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Die Erfindung betrifft den Betrieb eines energie- und raumwinkelfokussierenden Reflektors für Flugzeitmassenspektrometer mit gepulster Ionenbeschleunigung in ein Flugzeitrohr, z.B. aus einer Quelle der Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI).
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Die Erfindung hat zum Ziel, hohe Massenauflösungen über weite Massenbereiche bis zu hohen Massen wie z.B. bis zu etwa zwölf Kilodalton (ein Dalton entspricht einer atomaren Masseneinheit u) dadurch zu erzeugen, dass mindestens eine Spannung an einer der Blenden des Reflektors während der Spektrenaufnahme einer geeigneten Zeitfunktion folgend verändert wird, so dass die verschiedenen Ionen, die nacheinander den Reflektor durchfliegen, den jeweils für ihre optimale Fokussierung günstigsten Reflektoreinstellungen ausgesetzt sind.
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Stand der Technik
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Durch die Arbeiten von B. A. Mamyrin, V. I. Karatzev und D. V. Shmikk (
US 4,072,862 A ) sind zweistufige Reflektoren mit zwei Gittern zwischen zwei Feldstufen bekannt. Diese erlauben eine geschwindigkeitsfokussierende Reflektion von Ionen mit einstellbarer Fokuslänge (heute meist „Energiefokussierung“ genannt). Dabei wirkt ein erstes, starkes Gegenfeld abbremsend auf die Ionen, während ein zweites, gut homogenes Feld die Ionen reflektiert und dabei die Geschwindigkeitsfokussierung bewirkt, indem Ionen größerer Geschwindigkeit tiefer eindringen und somit unter Zeitverlust eine längere Wegstrecke durchlaufen, die ihre höhere Geschwindigkeit kompensiert. Durch die Einstellung des Feldstärkenverhältnisses von Brems- und Reflektionsfeld lässt sich die Fokuslänge der Energiefokussierung einstellen. Dieser Reflektor zeigt keine Raumwinkelfokussierung. Statt zweistufiger Reflektoren können auch einstufige Reflektoren mit nur einem Gitter im Eingangsbereich verwendet werden; diese haben eine feste, relativ kurze Fokuslänge für die Energiefokussierung und nehmen einen großen Teil der Gesamtflugstrecke des Flugzeitmassenspektrometers ein.
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Dieser Mamyrin-Reflektor kann jedoch keine Bruchstück-Ionen (Fragment-Ionen) energiefokussierend reflektieren, weil er nur Ionen der Ausgangsenergie, die alle gleiche Eindringtiefe besitzen, fokussierend reflektiert. Um scharfe Massenspektren von Bruchstück-Ionen zu erhalten, haben daher Weinkauf et al. ein Verfahren entwickelt, die Reflektor-Spannung zwischen verschiedenen aufeinander folgenden Aufnahmen eines Fragment-Ionen-Spektrums so zu verändern, dass die Fragment-Ionen, die eine zu ihrer Masse proportionale kinetische Energie besitzen, alle die gleiche Eindringtiefe in den Reflektor besitzen und somit über einen Spektrenaufnahme-Zyklus alle gut fokussiert werden („Laser Tandem Mass Spectrometry in a Time of Flight Instrument", R. Weinkauf, K. Walter, C. Weickhardt, U. Boesl, E. W. Schlag; Z. Naturforschg. 44a, 1219-1225; 1989). Bei diesem Ansatz werden die unterschiedlichen Spektren, die alle separat mit leicht unterschiedlichen Reflektor-Spannungen aufgenommen wurden und daher alle leicht zueinander verschobene, wohlfokussierte Massenbereiche aufweisen, anschließend mathematisch so zusammengefügt, dass lediglich die Bereiche optimaler Auflösung in dem Verrechnungsspektrum berücksichtigt werden. Dieses Verfahren ist wegen der Notwendigkeit, viele einzelne Spektren mit leicht variierten Spannungseinstellungen aufzunehmen, sehr zeitaufwändig und daher unhandlich. Es bedarf außerdem eines besonderen Verfahrens zur Erzeugung der Fragment-Ionen, das mit zwei Lasersystemen arbeitet. Es ist daher nie zu einem Routine-Verfahren geworden.
