DE112012005018T5

DE112012005018T5 - Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe und aurikuläres Knorpelgewebe

Info

Publication number: DE112012005018T5
Application number: DE112012005018.5T
Authority: DE
Inventors: Noritaka Isogai; Yoshihito Itani; Akeo Hagiwara; Shinichiro Morita; Kosuke Sawai; Koichi Hatakeyama
Original assignee: Gunze Ltd
Current assignee: Gunze Ltd
Priority date: 2011-12-02
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2014-08-21
Anticipated expiration: 2032-12-01
Also published as: WO2013081103A1; US20140302606A1; CN103957950B; JP5320526B1; US9550977B2; DE112012005018B4; JPWO2013081103A1; CN103957950A

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe, das eine ausreichende Dicke und mechanische Festigkeit hat, und auf aurikuläres Knorpelgewebe, das durch das Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe hergestellt wurde. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe bereit, umfassend die Schritte: Beimpfen eines Vliesgewebes, das aus einem bioresorbierbaren Material, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm hat, besteht, mit aurikulären Chondrozyten und Bilden eines Verbundmaterials aus dem Vliesgewebe, das mit den aurikulären Chondrozyten beimpft ist, und einem netzartigen Gerüst, das aus einem nicht-bioresorbierbaren Material besteht, und Formen des Verbundmaterials.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe, das eine ausreichende Dicke und mechanische Festigkeit hat, und auf aurikuläres Knorpelgewebe, das durch das Verfahren zur Herstellung von aurikuärem Knorpelgewebe hergestellt wurde.
STAND DER TECHNIK
Jüngere Fortschritte in der „Cellular Engineering”-Technologie haben es möglich gemacht, verschiedene Typen von Tierzellen, einschließlich humaner Zellen, zu kultivieren. Außerdem hat sich die Forschung der sogenannten regenerativen Medizin, die versucht, humane Gewebe und Organe unter Verwendung der kultivierten Zellen zu rekonstruieren, schnell weiterentwickelt. In der regenerativen Medizin ist der kritische Punkt, ob Zellen wachsen und sich differenzieren, um so die Konstruktion dreidimensionaler Körpergewebe-artiger Strukturen zu erlauben. Verfahren, die verwendet werden, umfassen zum Beispiel eins, bei dem Zellen und Wachstumsfaktoren verwendet werden, und eins, in dem ein Träger als Gerüst für die Regeneration von Gewebe oder Organ in einen Patienten implantiert wird. Als ein Beispiel eines solchen Trägers ist in der Patentliteratur 1 ein Gerüst offenbart, das aus einem Kollagen-Einzelgarn besteht.
Außerdem offenbaren Patentliteratur 2 und Patentliteratur 3 einen Schaum, der aus einem bioresorbierbaren Material besteht, ein kardiovaskuläres Gewebekulturgerüst, das durch das bioresorbierbare Material verstärkt wird, und ein Nervenregenerationsgerüst, das eine schlauchförmige Gestalt hat.
Außerdem offenbart Patentliteratur 4 ein biomedizinisches Material, das ein Gel umfasst, welches Zellen in einem Skelett, bestehend aus einem schwammartigen oder Vlies-Polymer-Formmaterial, dispergiert hat.
Eine der Aufgaben der regenerativen Medizin ist die Regeneration von aurikulärem Knorpelgewebe. Die Regeneration von aurikulärem Knorpelgewebe erfordert großes und dickes Gewebe, das eine relativ hohe mechanische Festigkeit hat. Unglücklicherweise war es schwierig, ein derartiges großes und dickes aurikuläres Knorpelgewebe durch ein Verfahren herzustellen, das ein herkömmliches Gerüst zur Herstellung von Körpergewebe verwendet.
LITERATURLISTE
– Patentliteratur

