-
Die
Erfindung betrifft die Verwendung von Fumarsäure und ihren Derivaten, einzeln
oder in Mischungen, zur Herstellung eines Mittels zur Prophylaxe
und/oder zur Behandlung von AGE induzierten Genomschäden. Insbesondere
betrifft die Erfindung die prophylaktische Verwendung sowie die
Behandlung von vermehrt auftretenden Genomschäden bei Niereninsuffizienz
oder Diabetes mellitus mit Fumarsäurederivaten, einzeln oder
in Mischungen.
-
Patienten
mit Nierenerkrankungen im Prädialyse-
und Dialysestadium weisen eine stark erhöhte Krebsinzidenz auf (Maissoneuvre
et al. Lancet 1999, Heidland et al., Am. J. Kidney Dis., 2000. Bei
einer Metaanalyse der Daten von mehr als 2500 Dialysepatienten in
Franken zeigte sich ein beträchtlich
erhöhter
Anteil an Nierenkarzinomen von etwa 33%. Die Gesamttumorfrequenz
in dieser Patientengruppe liegt bei etwa 20% (Stopper et al., Nephrologisches Jahresgespräch 2002;
Teschner et al., DMW 2002). Gerade die hohe Inzidenz von Tumoren
in den ersten Jahren der Dialyse, im Vergleich zu den späteren Jahren,
weist auf die Bedeutung der Prädialysephase,
als sensible Phase für
die Entstehung von Krebs durch die urämische Stoffwechselstörung hin.
Als mögliche
Ursache der Krebsentstehung könnte
eine Genomschädigung
entscheiden sein. So wurde in der Prädialysephase von Malachi et
al. (Kidney Int 1993) eine gestörte
Reparaturfähigkeit
der geschädigten
DNA festgestellt. In Untersuchungen in Würzburg deckten auch bei Langzeitdialysepatienten
eine reduzierte Reparaturkapazität
auf (Vamvakas et al., Transplant Proceedings 1996). In weiteren
Studien wurde in der Prädialysephase
und nach Einleitung der Nierenersatztherapie durch Dialyse als Ausdruck einer
DNA-Schädigung
in peripheren Lymphozyten ein vermehrtes Auftreten von Mikronuklei
(Stopper et al., Am J Kidney Dis 1999) sowie in der Einzelzellgelelektrophorese
ein gehäuftes
Vorkommen von sog. „Cometen" dokumentiert (Stopper
et al., Am. J. Kidney Dis. 2001). Als Ursache wird ein gesteigerter
oxidativer Stress in Folge erhöhten
Anfalls von Sauerstoffradikalen sowie eine reduzierte Konzentration der
zirkulierenden Antioxidantien diskutiert.
-
Die
Mitwirkung sogenannter „advanced
glycation endproducts",
die bei der Maillard-Reaktion entstehen (AGEs; nicht enzymatische
Glykolisierungsprodukte an Proteinen und Lipiden) wurde für den oxidativen
Stress ebenfalls in Betracht gezogen, da ihre Blut- und Gewebespiegel
bei eingeschränkter Nierenfunktion
und bei Diabetes mellitus deutlich erhöht sind und ihre Entstehung
durch oxidativen Stress begünstigt
wird. Ihre Anreicherung beim normal alternden Menschen ist ein allgemein
bekanntes Phänomen.
Neben anderen toxischen Faktoren scheint der, mit der Niereninsuffizienz
und der Dialyse einhergehende erhöhte AGE-Spiegel ursächlich in die
Kanzerogenese involviert zu sein.
-
In
diesem Zusammenhang ist es interessant, dass AGEs durch die Bindung
an den sogenannten RAGE-Rezeptor in der Zelle die Bildung von Sauerstoffradikalen
auslösen
können.
Die genannten Radikale sind wiederum in der Lage, die DNA zu schädigen. Von
der Vielzahl der AGEs, sind bis heute nur wenige chemisch charakterisiert
und im Serum bzw. Gewebe identifiziert worden. Dazu zählen zum
Beispiel das Nε-Carboxymethyllysin
(CML), Pentosidin (PENT), Vesperlysin, Pyrralin, Imidazolon, Glyoxallysin-Dimer
und das Methylglyoxallysin-Dimer.