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Gemäß
DE 44 42 348 A1 (entsprechend
US 5,739,529 A und
GB 2 295 720 B ) ist bei einem Flugzeit-Massenspektrometer mit einem nach der Ionenquelle und vor dem Ionendetektor angeordneten Ionenreflektor zur Kompensation unterschiedlicher Anfangsenergien von Ionen gleicher Masse auf der Ionenlaufstrecke in oder nach dem Ionenreflektor mindestens eine Elektrode vorgesehen, an welche eine gepulste Hochspannung (Steigung 1 kV pro 10 Nanosekunden) derart angelegt ist, dass in einem vorgegebenen engen Bereich von Ionenmassen, z.B. über nicht mehr als zehn Masseneinheiten, für Ionen gleicher Masse Laufzeitfehler aufgrund unterschiedlicher Entstehungsorte oder -zeiten der Ionen in der Ionenquelle am Ionendetektor kompensiert werden. Dadurch können neben einer Energiekompensation gleichzeitig auch Laufzeitfehler der untersuchten Ionen kompensiert werden.
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Die Arbeiten von R. Frey und E. W. Schlag (
EP 0 208 894 B1 ;
US 4,731,532 A ) haben gitterfreie, zweistufige Reflektoren bekannt gemacht, die neben einer Geschwindigkeitsfokussierung auch eine Raumwinkelfokussierung besitzen. Sie bedürfen einer punktförmigen Quelle für die Ionen, wie sie beispielsweise durch eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) näherungsweise gegeben ist. Der gitterfreie Reflektor wird aus einer Anzahl von metallischen Ringblenden und einer abschließenden Plattenelektrode aufgebaut. An den ersten zwei oder drei Ringblenden wird durch Anlegen einer hohen Potentialdifferenz ein hohes Bremsfeld aufgebaut. Die durch die Blendenöffnungen herausquellenden Äquipotentiallinien bilden die raumwinkelfokussierende Ionenlinse. Die weiteren Ringblenden haben gleiche Innendurchmesser, gleiche Abstände und gleiche Potentialdifferenzen: sie bilden ein homogenes Reflektionsfeld auf, das durch verschieden große Eindringtiefen (und daher verschieden lange Flugstrecken) für Ionen verschiedener Energien die Energiefokussierung erzeugt. Die Fokuslänge der Energiefokussierung wird wie beim Gitterreflektor durch das Verhältnis der Feldstärken in Bremsfeld und Reflektionsfeld eingestellt. Damit ist aber eine starr gekoppelte Fokuseinstellung der Raumwinkelfokussierung verbunden, deren Fokuslänge normalerweise nicht mit der Fokuslänge der Energiefokussierung übereinstimmt. Die Fokuslängen der Geschwindigkeitsfokussierung und die der Raumwinkelfokussierung können nicht unabhängig voneinander eingestellt werden; es gibt nur eine bestimmte geometrische Anordnung, die einen von einer Quelle stammenden, leicht divergenten Ionenstrahl sowohl geschwindigkeitsfokussierend wie auch raumwinkelfokussierend auf einen Ionendetektor abbildet.
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In der Patentschrift
DE 196 38 577 C1 („Simultane Fokussierung aller Massen in Flugzeitmassenspektrometern“; J. Franzen, 1996) wird dargelegt, wie in einer Ionenquelle mit Ionisierung durch matrixunterstütze Laserdesorption (MALDI) eine Beschleunigungsspannung in der Ionenquelle, die wie üblich nach einer Verzögerungszeit eingeschaltet, dann aber während der weiteren Beschleunigung kontinuierlich verändert wird, zu einer Massenauflösung führt, die nicht nur einen hohen Auflösungswert bei einer Masse, sondern eine relativ hohe Auflösung über einen breiteren Massenbereich, beispielsweise zwei Kilodalton, erzeugt. Die Technik ist unter dem Namen „Pan“ weithin bekannt geworden. Breite und Schwerpunkt der Massenauflösung als Funktion der Masse können durch eine Zeitkonstante τ für die Veränderungsfunktion verändert und über den Massenbereich verschoben werden.
