CN109616398B - 反射器飞行时间质谱仪中的宽范围高质量分辨率 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于飞行时间质谱仪的能量聚焦和立体角聚焦反射器的操作，其中脉冲离子例如从通过基质辅助激光解吸(MALDI)进行电离的离子源加速进入飞行管。本发明的目的在于通过改变所述反射器的隔膜之一上的能在谱获取期间根据合适时间函数改变的至少一个操作电压，以在最大高于8千道尔顿的高质量的宽质量范围内生成高质量分辨率。这也可以有利于离子因此在起始区域中适应加速电压的操作。这些测量使得可以在延伸至高于8千道尔顿的宽质量范围内实现远远高于R＝100,000的质量分辨率。

Description

反射器飞行时间质谱仪中的宽范围高质量分辨率
技术领域
本发明涉及用于飞行时间质谱仪的能量聚焦和立体角聚焦反射器的操作，其中脉冲离子例如从通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)进行电离的离子源加速进入飞行时间管。
本发明的目的是在获取谱(spectrum)时，根据合适的时间函数，通改变反射器的一个隔膜上的至少一个电压，来在宽质量范围上生成高质量分辨率，多达例如大约12千道尔顿(1道尔顿对应于一个原子质量单位u)的高质量，使得相继通过反射器的不同离子受到最有利的反射器设置，以便最佳地聚焦。
背景技术
从B.A.Mamyrin、V.I.Karatzev和D.V.Shmikk(US 4,072,862 A)的工作中已知两个场级(field stages)之间的有两个栅格的两级反射器。他们允许速度聚焦的离子反射具有可调焦距(现在通常被称为“能量聚焦”)。第一个强反向场使离子减速，而第二个十分均匀的场反射离子，这样做会引起速度聚焦，因为更高速度的离子更深地穿透到反射器中且因此必须覆盖更大的距离，从而经历时延，这补偿了它们的更高的速度。可以通过调整减速场和反射场的相对强度来调整能量聚焦的焦距。该反射器未展示任何立体角聚焦。代替两级反射器，也可以使用在入口区域仅具有一个栅格的单级反射器。这些单级反射器具有固定的、相对短的用于能量聚焦的焦距，并且占据飞行时间质谱仪的总飞行路径的大部分。
然而，该Mamyrin反射器不能反射片段离子使得它们能量聚焦，因为它仅反射同时聚焦原始能量的离子，所有的该离子具有相同的穿透深度。为了从片段离子中获得聚焦的质谱，Weinkauf等人为此研发了一种方法来改变片段离子谱的不同连续获取之间的反射器电压，使得动能与质量成比例的片段离子都具有进入反射器的相同穿透深度，因此都很好的聚焦在谱获取周期上(“Laser Tandem Mass Spectrometry in a Time of FlightInstrument”,R.Weinkauf,K.Walter,C.Weickhardt,U.Boesl,E.W.Schlag；Z.Naturforschg.44a,1219-1225；1989)。利用这种方法，不同的谱都以略不同的反射器电压分别获得、且因此都显示出良好聚焦但相对彼此略微移动的质量范围，并且这些不同的谱随后在数学上组合，使得在计算的谱中仅考虑最佳分辨率区域。这种方法非常耗时从而笨重，因为必须获取大量的有着略微不同电压设置的单独谱。此外，需要一种特殊的方法来利用两个激光系统进行操作而产生片段离子。这解释了为什么这种方法从未成为一种常规方法。
在飞行时间质谱仪中，离子反射器位于离子源之后和离子检测器之前，为了补偿相同质量的离子的不同起始能量，已建议提供至少一个电极在反射后作用于离子上，且以在预定的离子质量(例如，10原子质量单位)的狭窄范围之内的方式将脉冲高电压(上升时间为每十纳秒一千伏)施加于该至少一个电极，由于离子源中不同形成位置或时间导致的相同质量离子的飞行时间误差在离子检测器处得到补偿，参见GB 2 295 720 B(对应于US5,739,529 A和DE 44 42 348 A1)。这样做，除了能量补偿之外，还可以同时补偿所研究的离子的飞行时间误差。电极可位于反射器的下游或者包含在反射器中。