-
Wechselwirkungen
der AGEs mit ihren Rezeptoren (RAGEs) und/oder Bindungsproteinen könnten die
Zellaktivierung, die verstärkte
Bildung von Sauerstoffradikalen und konsekutiv auch die Aktivierung
des NF-κB
bewirken. Die erhöhte
Bildung von Cytokinen, Wachstumsfaktoren und Adhäsionsmolekülen als auch die Zellproliferation
oder der programmierte Zelltod, abhängig vom Zelltyp, könnten ausgelöst werden.
-
Auf
Grund all dieser Effekte sind AGEs mit der Pathogenese von vielen
Komplikationen bei Diabetes (Nephropathie, Retinopathie, Neuropathie
und Atherosklerose), bei Niereninsuffizienz als auch bei der neurodegenerativen
Amyloid-Krankheit (Alzheimer Erkrankung) in Verbindung gebracht
worden.
-
Rezeptoren
für AGEs
wurden auf den Oberflächen
vielfältiger
Zellen gefunden wie zum Beispliel auf Endothelzellen, Mesangialzellen,
Monozyten Makrophagen und Neuronen. Der am besten charakterisierte
Rezeptor ist RAGE, ein Mitglied der Immunoglobulin-Superfamilie.
-
Der
Konzentration der AGEs im Serum und Gewebe wird durch eine Vielzahl
von Faktoren beeinflußt.
Dies sind unter anderem diätetische
AGE-Zufuhr, glykämische
Kontrolle (bei Diabetes), Proteinumsatz, oxidativer und carbonyl-Stress, Inflammation,
Leberfunktion, Alter sowie Tabakrauch. Einen ganz entscheidenden
Einfluß übt die Nierenfunktion aus.
Die Entfernung der AGE-Peptide
erfolgt über
die Niere, durch glomeruläre
Filtration mit nachfolgender, tubulärer Reabsorption als auch durch
ihr Ausscheiden über
den Urin.
-
Bei
Diabetikern sind die AGE-Spiegel im Serum und – noch ausgeprägter – im Gewebe
erhöht,
in Abhängigkeit
vom Ausmaß der
Nierenfunktionseinschränkung.
Mithin korreliert der Serum-AGE-Spiegel direkt mit dem Serum-Kreatinin und reziprok
mit der Kreatinin-Clearance.
-
Auf
Grund der vorgenannten Ausführungen wurde
an kultivierten LLC-PK1-Zellen
(Schweinenierentubuluszellen) der potentielle Effekt verschiedener
AGEs auf eine mögliche
Genomschädigung
geprüft.
-
Zur
Beurteilung der eingetretenen Genomschädigung diente die Einzelzellgelelektrophorese (Comet-Assay),
die in leicht modifizierter Form eingesetzt wurde (Stopper et al.,
Cancer Letters 2003). Im Vergleich zur Kontrollkultur führte die
Inkubation von 200 μg/ml
AGE-BSA innerhalb von 24 Stunden in den LLC-PK1-Zellen zu einer signifikanten Erhöhung des Genomschadens
von 11% auf 35%. Die zweistündige
Vorinkubation mit Trypsin verhinderte die AGE-induzierte Gentoxizität. Dieser
Befund deutet auf eine Beteiligung von Rezeptorpoteinen, die durch
Trypsin inaktiviert werden, hin.
-
Des
weiteren konnte mit Comet-Assay gezeigt werden, dass neben AGE-bovin
serum albumin (AGE-BSA), Carboxymethyllysin-BSA (CML-BSA) als auch
Methylglyoxal-BSA (MG-BSA) für
eine signifikante DNA-Schädigung
in den Nierentubuluszellen verantwortlich gemacht werden können.
-
Inzwischen
wurde eine Vielzahl von diätetischen
und pharmakologischen Interventionen unternommen, um die toxischen
Effekte der AGE-Akkumulation zu beeinflussen.