Patentliteratur 1: Japanische Kokai-Veröffentlichung Nr. 2003-193328 ( JP-A 2003-193328 )
Patentliteratur 2: Japanische Kokai-Veröffentlichung Nr. 2001-78750 ( JP-A 2001-78750 )
Patentliteratur 3: Japanische Kokai-Veröffentlichung Nr. 2003-19196 ( JP-A 2003-19196 )
Patentliteratur 4: Japanische Kokai-Veröffentlichung Nr. 2003-204807 ( JP-A 2003-204807 )

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
– Technisches Problem
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe, das ausreichende Dicke und ausreichende mechanische Festigkeit hat, und aurikuläres Knorpelgewebe, das durch das Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe hergestellt wurde.
– Lösung des Problems
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe, umfassend die Schritte: Beimpfen eines Vliesgewebes, das aus einem bioresorbierbaren Material, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm hat, besteht, mit aurikulären Chondrozyten und Bilden eines Verbundmaterials aus dem Vliesgewebe, das mit den aurikulären Chondrozyten beimpft ist, und einem netzartigen Gerüst, das aus einem nicht-bioresorbierbaren Material besteht, und Formen des Verbundmaterials.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden detailliert beschrieben.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung hatten das Ziel, aurikuläres Knorpelgewebe durch Beimpfen von Trägern, die aus verschiedenen Materialien gebildet sind und verschiedene Formen haben, mit aurikulären Chondrozyten zu regenerieren, und als Resultat fanden sie heraus, dass die Regeneration von aurikulärem Knorpelgewebe deutlich begünstigt wurde, wenn ein Vliesgewebe, das aus einem bioresorbierbaren Material, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm hat, besteht, verwendet wurde, wenn man Vergleiche zu einer Verwendung von Trägern, die aus anderen Materialien geformt sind und andere Formen haben, anstellt. Als Resultat weiterer Studien fanden die Erfinder, dass aurikuläres Knorpelgewebe, das eine ausreichende Dicke und ausreichende mechanische Festigkeit hat, in der folgenden Art hergestellt werden kann: Beimpfen von Vliesgewebe, das aus einem bioresorbierbaren Material, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm hat, besteht, mit aurikulären Chondrozyten und anschließend Bilden eines Verbundmaterials aus dem obigen Vliesgewebe und einem netzartigen Gerüst, das aus einem nicht-bioresorbierbaren Material besteht, und Formen des Verbundmaterials. Auf der Basis dieser Feststellungen wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
Es ist unklar, warum die Regeneration von aurikulärem Knorpelgewebe durch die Verwendung eines Vliesgewebes, das aus einem bioresorbierbaren Material, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm hat, besteht, besonders begünstigt wird. Als Experiment beimpften die Erfinder der vorliegenden Erfindung mehrere Vliesgewebe, die aus Polyglycolid, das unterschiedliche durchschnittliche Faserdurchmesser hatte, bestanden, mit aurikulären Chondrozyten und zählten die Zahl der anhaftenden Zellen. Die Resultate zeigten, dass keine signifikante Erhöhung bei der Zellanhaftung durch die Verwendung eines Vliesgewebes, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm hatte, erreicht wurde.
Das Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe der vorliegenden Erfindung umfasst den Schritt des Beimpfens eines Vliesgewebes, das aus einem bioresorbierbaren Material, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm hat, besteht (im Folgenden manchmal vereinfacht als „Vliesgewebe” bezeichnet), mit aurikulären Chondrozyten. Durch die Verwendung eines Vliesgewebes, das einen solchen spezifischen durchschnittlichen Faserdurchmesser hat und aus einem solchen spezifischen Material besteht, wird aurikuläres Knorpelgewebe mit ausreichender Dicke und ausreichender mechanischer Festigkeit produziert.