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In der Patentschrift
US 6,740,872 B1 („Space Angle Focusing Reflector for Time-of-Flight Mass Spectrometers“, A. Holle, 2002) wird beschrieben, wie in einem Reflektor eine zusätzliche Fokussierung erzeugt werden kann, indem im hinteren Teil des Reflektors, insbesondere am Umkehrpunkt der Ionen, eine statische Feldinhomogenität mit schwach gekrümmten Äquipotentialflächen eingeführt wird. Sie kann durch eine eigens zugeführte Spannung U
3 an einer der letzten Blenden des Reflektors erzeugt und eingestellt werden (vorzugsweise an der drittletzten Blende). Für gitterlose Reflektoren, die bereits eine Raumwinkelfokussierung mitbringen, kann die Fokuslänge der Raumwinkelfokussierung durch diese Vorgehensweise verändert, an die Fokuslänge der Geschwindigkeitsfokussierung angepasst und auf den Detektor gerichtet werden. Auch durch diese Maßnahme erhöht sich das Massenauflösungsvermögen.
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Eine besondere Betriebsart einer MALDI-Ionenquelle nennt sich „In-Source-Decay“ (ISD; „Zerfall innerhalb der Quelle“). Sie arbeitet mit relativ intensiven, aber sehr kurzen Laserpulsen, in der Regel unter drei Nanosekunden. Dabei entstehen aus den Proben, die Proteinmoleküle enthalten, noch vor Einsatz der Beschleunigung Bruchstück-Ionen, bei denen in einem Proteinmolekül jeweils eine Aminosäure an einer charakteristischen Stelle gespalten wird, wobei statistisch über alle Proteinmoleküle alle Aminosäuren an den Spaltungen beteiligt sind. Es entsteht somit aus einer Probe eines reinen Proteins (oder eines reinen enzymatisch hergestellten Protein-Verdau-Fragments) ein Massenspektrum mit zwei Leitern an Bruchstückmassen, einmal vom N-Terminus her und einmal vom C-Terminus her, an denen die Sequenz der Aminosäuren dieses Proteins abgelesen werden kann (siehe dazu beispielsweise die Patentschrift
US 8,581,179 B2 „Protein Sequencing with MALDI Mass Spectrometry“; J. Franzen, 2010). Für einen ökonomischen Betrieb ist es aber notwendig, das Massenspektrum über einen weiten Bereich bis zu etwa 12 Kilodalton (etwa 100 Aminosäuren) mit genügender Empfindlichkeit und genügendem Massenauflösungsvermögen messen zu können. Dann können Proteine oder Protein-Verdau-Fragmente bis zu einer maximalen Länge von etwa 200 Aminosäuren in einem Schritt sequenziert werden. Da die Herstellung der vormals verwendeten Edman-Sequenzierer eingestellt wurde, verspricht die Massenspektrometrie einen bequemen und weit schneller arbeitenden Ersatz für diese Technologie.
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Die Patentveröffentlichung
WO 03/103008 A1 offenbart ein Flugzeit-Massenspektrometer mit einer Ionenquelle, einem evakuierten Rohr in der Nähe der Ionenquelle, das zum Empfang von Ionen von der Ionenquelle geeignet ist, und einem Detektor, der an einem Ende des evakuierten Rohrs gegenüber einem Ende in der Nähe der Ionenquelle angeordnet ist. Die Ionenquelle ist so konstruiert, dass sie ein elektrisches Feld erzeugt, das sich nichtlinear als Funktion der Position entlang eines Weges von der Ionenquelle zum Detektor ändert, und ist ferner so konstruiert, dass sie ein elektrisches Feld erzeugt, das sich in Abhängigkeit von der Zeit ändert, wobei das elektrische Feld dazu dient, Ionen von der Ionenquelle zum Detektor zu beschleunigen.
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Für diese Anwendung zur Sequenzierung von Proteinen, aber auch für viele andere Anwendungen, besteht ein Bedarf für eine Betriebsart eines Reflektor-Flugzeitmassenspektrometers, die über einen weiten Massenbereich eine verbesserte, relativ hohe Massenauflösung zeigt. Mit einer höheren Massenauflösung ist immer auch eine bessere Empfindlichkeit verbunden, da die Massensignale schmaler und dadurch höher werden und ein stark verbessertes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zeigen.