-
Nachdem
die renale Ausscheidung zirkulierender AGEs bei Niereninsuffizienz
deutlich herabgesetzt ist, stellt eine Beschränkung der diätetischen AGE-Zufuhr
eine potentielle Therapiemöglichkeit
dar. Andererseits besteht bei Niereninsuffizienz häufig eine
Appetitlosigkeit und Malnutrition, die durch die wohlschmeckenden
AGEs günstig
beeinflusst werden. Bei diabetischer Nephropathie ist die strikte Kontrolle
der Blutglukose von besonderer Bedeutung, um die Bildung von AGEs
gering zu halten.
-
Sehr
vielversprechende Ergebnisse wurden tierexperimentell in einer wirkstoffbezogenen
Therapie mit oraler Gabe von Aminoguanidin erzielt. Diese Substanz
ist in der Lage, die AGE-Bildung durch Trapping reaktiver Carbonylprekursoren – die durch oxidative
und nichtoxidative Mechanismen gebildet werden – zu reduzieren. Klinische
Untersuchungen beim Menschen zeigten schwerwiegende Nebenwirkungen
(Singh et al., Diabetologia 2001).
-
Da
bei diabetischer und nichtdiabetischer Niereninsuffizienz die effektivste
Therapie zur Reduktion der erhöhten
AGE-Werte im Blut und Gewebe, immer noch die Nierentransplantation
ist, wird deutlich, dass die Niere eine zentrale Bedeutung in der
Regulation des AGE Metabolismus spielt.
-
Die
Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein pharmazeutisches Mittel
zur Prophylaxe und auch zur Behandlung der, bei Niereninsuffizienz
verstärkt auftretenden,
Genomschädigung
bereitzustellen. Es ist bislang kein Wirkstoff bekannt, der die
durch AGEs induzierte Genomschädigungen
reduzieren kann.
-
Bekannt
ist, dass bestimmte Fumarsäurederivate
eine antipsoriatische sowie antimikrobielle Wirkung entfalten. Die
Behandlung von Psoriasis mit verschiedenen Fumarsäurederivaten
ist bereits aus
EP 188 749 ,
DE 2 530 372 ,
DE 2 621 214 und
EP 312 697 bekannt.
-
Die
Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie Polyarthritis, multipler
Sklerose und von Graft-versus-Host Reaktionen mit bestimmten Fumarsäurederivate
ist aus
EP 980242 B1 und
EP 1131065 B1 bekannt.
-
Aus
WO 01/51047 ist die Verwendung von Fumarsäurederivaten zur Behandlung
mitochondrialer Erkrankungen bekannt.
-
Die
Lösung
der erfindungsgemäßen Aufgabe
liegt in der Verwendung von Fumarsäure und ihren Derivaten zur
Herstellung eines Mittels zur Prophylaxe und Behandlung von Genomschäden.
-
Es
wurde in LLC-PK1-Zellen überraschend gefunden,
dass Fumarsäurederivate
die durch AGEs vermittelte Genomschädigung deutlich vermindert. Fumarsäuredimethylester
blockiert die Kern-Translokation von NF-κB und weist somit auf eine Beeinflussung
von NF-κB
bei der Signaltransduktion hin.
-
Bevorzugt
wird Fumarsäuredimethylester zur
prophylaktischen Verwendung und zur Behandlung der AGE induzierten
Genomschädigung
bei Niereninsuffizienz und/oder Diabetes mellitus eingesetzt.
-
Auch
die Verwendung von Fumarsäuremonoethylester
ist bevorzugt. Besonders bevorzugt ist die Verwendung seiner Salze,
insbesondere der Calcium-, Magnesium- und Zinksalze des Monoethylhydrogenfumarates.
-
Alternative
Fumarsäurederivate,
einzeln oder in Kombination, können
alle physiologisch verträglichen
Mono- oder Diester sowie alle physiologisch verträglichen
Salze der Fumarsäure
oder der Fumarsäuremonoester
sein.
-
Insbesondere
sind auch die mono- und bifunktionellen Fumarsäurederivate bevorzugt, die
im Körper
metabolisiert werden können.
