーク終了点８０９、及びそれぞれの内部標準物質クロマトグラムや分析対象成分クロマトグラムを参照し、ピーク開始時間８１３とピーク終了時間８１４を求める。
　以上のような方法により、内部標準物質のピーク開始点、ピーク終了点から、分析対象成分のピーク開始点、ピーク終了点を正しく検出することができる。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
１０１　分析対象成分のクロマトグラム
１０２　内部標準物質のクロマトグラム
１１１　ピーク開始点
１１２　ピーク終了点
１２１　ピーク開始点
１２２　ピーク終了点
２０１　溶媒送液部
２０２　試料導入部
２０３　試料注入部
２０４　試料分離部
２０５　質量分析部
２０６　解析部
５１１　ピーク開始点
５１２　ピーク終了点
７２１　ピーク開始点
７２２　ピーク終了点

Claims (12)

  1. 　分析対象成分と類似する保持時間を有しかつ質量電荷比が異なる内部標準物質を試料に添加する工程と、
    　前記試料をクロマトグラフ質量分析装置で測定し、前記分析対象成分のクロマトグラムと前記内部標準物質のクロマトグラムを得る工程と、
    　前記内部標準物質のクロマトグラムからピークを検出し、当該ピークのピーク開始時間とピーク終了時間を求める工程と、
    　求めたピーク開始時間とピーク終了時間を前記分析対象成分のクロマトグラムのピーク開始時間とピーク終了時間に適用する工程と、
    を有するクロマトグラフィー質量分析方法。
  2. 　前記内部標準物質として複数の異なる内部標準物質を試料に添加し、
    　前記内部標準物質のクロマトグラムとして複数のクロマトグラムを得、
    　前記複数のクロマトグラムからそれぞれピークを検出し、各ピークのピーク開始時間とピーク終了時間を求め、
    　求めた複数のピーク開始時間及び複数のピーク終了時間からピーク開始時間とピーク終了時間の組を１組選別又は算出し、
    　前記ピーク開始時間とピーク終了時間の組を前記分析対象成分のクロマトグラムのピーク開始時間とピーク終了時間に適用する、請求項１に記載のクロマトグラフィー質量分析方法。
  3. 　前記複数のクロマトグラムのうち最も大きい信号対ノイズ比を持つクロマトグラムのピーク開始時間とピーク終了時間を前記ピーク開始時間とピーク終了時間の組として選別する、請求項２に記載のクロマトグラフィー質量分析方法。
  4. 　前記複数のクロマトグラムのうち信号対ノイズ比が閾値以上であるクロマトグラムのピーク開始時間の平均値とピーク終了時間の平均値を算出し、それぞれの平均値を前記ピーク開始時間とピーク終了時間の組とする、請求項２に記載のクロマトグラフィー質量分析方法。
  5. 　前記複数のクロマトグラムから求められた複数のピーク開始時間と複数のピーク終了時間のうち最も早いピーク開始時間と最も遅いピーク終了時間を前記ピーク開始時間とピーク終了時間の組として選別する、請求項２に記載のクロマトグラフィー質量分析方法。
  6. 　前記分析対象成分のクロマトグラムと１つの内部標準物質のクロマトグラムの信号強度を正規化したデータにおいて、同じ保持時間に相当する各信号強度の差を求め、その分散をノイズ値としたとき、ピーク高さとノイズ値の比が最も大きい内部標準物質のピーク開始時間とピーク終了時間を前記ピーク開始時間とピーク終了時間の組として選別する、請求項２に記載のクロマトグラフィー質量分析方法。
  7. 　前記内部標準物質のクロマトグラムの各点における信号強度の２乗の値を求め、その値をデータ点とするクロマトグラムから前記ピーク開始時間と前記ピーク終了時間を求める、請求項１に記載のクロマトグラフィー質量分析方法。
  8. 　前記内部標準物質は前記分析対象成分と保持時間が類似する安定同位体標識化合物である、請求項１に記載のクロマトグラフィー質量分析方法。
  9. 　分析対象成分と内部標準物質を同時に測定し、分析対象成分のクロマトグラムと内部標準物質のクロマトグラムを得るクロマトグラフ質量分析装置であって、
    　内部標準物質のクロマトグラムからピーク開始点とピーク終了点を求めるピーク検出部と、
    　前記ピーク検出部で検出したピーク開始点とピーク終了点からピーク開始時間とピーク終了時間を抽出するピーク範囲検出部と、
    　前記ピーク範囲検出部で抽出したピーク開始時間とピーク終了時間を前記分析対象成分のクロマトグラムのピーク開始点とピーク終了点に適用するピーク範囲適用部と、
    を有するクロマトグラフ質量分析装置。
  10. 　前記ピーク検出部は、異なる内部標準物質に対する複数のクロマトグラムからそれぞれのピークのピーク開始点とピーク終了点を求め、
    　前記ピーク範囲検出部は、前記ピーク検出部で求められた複数のピーク開始点及び複数のピーク終了点からピーク開始時間とピーク終了時間の組を１組選別又は算出し、
    　前記ピーク範囲適用部は、前記ピーク開始時間とピーク終了時間の組を分析対象成分のクロマトグラムのピーク開始点とピーク終了点に適用する、請求項９に記載のクロマトグラフ質量分析装置。
  11. 　前記内部標準物質は前記分析対象成分と保持時間が類似する安定同位体標識化合物である、請求項９に記載のクロマトグラフ質量分析装置。
  12. 　前記クロマトグラフは液体クロマトグラフである、請求項９に記載のクロマトグラフ質量分析装置。
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