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Beschreibung der Erfindung
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Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist im angehängten Anspruch 1 definiert. Eine erfindungsgemäße Vorrichtung ist im angehängten Anspruch 11 definiert. Vorteilhafte Ausführungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in den jeweilig nachgeordneten abhängigen Ansprüchen wiedergegeben.
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Die Erfindung zielt darauf ab, hohe Massenauflösungen bis hin zu hohen Massen im Bereich über acht Kilodalton dadurch zu erzeugen, dass mindestens eine der Betriebsspannungen an den Blenden des Reflektors, beispielsweise die Fokussierungsspannung U3 an einer der hinteren Blenden des Reflektors, während einer Aufnahme eines Flugzeitspektrums mit einer geeignet gewählten Funktion verändert wird. Die Aufnahme eines Flugzeitspektrums vom schnellsten bis zum langsamsten Ion kann im Mikrosekundenbereich liegen, beispielsweise etwa 100 Mikrosekunden dauern. Für die dynamische Spannungsversorgung der einen oder mehreren Reflektorblenden können eine oder mehrere Spannungsquellen verwendet werden, welche die Spannungen auf einer solchen Zeitskala durchstimmen. Die erforderliche Änderung von U3 beträgt weniger als 200 Volt. Es versteht sich, dass die Spannungsänderungen bei wenigstens teilweiser Beschaltung der Reflektorblenden über eine Widerstandskette auch die an den benachbarten Blenden anliegenden Spannungen (wenngleich abgeschwächt) beeinflussen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann die Änderungsrate der mindestens einen Betriebsspannung an einer der Blenden des Reflektors deutlich weniger als 100 Volt pro Nanosekunde betragen, z.B. weniger als zehn Volt pro Nanosekunde und/oder im Bereich von wenigen Volt pro Mikrosekunde liegen.
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Es kann zusätzlich zur Fokussierungsspannung U3 auch die Bremsspannung U2 während der Spektrenaufnahme zeitlich verändert werden. Es ist auch möglich, Betriebsspannungen an weiteren inneren Blenden des Reflektors während der Spektrenaufnahme zu verändern, um für jedes Ion oder Fragment-Ion beim Durchflug des Reflektors die jeweils für eine optimale Fokussierung geeigneten Reflektionsbedingungen zu schaffen.
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Simulationen haben gezeigt, dass auch die Einstellung der Startbereichsparameter der Ionen angepasst werden kann, um ein verbessertes Ergebnis zu erzielen. Vorzugsweise wird die Zeitkonstante τ, die die Änderung der Beschleunigungsspannung nach verzögertem Einschalten der Beschleunigung im Startbereich (z.B. in der MALDI-Quelle) beschreibt, entsprechend günstig gewählt. Sie kann in Kombination mit dem dynamischen Reflektorbetrieb insbesondere verkürzt werden.
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Die optimalen Zeitfunktionen für die Änderungen der Spannungen, z. B. U3 = f(t), können in Simulationen bestimmt werden. Simulationen haben gezeigt, dass selbst oberhalb einer Masse m = 8 Kilodalton Massenauflösungen von R = m/Δm > 100 000 erreicht werden können (Δm stellt die Halbwertsbreite des Ionensignals dar). Auflösung und Empfindlichkeit können in diesem hohen Massenbereich damit bis zu zehnmal höher als bei bisher bekanntem statischen Reflektorbetrieb sein. Dies ermöglicht den ökonomisch rentablen Einsatz von Reflektor-Flugzeitmassenspektrometern als Protein-Sequenzierern, was eine Messung des Massenspektrums über einen weiten Bereich bis zu etwa 12 Kilodalton (etwa 100 Aminosäuren) mit genügender Empfindlichkeit und genügendem Massenauflösungsvermögen voraussetzt; dabei vorzugsweise deutlich mehr als 1000 Dalton abdeckend, beispielsweise 2000 Dalton, 4000 Dalton, 6000 Dalton oder mehr. Auf diese Weise lassen sich Proteine oder Protein-Verdau-Fragmente bis zu einer Länge von etwa 200 Aminosäuren in einem Schritt sequenzieren.