-
Im
einzelnen kommen folgende Verbindungen in Frage:
Fumarsäure und
Fumarsäuredialkyester,
worin die Carboxylgruppen gleich oder ungleich substituiert sein
können
und unabhängig
voneinander mit einem linearen, verzweigten, cyclischen, gesättigten
oder ungesättigten
C1-6-Alkylrest substituiert sein können.
-
Fumarsäuremonoalkylester
und Salze der Fumarsäuremonoalkylester,
worin eine der beiden Carboxylgruppen mit einem linearen, verzweigten, cyclischen,
gesättigten
oder ungesättigten
C1-6-Alkylrest substituiert sein kann und die jeweils andere Carboxylgruppe
kann mit einem Proton substituiert sein oder als Carboxylat-Ion
mit ein- und mehrwertigen Kationen entsprechende Salze bilden. Mögliche Kationen
können
Alkalimetallkationen, Erdalkalimetallkationen oder pysiologisch
verträgliche Übergangsmetallkationen,
vorzugsweise Li+, Na+,
K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+ sein. In Abhängigkeit von der Wertigkeit
der Kationen, werden die Salze mit einer ihr entsprechenden Anzahl
in Form von Monocarboxylat-Ionen vorliegenden Fumarsäuremonoalkylestern
gebildet.
-
Salze
der Fumarsäure,
worin eine oder beide Carboxylgruppen als Carboxylat vorliegen und
die Fumarate mit Alkalimetallkationen, Erdalkalimetallkationen oder
pysiologisch verträglichen Übergangsmetallkationen,
vorzugsweise Li+, Na+,
K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, entsprechend ihrer Wertigkeit, Salze
bilden.
-
Die
Ester der Fumarsäurederivate
können mit
physiologisch verträglichen
C1-6-Alkylresten
gebildet werden, die linear, verzweigt, cyclisch, gesättigt oder
ungesättigt
sein können.
Insbesondere sind hier die methyl-, ethyl-, propyl-, iso-propyl-, n-butyl-, iso-butyl-,
tert-butyl-, 1-methylpropyl-, cyclopentyl-n-hexyl-, und cyclohexyl-Ester
zu nennen, die als Mono-, Diester- oder als gemischte Ester der
Fumarsäure
als auch in Form von Salzen Fumarsäuremonoester vorliegen können. Als
Esterderivate kommen nicht nur die vorgenannten in Frage, sondern
alle, die physiologisch verträglich
sowie zur Aufnahme in Zellen (Darmresoption, Hautresorption, Schleimhautresorption
etc.) resorbierbar sind.
-
Das
Vorstehende ist hinsichtlich der einzusetzenden Fumarsäurederivate,
als auch hinsichtlich der genannten Zellen nicht limitieren zu verstehen,
es soll nur einen kleinen erläuterten
Ausschnitt darlegen.
-
Die
Salze der Fumarsäurederivate
können aus
physiologisch verträglichen
Alkalimetallkationen, Erdalkalimetallkationen oder pysiologisch
verträglichen Übergangsmetallkationen
gebildet werden, insbesondere mit Li+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+.
-
Zur
Herstellung der pharmazeutischen Zubereitung können eine oder mehrere Verbindungen
aus der Gruppe der Salze der Fumarsäuremonoalkylester und der Fumarsäuredialkylester
verwendet werden.
-
Des
Weiteren können
zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen eine oder mehrere
Verbindungen aus der Gruppe der Salze der Fumarsäure, Fumarsäure, Salze der Fumarsäuremonoester, Fumarsäuremonoester
sowie der Fumarsäurediester,
die auch als gemischte Ester vorliegen können, verwendet werden.
-
Besonders
bevorzugte pharmazeutische Zubereitungen sind orale Darreichungsformen.
Weiteren Darreichungsformen können
parenterale, perkutane sowie dermale Applikationen der Derivate
der Fumarsäure
und/oder der Fumarsäure
sein, insbesondere auch Salben und/oder Sprays für kosmetische und/oder medizinische
Zwecke. Diese Zubereitungen können
zur Behandlung und/oder Prophylaxe von AGE induzierten Genomschäden verwendet werden,
unter denen u.a. auch AGE induzierte Hautschäden zu verstehen sind.