Das bioresorbierbare Material ist nicht besonders beschränkt. Beispiele dafür umfassen Polyglycolid, Polylactide (D-, L-, DL-Isomer), Polycaprolacton, Glycolsäure-Lactid(D-, L-, DL-Isomer)-Copolymere, Glycolsäure-ε-Caprolacton-Copolymere, Lactid(D-, L-, DL-Isomer)-ε-Caprolacton-Copolymere und Polyp-dioxanon). Diese können allein oder in Kombination aus zwei oder mehreren davon verwendet werden. Unter diesen sind Polyglycolid oder Lactid(D-, L-, DL-Isomer)-ε-Caprolaoton-Copolymere bevorzugt, und Polyglycolid ist bevorzugter.
Das Vliesgewebe hat einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm. Das Vliesgewebe, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser im obigen Bereich hat, begünstigt die Regeneration von aurikulärem Knorpelgewebe. Spezifischer begünstigt das Vliesgewebe, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 μm hat, die Regeneration von aurikulärem Knorpelgewebe besonders.
Was den durchschnittlichen Faserdurchmesser des Vliesgewebes, wie es hierin beschrieben wird, betrifft, so wird ein Teil aus der Mitte des Vliesgewebes herausgeschnitten und unter einem Elektronenmikroskop betrachtet, und Fasern im Fokus werden statisch ausgewählt. Dann werden die Durchmesser der Fasern in verschiedenen Teilen des Gewebes gemessen, bis die Gesamtzahl der Fasern, die gemessen wurde, wenigstens 100 ist. Der durchschnittliche Faserdurchmesser bezieht sich auf einen durchschnittlichen Wert der gemessenen Durchmesser der wenigstens 100 Fasern.
Eine bevorzugte Untergrenze des Faserflächengewichts des Vliesgewebes ist 1 g/m² und eine bevorzugte Obergrenze desselben ist 100 g/m². Wenn das Faserflächengewicht außerhalb des obigen Bereichs liegt, kann die Regeneration von aurikulärem Knorpelgewebe ungenügend sein. Eine bevorzugtere Untergrenze des Faserflächengewichts des Vliesgewebes ist 5 g/m² und eine bevorzugtere Obergrenze desselben ist 50 g/m².
Um das Vliesgewebe, das aus einem bioresorbierbaren Material, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm hat, besteht, herzustellen, kann ohne Beschränkung ein beliebiges Verfahren verwendet werden. Beispiele der Verfahren umfassen herkömmlich bekannte Verfahren, zum Beispiel Elektrospinning-Abscheidung, Schmelzblasen, Vernadelung, Spinnvlies-Technik, Jet-Spinnverfahren, Spunlacing, Airlaid-Technik, thermisches Bonding, Harz-Bonding und Feuchtverfahren. Unter diesen ist Schmelzblasen geeignet.
Im Schritt des Beimpfens werden aurikuläre Chondrozyten auf dem Vliesgewebe ausgesät bzw. wird das Vliesgewebe mit aurikulären Chondrozyten beimpft.
Die aurikulären Chondrozyten können durch ein herkömmlicherweise bekanntes Verfahren extrahiert werden. Aurikuläre Chondrozyten können beispielsweise in der folgenden Art isoliert werden: Entfernung der Haut, des Bindegewebes und der Knorpelmembranen von einer Aurikula eines Menschen oder eines Tieres; Schneiden der Aurikula in kleine Stücke (mit einer Größe von etwa 5 mm × 5 mm) und Behandeln der Stücke mit Kollagenase. Die isolierten aurikulären Chondrozyten können so, wie sie sind, in dem Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden oder können zuerst in Kultur wachsen gelassen werden und dann in dem Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das Verfahren zum Beimpfen ist nicht besonders beschränkt und es können herkömmlicherweise bekannte Verfahren zum Beimpfen verwendet werden.
Die Zellbeimpfungsdichte während des Beimpfens bzw. Aussäens ist nicht besonders beschränkt. Eine bevorzugte Untergrenze ist 2,0 × 10⁷ Zellen/cm² und eine bevorzugte Obergrenze ist 1,0 × 10⁸ Zellen/cm². Wenn die Zellbeimpfungsdichte weniger als 2,0 × 10⁷ Zellen/cm² ist, kann es Zeit in Anspruch nehmen, bis aurikuläres Knorpelgewebe mit ausreichender Dicke und ausreichender mechanischer Festigkeit gebildet ist, wohingegen die Wirkung nicht länger ansteigt, nachdem die Zellbeimpfungsdichte 1,0 × 10⁸ Zellen/cm² übertroffen hat. Eine bevorzugtere Untergrenze der Zellbeimpfungsdichte ist 5,0 × 10⁷ Zellen/cm².