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Es bieten sich aber für ein Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer mit hoher Massenauflösung bis in den hohen Massenbereich hinein auch viele andere Anwendungsmöglichkeiten an. Es besteht durchaus ein hoher Bedarf an gitterfreien Reflektor-Massenspektrometern, die im Massenbereich bis zu zehn oder zwölf Kilodalton eine Präzision der Massenbestimmung von etwa einem Millionstel der Masse oder mehr besitzen. Das lässt sich mit dieser Erfindung erreichen.
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Abbildungen
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Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf die folgenden Abbildungen verwiesen. Die Elemente in den Abbildungen sind nicht unbedingt maßstabsgetreu dargestellt, sondern sollen in erster Linie die Prinzipien der Erfindung (größtenteils schematisch) veranschaulichen.
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zeigt schematisch ein einfaches MALDI-Flugzeitmassenspektrometer, dessen Reflektor (10) für diese Erfindung verwendet werden kann. Eine größere Anzahl von Proben oder auch ein Gewebeschnitt für die Bildgebung befinden sich auf der Probenträgerplatte (1) gegenüber den Beschleunigungselektroden (2) und (3) und die Proben können durch Bewegung der Probenträgerplatte (1) in den Fokus des Laserlichtpulsstrahles (4) des Lasers (5) hineingeführt und dort ionisiert werden. Die im Laserplasma erzeugten Ionen werden nach einer Verzögerungszeit durch die Beschleunigungselektroden (2) und (3) zu einem Ionenstrahl (6) beschleunigt, der den Ionenselektor (7) passieren muss und dessen leichte Ionen (hauptsächlich Ionen der Matrixsubstanz) unterhalb einer Flugzeitgrenze als Strahl (8) abgelenkt und aussortiert werden können. Der restliche Ionenstrahl (9) schwererer Analyt-Ionen wird dann vom Reflektor (10) auf den Sekundärelektronen-Verstärker (11) reflektiert. Der Ausgangsstrom des Sekundärelektronen-Verstärkers wird dem Transientenrekorder (12) zugeführt und dort in eine Serie digitaler Messwerte gewandelt.
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gibt ein Beispiel eines gitterlosen Reflektors, entsprechend dem Reflektor (10) aus , mit den Äquipotentialflächen seines elektrischen Feldes wieder. Durch das hohe Bremspotential zwischen U1 und U2 wird eine Ionenlinse erzeugt, die eine erste Raumwinkelfokussierung bewirkt. Das Potential U3 krümmt die Äquipotentialflächen ein wenig im Bereich des Umkehrpunktes, wodurch eine zweite, einstellbare Fokussierung erreicht wird, mit der die Fokuslängen der Energiefokussierung und die der Raumwinkelfokussierung aufeinander abgestimmt und auf den Detektor gerichtet werden können.
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In sind Simulationsergebnisse für die Massenauflösung als Funktion der Ionenmasse für verschiedene Einstellungen dargestellt. Im derzeitigen statischen Reflektorbetrieb (Kurve 21) wird zwar im Bereich von etwa m = 1300 bis m = 3000 Dalton eine Auflösung von R > 150 000 erreicht (Maximum ~ 250 000), bei etwa m = 8500 Dalton aber nur noch eine Auflösung von etwa R = 8000, so dass beispielsweise Isotope nicht mehr aufgelöst werden können. Wird die Spannung U3 erfindungsgemäß während der Spektrenaufnahme geeignet verändert, so kann in diesem Bereich die Massenauflösung auf R = 70 000 verbessert werden (Kurve 20).
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In ist zusätzlich auch noch die Kennzahl τ für die Veränderung der Beschleunigungsspannung im Startbereich (z.B. in der Ionenquelle) von τ = 700 Nanosekunden auf τ = 300 Nanosekunden geändert, so dass im gesamten Massenbereich bis über Masse m = 8000 Dalton hinaus eine Massenauflösung von weit über R = 100 000 erreicht wird (Kurve 23). Die Auflösungen im bisherigen statischen Reflektorbetrieb werden als Kurve 22 wiedergegeben. Andere Kombinationen von τ und U3 = f(t) oder die Einfügung weiterer Spannungsänderungen mögen noch höhere Massenauflösungen über noch breitere Massenbereiche ergeben und lassen sich ohne übermäßigen Aufwand per Simulation oder experimentell ermitteln.