R.Frey和E.W.Schgg(EP 0 208 894 B1；US 4,731,532 A)发表的工作已经公开了无栅格的两级反射器，除了速度聚焦之外还具有立体角聚焦。该反射器要求点状的离子源，例如通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)进行电离所近似提供的离子源。无栅格反射器由多个金属环形隔膜和端子板电极构成。高减速场是通过在前两个或三个环形隔膜处施加高电势差形成的。通过孔径隔膜出现的等势线形成立体角聚焦离子透镜。其他环形隔膜有相同的内径、相同的间隔、和相同的电势差：它们形成均匀的反射场，该反射场通过不同穿透深度(且因此不同长度的飞行路径)产生针对不同能量离子的能量聚焦。通过调节减速和反射场中的场强比来设定能量聚焦的焦距-与栅格反射器的情况一样。但这需要严格的立体角聚焦的耦合设置，其焦距通常和能量聚焦的焦距不一样。速度聚焦的焦距和立体角聚焦的焦距不能彼此独立的设置；只有一种特定的几何排列，其将源自离子源的略微发散的离子束成像到具有速度聚焦和立体角聚焦两者的离子检测器上。
专利说明书DE 196 38 577 C1(“Simultaneous focusing of all masses intime-of-flight mass spectrometers”；J.Franzen,1996)解释了在通过基质辅助激光解吸(MALDI)进行电离的离子源中，离子源中的加速电压在一段时延后照常开启、但在进一步加速期间连续改变的情况下，如何导致质量分辨率不仅在一个质量上产生高分辨率值、而且在更大质量范围内产生相对高的分辨率，例如2千道尔顿。这项技术以名称“Pan”而广为人知。质量分辨率的幅度和几何中心作为质量的函数可以通过用于改变函数并且在质量范围上移位的时间常数τ进行改变。
专利说明书US 6,740,872 B1(“Space Angle Focusing Reflector for Time-of-Flight Mass Spectrometers”,A.Holle,2002)，描述了如何在反射器的后部、特别是在离子的反转点处通过引入具有略微弯曲的等势面的静态电场不均匀性而在反射器中产生额外的聚焦。可以通过电压U3产生和调整该额外的聚焦，电压U3专门提供给反射器的最后的隔膜中的一个(优选倒数第三个隔膜)。对于已经有了立体角聚焦的无栅格的反射器，立体角聚焦的焦距可以通过该过程进行改变，并且调整到速度聚焦的焦距，并指向检测器。通过该测量还提高了质量分辨率。
“源内衰减(In-Source Decay)”是给予基质辅助激光解吸电离(MALDI)离子源的特殊操作模式的术语。它利用相对强烈但是非常短(通常短于3纳秒)的激光脉冲进行操作。因此，甚至在使用加速之前，从含有蛋白质分子的样本产生片段离子，氨基酸在每个蛋白质分子中的特征位置被切割。统计地，所有氨基酸都涉及贯穿所有蛋白质分子的切割。因此，从纯蛋白质(或纯的、酶促产生的蛋白质消化片段)的样本产生片段质量的具有两个梯状物的质谱，一个梯状物来自氨基端(N-terminus，N-端)，一个梯状物来自羧基端(C-terminus，C-端)。从这些梯状物中，可以读出该蛋白质的氨基酸序列(参见例如专利说明书US 8,581,179 B2“Protein Sequencing with MALDI Mass Spectrometry”；J.Franzen,2010)。然而，为了经济操作，必须能够在高达约12千道尔顿(大约100个氨基酸)的宽范围上测量质谱，并且具有足够的灵敏度和足够的质量分辨率。然后可以在一个步骤内对最大长度约200个氨基酸的蛋白质或者蛋白质消化片段进行测序。因为之前的Edman测序仪不再生产，质谱法为这项技术提供方便和更快捷的替代方案。