Das Vliesgewebe, das mit den aurikulären Chondrozyten beimpft ist, wird vorzugsweise für etwa 10 Minuten stehen gelassen, bis die aurikulären Chondrozyten genügend an dem Vliesgewebe anhaften. Falls erforderlich, können die aurikulären Chondrozyten außerdem für etwa mehrere Stunden bis mehrere Tage kultiviert werden. Als Kulturmedium zum Kultivieren der aurikulären Chondrozyten kann zum Beispiel ein mit Serum supplementiertes Medium verwendet werden, das erhalten wird, indem etwa 1 bis 10 Gew.-% fötales Rinderserum zu einem üblicherweise verwendeten Kulturmedium, zum Beispiel MEM oder DMEM, gegeben werden.
Das Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe der vorliegenden Erfindung umfasst den Schritt des Bildens eines Verbundmaterials aus dem Vliesgewebe, das mit den aurikulären Chondrozyten beimpft ist, und einem netzartigen Gerüst, das aus einem nicht-bioresorbierbaren Material besteht, und Formen des Verbundmaterials.
Die Regeneration von aurikulärem Knorpelgewebe erfordert die Bildung von großem und dickem Gewebe. Ein Formen des Gewebes zu der Form der Implantationsstelle ist ebenfalls wichtig. Das netzartige Gerüst, das aus einem nicht-bioresorbierbaren Material besteht, spielt eine Rolle bei der Einstellung der Form und der Dicke des hergestellten aurikulären Knorpelgewebes zu einer gewünschten Form und einer gewünschten Dicke.
Das nicht-bioresorbierbare Material, das das netzartige Gerüst bildet, ist nicht besonders beschränkt, solange es für den lebenden Körper nicht toxisch ist und eine adäquate Härte und Elastizität besitzt. Bevorzugte Beispiele umfassen Polypropylen, Polyethylen, Polytetrafluorethylen (PTEF) und Nylon.
Das netzartige Gerüst hat vorzugsweise eine Form, die dem zu regenerierenden aurikulären Ziel-Knorpelgewebe entspricht. In dem Fall, in dem die gesamte Aurikula regeneriert werden soll, hat beispielsweise das netzartige Gerüst vorzugsweise die Form, die der gesamten Aurikula entspricht. Alternativ kann die gesamte Aurikula in mehrere Teile aufgeteilt werden und es können mehrere netzartige Gerüste, von denen jedes die Form hat, die jedem Teil der Aurikula entspricht, gebildet werden und dann unter Bildung der gesamten Aurikula kombiniert werden.
Das Verfahren zur Bildung eines Verbundmaterials aus dem Vliesgewebe, das mit den aurikulären Chondrozyten beimpft ist, und dem netzartigen Gerüst ist nicht besonders beschränkt. Das Vliesgewebe kann zwischen zwei netzartige Gerüste angeordnet werden und das resultierende Verbundmaterial kann zu einer gewünschten Form geformt werden, oder das Vliesgewebe, das mit den aurikulären Chondrozyten beimpft ist, kann um das netzartige Gerüst, das eine gewünschte Form hat, derart gewickelt werden, dass das netzartige Gerüst mit dem Vliesgewebe umwickelt ist.
Das aurikuläre Knorpelgewebe, das durch das Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, wird in den lebenden Körper implantiert, wodurch aurikuläres Knorpelgewebe mit ausreichender Dicke und mechanischer Festigkeit regeneriert wird.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung auch aurikuläres Knorpelgewebe bereit, das umfasst: ein Vliesgewebe, das aus einem bioresorbierbaren Material, welches einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm hat, besteht, und mit aurikulären Chondrozyten beimpft ist, und ein netzartiges Gerüst, das aus einem nicht-bioresorbierbaren Material besteht.
– Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe, das eine ausreichende Dicke und ausreichende mechanische Festigkeit hat, und aurikuläres Knorpelgewebe, das durch das Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe hergestellt ist, bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme, die einen Mittelteil eines Vliesgewebes von Probe III, hergestellt in einem experimentellen Beispiel, zeigt.
2 ist eine Aufnahme, die Gewebeschnitte von Proben zur Bestätigung der Geweberegeneration fünf Wochen nach Implantation zeigt.
BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Ausführungsform der Erfindung wird detaillierter anhand des Beispiels im Folgenden beschrieben. Allerdings wird die Erfindung nicht auf das Beispiel beschränkt.
EXPERIMENTELLES BEISPIEL
(1) Herstellung eines Vliesgewebes
Ein Vliesgewebe, das durch Schmelzblasen erhalten worden war, wurde gestreckt oder ein schlauchförmiges Strickgewebe, das durch Spinnen hergestellt worden war, wurde zu einem Vliesgewebe vernadelt, sodass Vliesgewebe (Dicke: 0,13 bis 0,30 mm) erhalten wurden, die aus Polyglycolid bestanden, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,67 μm (Probe I), 0,90 μm (Probe II), 3,10 μm (Probe III), 7,00 μm (Probe IV) und 20,60 μm (Probe V) hatte.
Ein Teil der Mitte des Vliesgewebes von Probe III wurde ausgeschnitten und unter einem Elektronenmikroskop betrachtet. 1 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme des Teils (der Balken unterhalb der elektronenmikroskopischen Aufnahme stellt 30 μm dar).
Wie in 1 gezeigt ist, wurden Fasern im Fokus in der elektronenmikroskopischen Aufnahme statistisch ausgewählt und der Durchmesser jeder Faser wurde gemessen. Die Durchmesser der Fasern in verschiedenen Teilen des Gewebes wurden gemessen, bis die Gesamtzahl der gemessenen Fasern 100 war, dann wurden die gemessenen Durchmesser der 100 Fasern gemittelt. Der durchschnittliche Faserdurchmesser wurde als 3,10 μm bestimmt. Die durchschnittlichen Faserdurchmesser der anderen Proben I, II, IV und V wurden in der gleichen Weise bestimmt.
(2) Isolierung und Aussäen von bzw. Beimpfen mit aurikulären Chondrozyten
Die linke und rechte Aurikula von Beagles (weiblich, 6 bis 8 Wochen alt) wurde unter Anästhesie abgeschnitten. Die Haut, Bindegewebe und Knorpelmembranen wurden von der erhaltenen Aurikula entfernt und die Aurikula wurde jeweils in kleine Stücke geschnitten (Größe etwa 5 mm × 5 mm). Die erhaltenen Stücke wurden mit einer Kollagenaselösung (Konzentration: 0,3%) über Nacht behandelt. Anschließend wurden aurikuläre Chondrozyten isoliert. Die isolierten aurikulären Chondrozyten wurden in einem Phosphorsäurepuffer suspendiert, um eine Zellsuspension zu erhalten (1,0 × 10⁸ Zellen/mL).
(3) Verbundmaterial aus dem Vliesgewebe und einem netzartigen Gerüst
Ein blattartiges Netz (2 cm × 2 cm in der Größe und 0,34 ± 0,007 mm in der Dicke), das aus einem Polypropylen bestand, wurde bereitgestellt.
Als Probe zur Messung der Biegefestigkeit wurde ein flaches plattenförmiges Gerüst produziert, indem jedes Vliesgewebe, das mit den aurikulären Chondrozyten beimpft worden war, zwischen zwei blattartigen Netzen angeordnet wurde, um so ein Verbundmaterial zu bilden.
Inzwischen wurde als Probe zur Bestätigung der Retention der dreidimensionalen Form ein als menschliche Aurikula geformtes Gerüst produziert, indem Teile geformt wurden, welche durch das Anordnen jedes Vliesgewebes, das mit den aurikulären Chondrozyten beimpft worden war, zwischen den blattartigen Netzen gebildet worden waren, in die Form einer Aurikula geformt wurden.
(4) Implantation
Das erhaltene flache plattenförmige Gerüst und das als humane Aurikula geformte Gerüst wurden denselben Beagles (weiblich, 6 bis 8 Wochen alt) autoimplantiert. Genau beschrieben, die dorsale Region des Halses wurde unter allgemeiner Anästhesie eingeschnitten und die Gerüste wurden implantiert und zwischen Fascia-Schichten im Kopf fixiert. Die Beagles wurden fünf Wochen nach der Implantation getötet und die Proben wurden wiedergewonnen.
(Evaluierung)
(1) Messung der Biegefestigkeit
Die wiedergewonnene Probe zur Messung der Biegefestigkeit wurde unter Messung der Biegefestigkeit unter Verwendung eines Autographen gemäß dem Verfahren von Roy et al. untersucht. Genauer ausgedrückt, die Biegefestigkeit wurde in der folgenden Art gemessen: der Abstand zwischen den Greifern wurde auf 1 cm eingestellt; die Probe (Größe 20 mm × 5 mm) wurde an der Basis befestigt und eine senkrechte Platte wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,02 mm/s gesenkt.
Tabelle 1 zeigt die Resultate [Tabelle 1]