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gibt geeignete Funktionen U3 = f(t) für die Veränderung der Spannung U3 wieder, die in Simulationen gefunden wurden. Kurve 25 in Verbindung mit τ = 700 Nanosekunden erzeugt die Kurve 20 in ; Kurve 24 mit τ = 300 Nanosekunden erzeugt die Kurve 23 in . Die notwendigen Spannungsänderungen während der Spektrenaufnahme belaufen sich in diesen Beispielen auf weniger als 200 Volt, was trotz der kurzen Zeitspanne elektronisch ohne weiteres umsetzbar ist.
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Ausführungsformen
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Während die Erfindung anhand einer Anzahl von Ausführungsformen dargestellt und erläutert wurde, werden Fachleute auf dem Gebiet anerkennen, dass verschiedene Änderungen in Form und Detail daran vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der in den beigefügten Patentansprüchen definierten technischen Lehre abzuweichen.
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Der Betrieb eines MALDI-Flugzeitmassenspektrometers kann dem groben Schema in entnommen werden. Eine größere Anzahl von Proben oder auch ein Gewebeschnitt für die Bildgebung befindet sich auf der Probenträgerplatte (1) gegenüber den Beschleunigungselektroden (2) und (3), die hier als Gitter gezeichnet sind, in realen Ausführungen aber in Form von Lochblenden verwendet werden. Die Proben bestehen größtenteils aus Kristallen einer Matrixsubstanz, mit eingeschlossenen Analytmolekülen in Konzentrationen von einigen Hundertstel Prozent. Die Proben können durch Bewegung der Probenträgerplatte (1) in den Fokus des Laserlichtpulsstrahles (4) des Lasers (5) hineingeführt werden.
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Eine kleine Menge an der Oberfläche der Probe wird durch den Laserlichtpuls in ein Plasma umgewandelt, das unter hohem Druck steht und hohe Temperatur aufweist. Das Plasma hat zunächst das Volumen des Festkörpers, beginnt aber sofort, sich auszudehnen und dabei adiabatisch abzukühlen. Im Plasma werden viele Analytmoleküle durch Ionen der Matrixsubstanz mittels Protonierung ionisiert. Nach etwa 500 bis 1000 Nanosekunden hat sich das Plasma auf einen Durchmesser von etwa 0,5 bis 1,0 Millimeter ausgedehnt, und die äußeren Teilchen haben den Kontakt zueinander verloren. Es findet jetzt keine weitere Ionisierung und keine adiabatische Abkühlung mehr statt. Die Teilchen des Plasmas, also auch die Ionen, zeigen eine regelmäßige Geschwindigkeitsverteilung: die Geschwindigkeit der Teilchen im Plasma ist umso größer, je weiter sie von der Probenoberfläche entfernt sind. Das kann in Simulationen nachgebildet werden.
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Die Ionen werden durch die nach einer Verzögerungszeit eingeschaltete Beschleunigungsspannung an den Elektroden (2) und (3) zu einem Ionenstrahl (6) beschleunigt. Ein Ionenselektor (7) erlaubt es, die vielen Matrix-Ionen leichter Massen auszublenden, um den Detektor (11) vor Überlastung und Verschmutzung zu bewahren. Der restliche Ionenstrahl (9) schwererer Ionen wird dann vom Reflektor (10) auf den flächigen Detektor (11) reflektiert und dabei sowohl nach Energie der Ionen wie auch nach Raumwinkel fokussiert. Der Detektor kann beispielsweise als Sekundärelektronen-Verstärker ausgebildet sein. Der Ausgangsstrom des Sekundärelektronen-Verstärkers wird dem Transientenrekorder (12) zugeführt und dort in eine Serie digitaler Messwerte gewandelt, die das Flugzeitspektrum und nach entsprechender Kalibration und Umrechnung das Massenspektrum repräsentieren.