对测序蛋白质的本申请而言，也同样对许多其他申请而言，需要一种在宽范围内具有更好的、相对高质量分辨率的反射器飞行时间质谱仪的操作模式。更高的质量分辨率总是意味着更好的灵敏度，同时由于质量信号变得更窄并因此更高，并且表现出显著改善的信噪比。
发明内容
本发明的目的是在获取飞行时间谱期间,通过使用适当选择的函数来改变反射器的隔膜上的至少一个操作电压(例如，反射器的后隔膜之一上的聚焦电压U3)，来在最大高于8千道尔顿的高质量的范围内产生高质量分辨率。可以在微秒级范围内获取从最快到最慢的离子的飞行时间谱；例如，可以大约花费100微秒。在这样的时间尺度上调节电压的一个或多个电压源可以用于向一个或多个反射器隔膜的动态电压供应。U3的必要变化可以达到几伏，但具体地小于200伏。应当理解当反射器隔膜至少部分地经由一系列电阻供电时，电压变化也会影响馈送到相邻隔膜的电压(尽管程度较小)。在特别优选的实施例中，反射器的至少一个隔膜上的至少一个电压变化率可以实质上低于100伏特每纳秒，例如小于10伏特每纳秒/或在几伏特每微秒的范围内。
在谱获取期间，还可以改变减速电压U2而不是聚焦电压U3；或者适时地改变这两个电压。另一种可能性是在获得谱时改变反射器的其他内部隔膜上的操作电压，以便创建合适的反射条件用于每个离子或片段离子在其飞过反射器时的最佳聚焦。
仿真已经显示了还可以调整离子起始区域参数的设置，以便得到更好的结果。更好的是选择相应有利的时间常数τ，其描述了起始区域(例如，在MALDI源中)的加速在经过延迟而开启之后改变加速电压。特别地，它可以与反射器的动态操作一起缩短。
可以在仿真中确定电压(例如，U3＝f(t))变化的最佳可能时间函数。仿真已经显示了即使在质量m＝8千道尔顿以上，也可以实现R＝m/Δm>100,000(Δm代表离子信号在半最大值处的全宽)的质量分辨率。因此，在这个高质量范围内分辨率和灵敏度能比目前已知的静态反射器模式高出10倍。这促进了经济可行地使用反射器飞行时间质谱仪作为蛋白质测序仪，这需要在高达约12千道尔顿(约100个氨基酸)的宽范围内测量质谱，且具有足够的灵敏度和足够的质量分辨能力，优选地跨度实质上大于1000道尔顿，例如2000道尔顿、4000道尔顿、6000道尔顿或更高。因此可以在一个步骤内测序长度高达约为200个氨基酸长度的蛋白质或蛋白质消化片段。
然而，对于直到高质量范围都具有高质量分辨率的反射器飞行时间质谱仪，还有许多其他的可能的应用。对于无栅格的反射器质谱仪肯定有很大的需求，其质量确定精度在最大高达10或12千道尔顿的质量范围内约为质量的百万分之一(1ppm)或更高。这可以通过本发明实现。
附图说明
通过参考以下附图可以更好的理解本发明。附图中的元件未必按照比例绘制，而是重点强调说明本发明的原理(主要是示意性地)。
图1示出了简单的基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间质谱仪的原理图，其反射器(10)可以被用于本发明。待成像的相对大量的样本或组织切片位于样本支撑板(1)上，与加速电极(2)和(3)相对，并且，通过移动样本支撑板(1)，可以将样本置于来自于激光器(5)的激光脉冲束(4)的焦点，在这里样本被电离。在激光等离子体中产生的离子通过加速电极(2)和(3)进行加速，在一段时延后形成离子束(6)，离子束(6)必须穿过离子选择器(7)，其中的轻离子(主要是基质物质的离子)可以被偏转且作为低于飞行时间限制的单独离子束被移除。然后，较重分析物离子的剩余离子束(9)被反射器(10)反射到二次电子倍增器(11)上。来自二次电子倍增器的输出电流被馈送到瞬态记录器(12)，其在那里被转换成一系列数字测量值。
