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Verfahren zur Herstellung einer zur intravenösen Applikation geeigneten
stabilen Klupeinmethylesterhydrochlorid-Lösung Die Erfindung bezieht sich auf ein
Verfahren zur Herstellung einer zur intravenösen Applikation geeigneten Klupienmethylesterhydrochlorid-Lösung
Protamine erreichen wachsende Bedeutung in der Therapie und experimentalen Physiologie
als ein Mittel, mit welchem die antikoagulierende Wirkung des Heparins antagonisiert
werden kann. Eines von den wichtigsten Protaminen ist das Klupein, das bisher in
Form seines Sulfates verwendet wurde.
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Elupein wird aus der Milch der Heringe gewonnen. Dafür sind zwei
Methoden bekannt. Sie ergeben als Endprodukt entweder Klupeinsulfat oder Klupeinmethylesterhydrochlorid.
Zu therapeutischen und biologischen Zwecken wurde bisher ausschließlich das Klupeinsulfat
verwendet.
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Die älteren Methoden der Klupeindarstellung gehen stets von der klassischen
Arbeit von A. Kossel aus (Zeistchrift Physiol. Chem., 25. S. 165 [1898]). Das Protamin
wird dabei in Form seines unlöslichen Piltrats isoliert, das nachträglich zu dem
entsprechenden Methylesterhydrochlorid oder Sulfat umgewandelt wird. Das neuere
Verfahren von R. Block u. a. (Proc.
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Soc. Exp. Biol. Med., 70, S. 494 [1949])~ bietet als Endprodukt ebenfalls
Klupeinsulfat, während als Zwischenprodukt bei der Isolierung Klupeinmetaphosphat
erscheint.
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Das ältere Verfahren wurde erfolgreich durch eine Reihe von Autoren
zur Darstellung von hochgereinigten Präparaten für Studien der chemischen Konstitution
der Protamine benutzt. Das neuere Blocksche Verfahren wurde angepaßt und technologisch
zur Herstellung von Klupeinsulfat bei der Protamin-Zinkinsulinfabrikation ausgearbeitet.
Durch mehrfach wiederholte Versuche wurde jedoch festgestellt, daß keine von beiden
Methoden zur Darstellung von intravenös anzuwendenden Protaminpräparaten geeignet
ist. und zwar aus folgenden Gründen Alle modifizierten. auf der Methode von Kossel
beruhenden Verfahren fällen und reinigen das Klupein in Form des Pikrats. Obzwar
nachträglich das Pikrat zersetzt und die Pikrinsäure entfernt wird, haften Reste
von Pikrinsäure hartnäckig auf dem frei gemachten Klupein und werden in die weiteren
Stufen des Präparations- und Reinigungsprozesses mit gerissen. Die auf diese leise
bereiteten Präparate können von der Pikrinsäure bloß durch wiederholte Umfällung
befreit werden. wodurch die Ausbeute aber stark herabgesetzt wird. Die nicht vollständig
gereinigten Präparate sind zur intravenösen Anwen dung ungeeignet, da bereits eine
sehr geringe Menge der giftigen Pikrinsäure sich durch gelbe Verfärbung, toxische
Wirkungen und Pyrogenität verrät.
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Das Blcksche Verfahren vermeidet zwar die Ver-
wendung der Pikrinsäure.
es ergibt jedoch als Endprodukt Klupeinsulfat, das nur in sauren Lösungen mit PH
unter 4 bis 5 genügend löslich ist. Bei dieser Eigenschaft des Klupeinsulfats ist
die an ein Injektionspräparat zu stellende Forderung nicht erfüllt. daß der optimale
p-Wert etwa 7 und die niedrigste Grenze 6 betragen soll. Bei Versuchen mit sauren
Lösungen wurden bei Kaninchen Störungen beobachtet, welche die intravenöse Anwendung
ausschließen.
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Es wurde nun gefunden. daß das Klupeinmethylesterhydrochlorid als
ein die antikoagul ierende Wirkung des Heparins neutralisierendes Mittel weit hesser
als das Klupeinsulfat geeignet ist. Es ist in der physiologischen Lösung bei PH
6 bis 7 besser löslich und besitzt auch in Form von Injektionslösungen höhere Stab,
tät. Klupeinmethylesterhydrochlori d hat weder toxische noch pyrogene Eigenschaften.