Probe durchschnittlicher Faserdurchmesser des Vliesgewebes (μm) Biegefestigkeit der Probe (N)

I 0,67 0,07

II 0,90 0,73

III 3,10 0,18

IV 7,00 0,38

V 20,60 0,31
Tabelle 1 zeigt, dass eine relativ hohe Biegefestigkeit aus der Verwendung der Vliesgewebe, die einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 μm oder mehr hatten (Probe II bis V), resultierte, wohingegen eine bemerkenswert schlechte Biegefestigkeit aus der Verwendung des Vliesgewebes, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,67 μm hatte (Probe I), resultierte.
(2) Evaluierung der Regeneration von aurikulärem Knorpelgewebe
1 zeigt Bilder des Aussehens der wiedergewonnen Proben zur Bestätigung der Retention der dreidimensionalen Form und Bilder gefärbter Querschnitte. Die Proben wurden entlang den Linien in den oberen Bildern von 1 geschnitten und die Querschnitte der Proben wurden mit Safranin 0 gefärbt.
1 zeigt, dass die Knorpelregeneration durch die Verwendung der Vliesgewebe, die einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 μm oder mehr haben (Probe II bis V) in genügender Weise induziert wird, wohingegen die Knorpelregeneration durch die Verwendung des Vliesgewebes mit einem durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,67 μm (Probe I) schlecht induziert wurde.
(Referenzexperiment)
Das selbe Verfahren wie im obigen experimentellen Beispiel wurde angewendet, um Vliesgewebe (Dicke: 0,13 bis 0,30 mm) zu erhalten, die aus Polyglcolid bestanden, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,67 μm (Probe I), 0,90 μm (Probe II), 3,10 μm (Probe III), 7,00 μm (Probe IV) und 20,60 μm (Probe V) hatte.
Die linke und rechte Aurikula von Beagles (weiblich, 6 bis 8 Wochen alt) wurde unter Anästhesie herausgeschnitten. Die Haut, Bindegewebe und Knorpelmembranen wurden jeweils von der erhaltenen Aurikula entfernt und die Aurikula wurde in kleine Stücke (mit einer Größe von etwa 5 mm × 5 mm) geschnitten. Die erhaltenen Stücke wurden mit einer Kollagenaselösung (Konzentration: 0,3%) über Nacht behandelt. Anschließend wurden aurikuläre Chondrozyten isoliert. Die isolierten aurikulären Chondrozyten wurden in einem Phosphorsäurepuffer suspendiert, um eine Zellsuspension (1,0 × 10⁸ Zellen/mL) zu erhalten.
Die erhaltene Zellsuspension (200 μL) wurde auf die Vliesgewebe, die zu einer Größe von 2 cm × 2 cm geschnitten worden waren, ausgesät bzw. in diese geimpft.
Nach dem Beimpfen wurden die Vliesgewebe in zwei Gruppen eingeteilt. Fibrinkleber (ein Gemisch aus Fibrinogen und Thrombin) wurde auf eine Gruppe gesprüht.
Die Gruppe wurde für fünf Minuten stehen gelassen, nachdem der Fibrinkleber aufgesprüht worden war. Dann wurden zwei Gruppen in eine 2,5% Glutaraldehydlösung eingetaucht, um Proben zu erhalten.
Jedes Vliesgewebe wurde in 100 μm-Stücke geschnitten, und diese Stücke wurden mit Toluidinblau gefärbt. Anschließend wurden die Chondrozyten, die in die Vliesgewebe infiltriert waren, gemessen und die Zahl der Zellen wurde gezählt.