图2示出了对应于图1中的反射器(10)的无栅格反射器的示例以及它的电场的等势面。U1和U2之间的高减速电势创建了带来初始立体角聚焦的离子透镜。电势U3在反转点附近略微弯曲了等势面，从而带来第二个可调节的聚焦，其能够用于调节能量聚焦和立体角聚焦的焦距以使得它们匹配，并将它们引导到检测器上。
图3示出了质量分辨率相对离子质量的函数在不同设定下的仿真结果。尽管当前使用的静态反射器模式(曲线21)在大约m＝1,300和m＝3000道尔顿之间的范围内实现了R>150,000(最大250，000)的分辨率，但在m＝8,500附近达到的分辨率仅为大约R＝8,000，因此这样就不可能再解析同位素。根据本发明如果在谱获取期间适当的改变电压U3，则该范围内的质量分辨率可提高到R＝70，000(曲线20)。
在图4中，将用于改变起始区域内的加速电压(例如：在离子源中)的参数τ额外地从τ＝700纳秒改变到τ＝300纳秒，使得在最大质量大于m＝8,000道尔顿的整个质量范围上实现远高于R＝100,000的质量分辨率(曲线23)。在至今为止的静态反射器模式下使用的分辨率如曲线22所示。其他τ和U3＝f(t)的组合或者引入进一步的电压改变甚至可以在更宽的质量范围内产生更高的质量分辨率，并且不需要太多的实验或仿真努力就可以确定。
图5示出了在仿真中发现的用于改变电压U3的合适函数U3＝f(t)。曲线25连同τ＝700纳秒产生图3中的曲线20，曲线24连同τ＝300纳秒生成图4中的曲线23。在这些示例中，在谱获取期间必要的电压变化小于200伏，尽管时间跨度很短，但是可以容易地以电子方式实现。
具体实施方式
虽然已经参考多个实施例和解释了本发明，但是本领域技术人员将意识到，在不脱离所附权利要求所限定的技术教导的范围的情况下，可以在形式和细节上在此进行各种改变。
从图1的粗略示意图中可看出基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间质谱仪是如何运行的。待成像的相对大量的样本或组织切片位于样本支撑板(1)上，与加速电极(2)和(3)相对，其在这里绘制为栅格，但在实际的实施例中是以有孔隔膜的形式使用。样本主要由基质物质的晶体组成，其中嵌入的分析物分子浓度为百分之几。通过移动样本支撑板(1)，可以将样本置于来自于激光器(5)的激光脉冲束(4)的焦点。
来自样本表面的少量样本通过处于高压和高温的激光脉冲转换成等离子体。等离子体最初具有和固体相同的体积，但立即开始膨胀并进行绝热冷却。在等离子体中，基质物质的离子通过质子化电离大量的分析物分子。在大约500到1000纳秒后，等离子体已经膨胀到大约为0.5毫米到1.0毫米的直径并且外围的粒子已经彼此失去联系。现在不再进行电离或绝热冷却。等离子体粒子以及离子也表现出规则的速度分布：等离子体中的粒子速度更高，它们离样本表面更远。这可以通过计算机程序在仿真中再现。
离子通过电极(2)和(3)之间的加速电压(其在一段时延后开启)进行加速以形成离子束(6)。离子选择器(7)允许移除大量低质量的基质离子，以保护检测器(11)免于过载和污染。然后，较重离子的剩余离子束(9)被反射器(10)反射到平板检测器(11)上，并根据离子能量和立体角聚焦。例如，检测器可以采用二次电子放大器的形式。来自二次电子倍增器的输出电流被馈送到瞬态记录器(12)，其在那里被转换成一系列数字测量值，这些测量值表示飞行时间谱，并在适当的校准和转换后表示质谱。
为了把长飞行路径(6，9)保持在地电位，并使检测器(11)能够在地电位下工作，通常将样本支撑板(1)的电压和反射器(10)的末端的电压两者保持在20千伏级的高电平。因此，反射器(10)中的聚焦电压U3也处于高电势。该电压因此不容易控制，但从技术的角度来看，如今这很容易实现。图2示出了具有隔膜的反射器和由施加的电压产生的电场的等势面。在反射器入口处可以清楚地看到透镜的效果，但反射器后部的聚焦效果不太清楚。这是由于事实上，在反射器后部分的等势面仅需要略微地偏离平面以产生效果，因为在反转点附近这里，离子几乎不具有任何动能且因此很容易被影响。