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Die Wasserlöslichkeit von Klupeinmethylesterhydrochlorid ist bei
pH 6 bis 7 stets über 1,3%. wogegen die Wasserlöslichkeit des Klupeinsulfats. das
nach Block dargestellt wurde. ziemlich schwankt und nur sehr selten einen Wert um
0,8 i10 erreicht. Dies ist wahrscheinlich durch die Herstellungsweise verursacht:
Das Überführen des Klupeinmetaphosphats in das Sulfat wird durch Kochen mit überschüssiger
normaler Schwefelsäure durchgeführt, und zwar bis zum Erhalten einer negativen Reaktion
auf das Metaphosphat. was ungefähr 30 Minuten erfordert. Dieser
verhältnismäßig
brutale Eingriff führt teilweise zur Bildung von Zersetzungsprodukten bzw. zu einer
chemischen Einwirkung auf die Substanz des Klupeins, was sich unter anderen auch
durch verminderte Wasserlöslichkeit äußert. Diese Einwirkung wechselt je nach den
Reaktionsbedingungen, z. B. mit der Größe der verarbeiteten Charge. Durchschnittlich
ist das Klupeinmethylesterhydrochlorid wenigstens doppelt so löslich als das in
bekannter Weise dargestellte Klupeinsulfat.
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Die ein Verfahren zur Herstellung einer zur intravenösen Applikation
geeigneten Klupeinmethylesterhydrochlori d-liösun'g betreffende Erfindung besteht
darin, daß man in an sich bekannter Weise gewonnenes Klupeinmetaphosphat nach bekannter
Methode in Gegenwart von wasserfreiem Methanol unter Einleiten von trockenem Chlorwasserstoff
in Klupeinmethylesterhydrochlorid überführt, das Reaktionsprodukt aus der methanolischen
Lösung durch Abkühlen auf unter 100 abtrennt, trocknet, mit wasserfreiem Diäthyläther
wäscht, in Wasser löst, die Lösung auf Pn 6 einstellt und in üblicher Weise sterilisiert.
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Dadurch werden die Nachteile der älteren Verfahren beseitigt. Durch
ein einfaches Verfahren wird in einer guten Ausbeute ein Präparat geschaffen, das
ohne weitere Reinigung zur intravenösen Anwendung vorzüglich geeignet ist.
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Die Verwendung der Pikrinsäure wird vollständig vermieden, und das
Klupeinmethylesterhydrochlorid wird beinahe quantitativ durch Abkühlen gewonnen,
und zwar in derart reinem Zustande, daß sich die sonst unvermedidliche Reinigung
völlig erübrigt.
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Ausführungsbeispiel Klupeinmetaphosphat wird in an sich bekannter
Weise durch Extrahieren von frischer oder gefrorener Fischmilch der Heringe mit
verdünnter Essig oder Zitronensäure, Abtrennen des Nukleoprotamins auf der Zentrifuge,
Zersetzen desselben mit verdünnter Mineralsäure, Abtrennen der Ballaststoffe in
alkalischem Gebiet und Überführung des Klupeins in sein Metaphosphat dargestellt.
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100 g von dem so gewonnenen Klupeinmetaphosphat werden durch wiederholtes
Zerreiben mit absolutem Methanol in einer Reibschale von Wasser befreit. Das trockene
pulverförmige Präparat wird in 2 1 absolutem Methanol in einem Kolben suspendiert,
der mit einem
Rührer versehen. und mit einem Chlorkalziumröhrchen geschlossen ist.
Dann wird ein Strom von trockenen Chlorwasserstoff unter starkem Rühren und äußerem
Kühlen mit Eis 2 Stunden eingeleitet. Dabei darf die Temperatur 100 nicht übersteigen.
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Das Klupeinmetaphosphat wird im Laufe der Einleitung von Chlorwasserstoff
nicht vollständig gelöst, sondern löst sich allmählich, wobei das methylesterhydrochlorid
ebenfalls allmählich aus der Lösung ausfällt. Dieser Vorgang tritt in Erscheinung
durch langsames Umwandeln von verhältnismäßig schweren Partikeln des Metapho&phats
in sehr feine und leichte Suspensionen des Methylesterhydrochlorids, die zur Oberfläche
aufschwimmen.
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Die Reaktion ist beendet, wenn die ganze Menge des Protainins in
der festen Phase ihren Charakter in der beschriebenen Weise verändert hat, was ungefähr
2 Stunden dauert. Das vollständige Ausscheiden des Klupeinmethylesterhydrochlorids
aus der Lösung wird durch 2stündiges Stehen in einem Eisschrank hei 0 bis G erreicht.
Das ausgeschiedene Produkt wird abgesaugt, mit wasserfreiem Äther gewaschen und
unter Luftleere von Äther befreit. Die Ausbeute beträgt 95 bis 98o/o, auf das verbrauchte
Metaphosphat bezogen. Das gewonnene reinweiße pulverförmige Präparat wird in redestilliertem
Wasser gelöst, die saure Reaktion der Lösung mit verdünnter Natronlauge auf PEL
6, 0 eingestellt und die Lösung durch Erwärmen in einem Autoklav sterilisiert. Die
so erhaltene Lösung kann zur intravenösen Anwendung benutzt werden.