Tabelle 2 zeigt die Resultate.
Wie in 1 gezeigt ist, war im Fall des Vliesgewebes, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,67 μm hatte (Probe I), die Zelldichte niedrig, und zwar mit Räumen zwischen den Fasern, und die Zellen waren nicht ausreichend in das Gewebe eingebaut. Im Fall des Vliesgewebes, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 20,60 μm hatte (Probe V), war die Zelldichte niedrig und die Zellen waren nur um Faserbündel verteilt, was in einer nicht-gleichmäßigen Verteilung resultierte. Die Vliesgewebe, die einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 μm (Probe II) bis 7,00 μm (Probe IV) hatten, erreichten hohe Zelldichten.
Entsprechend den Resultaten der Biegefestigkeitsmessung, die in Tabelle 1 gezeigt sind, erreichten die Vliesgewebe, die einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 μm oder mehr hatten (Proben II bis V) relativ hohe Festigkeiten.
Entsprechend den Resultaten der Zelldichte, die in Tabelle 2 gezeigt sind, erreichten die Vliesgewebe, die einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 μm (Probe II) bis 7,00 μm (Probe IV) hatten, gute Resultate.
Dies zeigt, dass die Vliesgewebe, die einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 μm (Probe II) bis 7,00 μm (Probe IV) hatten, die zur Regeneration von Knorpelgewebe eingesetzt wurden, für die Regeneration von aurikulärem Knorpel äußerst geeignet sind.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe, das ausreichende Dicke und mechanische Festigkeit hat, und aurikuläres Knorpelgewebe, das durch das Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe hergestellt wurde, bereit.

Claims

Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe, umfassend die Schritte: Beimpfen eines Vliesgewebes, das aus einem bioresorbierbaren Material, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm hat, besteht, mit aurikulären Chondrozyten und Bilden eines Verbundmaterials aus dem Vliesgewebe, das mit den aurikulären Chondrozyten beimpft ist, und einem netzartigen Gerüst, das aus einem nicht-bioresorbierbaren Material besteht, und Formen des Verbundmaterials.
Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe nach Anspruch 1, wobei das Vliesgewebe, das aus einem bioresorbierbaren Material besteht, einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 μm hat.
Verfahren zur Herstellung von aurikulärem Knorpelgewebe nach Anspruch 1 oder 2, wobei das bioresorbierbare Material Polyglycolid oder ein Lactid(D-, L-, DL-Isomer)-ε-Caprolacton-Copolymer ist.
Aurikuläres Knorpelgewebe, umfassend: ein Vliesgewebe, das aus einem bioresorbierbaren Material, das einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 0,90 bis 7,00 μm hat, besteht und mit aurikulären Chondrozyten beimpft ist, und ein netzartiges Gerüst, das aus einem nicht-bioresorbierbaren Material besteht.