如上所述，无栅格反射器优选具有多个金属环形隔膜和终端板电极，如图2中示意性地所示。通过施加高电势差，可以在前2或3个环形隔膜处形成大的减速场。通过隔膜孔径出现的等势线形成了立体角聚焦离子透镜。其他环形隔膜优选地具有相同的内径、相同的间隔、和相同的电势差：它们因此可以形成均匀的反射场，其通过不同幅度的穿透深度(和因此不同长度的飞行路径)来提供针对能量略微不同的离子的能量聚焦。可以通过减速场和反射场的场强比来调节能量聚焦的焦距-与栅格反射器使用的程序类似。
如上简要所述，本发明的目的是当正在获取飞行时间谱时，通过有利地选择的时间函数改变反射器的至少一个操作电压，来在最大大于8千道尔顿以上的高质量的范围内产生高质量分辨率。作为本公开的一部分，借助于数学仿真解释了在谱获取期间通过改变反射器的后隔膜之一上的聚焦电压U3(见图2)对质量分辨率产生的影响。图3和图4示出了几个仿真的结果。
这些仿真已经示出了为了获得更好的结果，还可以调整起始区域参数的设置。特别是时间常数τ，可以选择它以便相应地有利，其描述了MALDI离子源中的加速在经过时延开启后，加速电压的变化。图3这里示出了在τ＝700纳秒的谱获取期间，作为用于改变电压U3的质量函数(曲线20)的最佳值而获得的质量分辨率，其与在传统静态反射器模式中实现的质量分辨率(曲线21)相比较、对应于迄今为止的MALDI离子源的正常模式。在高于8，000道尔顿的高质量范围内实现了高于R＝70，000的质量分辨率。此外，更高的质量分辨率始终与更好的灵敏度密切相关，因为谱中的质量信号变得更窄并因此更高，并因此表现出更好的信噪比。
如果MALDI离子源中的加速电压的时间常数τ减少到300纳秒，最优变化函数U3＝f(t)给出图4中的曲线23的质量分辨率的提升，其在延伸至m＝8000道尔顿以上的整个质量范围上远远大于R＝100,000。
图5示出了用于改变图3和图4中的曲线20和23的聚焦电压U3的相关最优函数U3＝f(t)。在本示例中，质谱的获取大约需要100微秒。U3的必要变化小于200伏，如图5所示。
仿真中，能非常精确地确定描述电压的最佳变化的数学函数。在迄今为止的这些仿真中，发现了即使在质量m＝8千道尔顿以上，仍然可以实现R＝m/Δm>100,000(Δm代表离子信号的半最大值处的全宽)的质量分辨率。
早期的反射器飞行时间质谱仪的仿真显示了这些类型的仿真很好的重现了实际观察到的实验情况。因此这些仿真得出的结论是，在实践中出现的在宽质量范围内的分辨率的改进非常接近于计算的分辨率。甚至可以预期在整个质量范围内仍可实现更高的分辨率，特别是在m＝8千道尔顿以上的高质量范围内，对离子的起始区域适当地给定适应的变化(例如离子源中的τ的其他值)，或在反射器的其他隔膜上给定额外的可变电压。例如，在谱获取期间还可以改变减速电压U2而不是改变聚焦电压U3、或者除了改变聚焦电压U3之外还改变减速电压U2。其他时间常数τ也能够被用于在起始区域改变加速电压，或者甚至可以使用不同于目前使用的指数函数的函数来改变起始区域的加速电压。
仿真结果令专家感到震惊，因为在40多年的MALDI飞行时间质谱法中，人们不断尝试改善质量分辨率，正如背景技术中所解释的那样。但是这往往涉及静态反射器模式。本发明开辟了用于质谱法的新应用，并不仅用作蛋白质测序仪。因此，例如，在组织样本的成像质谱法领域中也产生了新的可能性。迄今为止，组织样本的蛋白质必须借助酶的消化转化成相对小的消化片段，以使得在静态反射器模式下可以在2至4千道尔顿的最佳质量范围内测量它们。蛋白质重建更容易，可以测量的消化片段更大。所描述的新方法也可以在此处带来改进。