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Um die langen Flugstrecken (6, 9) auf Grundpotential zu halten und auch den Detektor (11) auf Grundpotential betreiben zu können, ist es üblich, sowohl die Spannungen der Probenträgerplatte (1) wie auch die Spannung am Ende des Reflektors (10) auf hohen Spannungen in der Größenordnung von 20 Kilovolt zu halten. Damit befindet sich auch die Fokussierungsspannung U3 im Reflektor (10) auf hohem Potential. Eine Steuerung dieser Spannung ist daher nicht ganz einfach, aber heute technisch ohne weiteres möglich. zeigt den Reflektor mit seinen Blenden und den sich aus den angelegten Spannungen ergebenden Äquipotentialflächen des elektrischen Feldes. Man sieht deutlich die Linsenwirkung eingangs des Reflektors, weniger deutlich die Fokussierungswirkung im hinteren Teil des Reflektors. Das liegt daran, dass es im hinteren Teil des Reflektors nur geringer Abweichungen der Äquipotentialflächen von ebenen Flächen bedarf, um wirksam zu werden, weil hier die Ionen nahe am Umkehrpunkt kaum kinetische Energie besitzen und daher sehr leicht zu beeinflussen sind.
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Wie schon zuvor erläutert weist ein gitterfreier Reflektor vorzugsweise eine Anzahl von metallischen Ringblenden und eine abschließende Plattenelektrode auf, wie in schematisch angedeutet. An den ersten zwei oder drei Ringblenden kann durch Anlegen einer hohen Potentialdifferenz ein hohes Bremsfeld aufgebaut werden. Die durch die Blendenöffnungen herausquellenden Äquipotentiallinien bilden die raumwinkelfokussierende Ionenlinse. Die weiteren Ringblenden haben bevorzugt gleiche Innendurchmesser, gleiche Abstände und gleiche Potentialdifferenzen: dadurch können sie ein homogenes Reflektionsfeld ausbilden, das durch verschieden große Eindringtiefen (und daher verschieden lange Flugstrecken) für Ionen leicht verschiedener Energien die Energiefokussierung erzeugt. Die Fokuslänge der Energiefokussierung lässt sich ähnlich wie bei einem Gitterreflektor durch das Verhältnis der Feldstärken in Bremsfeld und Reflektionsfeld einstellen.
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Wie oben kurz beschrieben, zielt die Erfindung darauf ab, hohe Massenauflösungen bis zu hohen Massen im Bereich über acht Kilodalton dadurch zu erzeugen, dass mindestens eine der Betriebsspannungen des Reflektors während einer Aufnahme eines Flugzeitspektrums mit einer günstig gewählten Zeitfunktion verändert wird. Es wird im Rahmen dieser Offenbarung insbesondere der Einfluss einer Veränderung der Fokussierungsspannung U3 (siehe ) an einer der hinteren Blenden des Reflektors während der Spektrenaufnahme auf das Massenauflösungsvermögen an Hand mathematischer Simulationen erläutert. Einige Ergebnisse der Simulationen sind in den dargestellt.
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Diese Simulationen haben gezeigt, dass auch die Einstellung der Startbereichsparameter angepasst werden kann, um weiter verbesserte Ergebnisse zu erhalten. Insbesondere lässt sich die Zeitkonstante τ, die die Änderung der Beschleunigungsspannung nach verzögertem Einschalten der Beschleunigung in einer MALDI-Ionenquelle beschreibt, entsprechend günstig wählen. Die zeigt dabei die optimal erhaltenen Massenauflösungen als Funktion der Masse (Kurve 20) für Veränderungen der Spannung U3 während der Spektrenaufnahme für τ = 700 Nanosekunden, was dem bisherigen Normalbetrieb einer MALDI-Ionenquelle entspricht, im Vergleich zu den Massenauflösungen, die im herkömmlichen statischen Reflektorbetrieb (Kurve 21) erreicht werden. Es konnten im hohen Massenbereich von über 8000 Dalton Massenauflösungen über R = 70 000 erreicht werden. Eine höhere Massenauflösung geht immer auch mit einer besseren Empfindlichkeit einher, weil die Massensignale im Spektrum schmaler und dadurch höher werden und somit ein verbessertes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zeigen.