-
Die
erfindungsgemäße Anwendung
von Fumarsäurederivaten
hat sich als besonders geeignet für die prophylaktische Verwendung
und Behandlung von durch AGEs hervorgerufenen Genomschäden erwiesen.
-
Im
Folgenden wird die erfindungsgemäße Wirkung
der Fumarsäurederivate
anhand des Ergebnisses einer Comet-Assay Studie, die in 1 dargestellt ist, gezeigt.
-
1: Relative DNA Schädigung im
Comet-Assay in LLC-PK1-Zellen
nach der Behandlung mit CML-BSA oder MGO-BSA. Die LLC-PK1-Zellen wurden
mit 200 μg/ml
CML-BSA (CML) und MGO-BSA (MGO) jeweils mit und ohne Vorbehandlung
der Zellen mit Dimethylfumarsäureester
(DMF) 30 μM.
Co1 und Co2 sind Kontrollmesungen ohne weitere Behandlung.
-
Als
Kontrolle dienten unbehandelte LLC-PK1-Zellen Co1 und Co2. Die Behandlung
der LLC-PK1-Zellen mit CML und MGO ruft eine deutliche Genomschädigung hervor.
Der starke, positive Einfluss der Koinkubation von Dimethylfumarsäureester
(DMF) und CML bzw. MGO ist deutlich zu erkennen. Die Genomschädigung ist
in hohem Ausmaß ausgeblieben.
-
Die
Comet-Assay wird mit leichten Modifikationen nach Singh et al durchgeführt: Eine
0,5%ige Agaroselösung
(SEA Plaque GTG, low melting point) in PBS-CMF wird hergestellt.
Die Agarose wird vor Verwendung aufgekocht und in ein 37°C-Wasserbad gestellt.
Die zu untersuchenden Zellen werden in einem Verhältnis 1:10
(Zellsuspension: Agarose) in die 37°C warme Agaroselösung aufgenommen
und vorsichtig gemischt. Dann 45 μl
dieser Suspension auf einen Objektträger auftragen und mit einem
Deckglas (24×24mm)
eindecken. Zur Festigung der Agarose werden die Objektträger für 3–5 Minuten
bei Raumtemperatur gelagert (im Sommer im Kühlschrank). Anschließend wird
das Deckglas abgezogen und die Präparate werden für mindestens
1 Stunde in Lyselösung
(4°C) gestellt
(Kühlschrank).
(1% Triton, 10% DMSO, 89% 10 mmol/L Tris; 1% Na-Sarcosinat; 2,5
mol/L NaCl; 0,1 mol/L EDTA [pH = 10]). Nach der Lyse werden die
Präparate
zur partiellen Aufwindung für
20 min in die Elektrophoresekammer mit 4°C kaltem Alkalipuffer gelegt.
Und zwar folgendermaßen:
Horizontal auf die Plattform der Gelkammer mit der Gelschicht nach
oben und mit Elektrophorese-Puffer (6% 5mol/L NaOH; 0,5% 0,2 mol/L EDTA;
H2O bidest.; pH = 10). Um ein Anfärben der DNA
zu ermöglichen,
werden die Objektträger
in eine Schale mit 0,4 M TRIS-Puffer (pH = 7.5) überführt und dort für 10 min
belassen. Anschließend
können sie
kurz abtropfen und werden dann mit 20 μl Ethidiumbromid (20 μg/ml) und
einem 24×24
Deckglas eingedeckt. Lagerung der Objektträger bis zur Auswertung in einer
feuchten Kammer bei 4°C.
Zur Analyse der Zellen wurde ein Fluoreszenz-Mikroskop mit 500-facher Vergrößerung und
computergestützter Bildauswertung
verwendet. Es wurden Bilder mit wenigstens 50 Zellen (je 25 Zellen
von zwei Objektträgern
mit dem NJH Image 1.54 (National Institute of Health, Bethesda,
MD)) analysiert.