以上已经参考不同的具体示例实施例描述了本发明。然而，应该理解，在不脱离本发明范围的情况下，可以修改所描述的实施例的各个方面或细节。具体地，如果这对于本领域技术人员而言是可行的，则可以根据需要组合结合不同实施例公开的特征和措施。此外，上述描述仅作为本发明的说明，而不是对保护范围的限制，该保护范围仅由所附权利要求书限定，并考虑可能存在的任何等同物。

Claims (15)

1.一种用于操作反射器飞行时间质谱仪的方法，其中离子从起始区域以脉冲形式加速，穿过所述反射器，然后记录为飞行时间谱，所述反射器包括提供有预定电压的多个隔膜，
所述方法包括：在获取作为和离子质量相关的飞行时间的函数的飞行时间谱期间，改变所述反射器的位于沿着所述多个隔膜的与所述反射器后部中的所述离子的速度反转点相对应的位置处的隔膜上的至少一个电压，使得所述至少一个电压的变化小于200伏。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在获取所述飞行时间谱期间，改变所述反射器的最后的隔膜之一上的聚焦电压U3。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在获取所述飞行时间谱期间，改变所述反射器的多于一个隔膜上的电压。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，在获取所述飞行时间谱期间，还改变所述反射器的前面的隔膜之一上的减速电压U2。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，用于改变所述起始区域中的加速电压的函数适应于在已经延迟开启所述加速后所述至少一个隔膜电压的变化，以在包括数千道尔顿的宽质量范围上提高质量分辨率。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，优化用于改变所述起始区域中的所述加速电压的参数τ。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述起始区域包括MALDI离子源。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，测量组织切片的至少一个质谱图像并对蛋白质测序。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述离子的质量分散对应于大于1000道尔顿离子质量的范围的时间段内，在获取所述飞行时间谱期间，改变所述反射器的隔膜上的所述至少一个电压。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述反射器的隔膜上的所述至少一个电压的改变率小于100伏特每纳秒。
11.一种反射器飞行时间质谱仪，其中，离子从起始区域以脉冲形式加速，所述反射器飞行时间质谱仪的反射器包括提供有预定电压的多个隔膜，并且所述反射器飞行时间质谱仪配备有电子系统，利用该电子系统，在谱获取期间根据预定时间函数，改变所述反射器的位于沿着所述多个隔膜的与所述反射器后部中的所述离子的速度反转点相对应的位置处的至少一个隔膜上的至少一个电压，使得所述至少一个电压的变化小于200伏。
12.根据权利要求11所述的反射器飞行时间质谱仪，其中，所述电子系统被配置为在微秒时间尺度上改变隔膜电压。
13.根据权利要求11所述的反射器飞行时间质谱仪，其中，所述电子系统被配置为在所述离子的离子分散对应于大于1000道尔顿离子质量的范围的时间段内改变所述至少一个隔膜上的所述至少一个电压。
14.根据权利要求11所述的反射器飞行时间质谱仪，其中，所述电子系统被配置为以小于100伏特每纳秒的速率改变所述至少一个隔膜上的所述至少一个电压。
15.根据权利要求11所述的反射器飞行时间质谱仪，其中，所述反射器是无栅格的。
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