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Wird die Zeitkonstante der Beschleunigungsspannung in der MALDI-Ionenquelle τ auf 300 Nanosekunden herabgesetzt, so erhält man mit einer optimalen Veränderungsfunktion U3 = f(t) die Massenauflösungen der Kurve 23 in , die im gesamten Massenbereich bis über m = 8000 Dalton hinaus weit über R = 100 000 liegen.
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In sind die zugehörigen optimalen Funktionen U3 = f(t) für die Veränderung der Fokussierungsspannung U3 für die Kurven 20 und 23 in wiedergegeben. Die Aufnahme eines Massenspektrums dauert in diesem Beispiel etwa 100 Mikrosekunden. Die erforderliche Änderung von U3 beträgt, wie in ersichtlich, weniger als 200 Volt.
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Die mathematischen Funktionen, die die optimalen Änderungen der Spannungen beschreiben, können in Simulationen recht präzise bestimmt werden. In diesen bisherigen Simulationen hat sich ergeben, dass auch oberhalb einer Masse m = 8 Kilodalton noch Massenauflösungen von R = m/Δm > 100 000 erreicht werden können (Δm stellt die Halbwertsbreite des Ionensignals dar).
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Frühere Simulationen von Reflektor-Flugzeitmassenspektrometern haben gezeigt, dass diese Arten von Simulationen die tatsächlich beobachteten experimentellen Verhältnisse recht ordentlich nachbilden. Aus diesen Simulationen lässt sich daher ableiten, dass die in der Praxis auftretenden Verbesserungen des Auflösungsvermögens über einen breiten Massenbereich den berechneten recht nahe kommen werden. Es kann sogar erwartet werden, dass mit entsprechend angepassten Änderungen im Startbereich der Ionen, z.B. mit anderen Werten für τ in einer Ionenquelle, oder mit zusätzlichen veränderlichen Spannungen an anderen Blenden des Reflektors noch höhere Auflösungsvermögen im gesamten Massenbereich, insbesondere auch im hohen Massenbereich über m = 8 Kilodalton, erzielt werden können. So kann beispielsweise zusätzlich zur Fokussierungsspannung U3 auch die Bremsspannung U2 während der Spektrenaufnahme variiert werden. Auch können andere Zeitkonstanten τ für die Veränderung der Beschleunigungsspannung im Startbereich, oder sogar eine andere Funktion als die bisher verwendete Exponentialfunktion für die Veränderung der Beschleunigungsspannung im Startbereich verwendet werden.
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Die Ergebnisse der Simulationen sind für den Fachmann erstaunlich, da in den etwa 40 Jahren der MALDI-Flugzeitmassenspektrometrie immer wieder Versuche unternommen wurden, das Massenauflösungsvermögen zu verbessern, wie in der Einleitung dargelegt. Dies beinhaltete jedoch immer einen statischen Reflektorbetrieb. Es eröffnen sich durch die Erfindung neue Anwendungen der Massenspektrometrie, nicht nur für den Einsatz als Protein-Sequenzierer. So öffnen sich beispielsweise auch auf dem Gebiet der bildgebenden Massenspektrometrie von Gewebeproben neue Möglichkeiten. Bisher mussten die Proteine der Gewebeproben durch enzymatischen Verdau in relativ kleine Verdaufragmente umgewandelt werden, um im bei statischem Reflektorbetrieb optimalen Massenbereich von zwei bis vier Kilodalton gemessen werden zu können. Die Rekonstruktion der Proteine ist umso leichter, je größer die Verdaufragmente sind, die gemessen werden können. Auch hier kann die beschriebene Neuerung eine Verbesserung erzielen.
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Die Erfindung ist vorstehend mit Bezug auf verschiedene besondere Ausführungsbeispiele beschrieben. Es versteht sich jedoch, dass diverse Aspekte oder Details der beschriebenen Ausführungen geändert werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Insbesondere können im Zusammenhang mit unterschiedlichen Ausführungsformen offenbarte Merkmale und Maßnahmen beliebig kombiniert werden, sofern dies einem Fachmann praktikabel erscheint. Überdies dient die vorstehende Beschreibung nur zur Veranschaulichung der Erfindung und nicht zur Einschränkung des Schutzbereichs, der ausschließlich durch die beigefügten Ansprüche unter Berücksichtigung etwaig vorhandener Äquivalente definiert wird.
