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Stand der Technik
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer Zellkultur aus menschlichen oder tierischen Zellen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, eine Mikrotiterplatte mit mehreren Näpfchen, die mit einer Zellkultur befüllt sind, gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 7, sowie eine Verwendung einer Zellkultur gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 8.
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Medizinische oder pharmakologische Tests werden unter anderem an Zellkulturen aus menschlichen oder tierischen Säugetierzellen durchgeführt. Dabei wird die Zellkultur den zu testenden Stoffen ausgesetzt und die Reaktion der Zellen untersucht.
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Zum Kultivieren menschlicher oder tierischen Zellen werden die Zellen üblicherweise in ein Gefäß pipettiert, in dem eine Nährlösung enthalten ist. Die Zellen sedimentieren dann in der Nährlösung und setzen sich am Boden des Gefäßes ab. Dort teilen sie sich mit einer vorgegebenen Teilungsrate, die im Wesentlichen von den in der Nährlösung enthaltenen Wachstumsfaktoren abhängig ist. Nach wenigen Tagen bildet sich am Boden des Gefäßes ein sogenannter Zellrasen, der den Boden vollständig bedeckt. Dieser Zellrasen ist jedoch nur eine begrenzte Zeit stabil. Wenn die Zellen zu lange im Gefäß verbleiben – in der Regel nach einigen Tagen – tritt eine sogenannte Apoptose auf, d. h. die Zellen heben sich vom Boden des Gefäßes ab und sterben. Es ist daher erforderlich, in regelmäßigen Abständen eine sogenannte Passage durchzuführen, bei der die Zellen im Gefäßboden mittels eines Enzyms abgelöst, gewaschen, vereinzelt und dann in ein anderes Gefäß zur erneuten Zellteilung hinein pipettiert werden. Dieser Prozess wird üblicherweise von Hand durchgeführt und ist daher relativ aufwendig und teuer. Darüber hinaus verändern die Zellen nach jeder Zellteilung, d. h. von Generation zu Generation, ihre spezifischen Eigenschaften. Zellen einer jüngeren Generation sind üblicherweise weniger differenziert als Zellen einer älteren Generation. Dies hat zur Folge, dass derselbe Test, der einmal an einer Zellkultur einer älteren und einmal an einer Zellkultur einer jüngeren Generation durchgeführt wird, unterschiedliche Ergebnisse liefern kann.
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Offenbarung der Erfindung
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Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen einer Zellkultur aus menschlichen oder tierischen Zellen zum Durchführen medizinischer und pharmakologischer Tests zu schaffen, mittels dessen eine Zellkultur hergestellt werden kann, die über einen längeren Zeitraum, insbesondere über mehrere Wochen, stabil ist. Dadurch wird es möglich, medizinische oder pharmakologische Tests im Abstand von mehreren Wochen an derselben Zellkultur durchzuführen. Darüber hinaus ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte, langzeitstabile Zellkultur zu schaffen, an der dann die gewünschten medizinischen oder pharmakologischen Tests durchgeführt werden können.
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Die genannten Aufgaben werden gemäß der Erfindung durch die im Patentanspruch 1 bzw. im Patentanspruch 8 angegebenen Merkmale gelöst. Weitere Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
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Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen einer Zellkultur aus menschlichen oder tierischen Zellen, insbesondere aus Säugetierzellen, zum Durchführen medizinischer oder pharmakologischer Tests, vorgeschlagen, das wenigstens folgende Schritte umfasst:
- – Einlegen eines Substrats aus mikrobiell hergestellter Zellulose in ein Gefäß;
- – Einfüllen einer Nährstofflösung in das Gefäß;
- – Aufbringen von menschlichen oder tierischen Zellen auf das Substrat;
- – Temperieren des Gefäßinhalts auf eine vorgegebene Temperatur, insbesondere Körpertemperatur; und
- – Warten, bis das Substrat wenigstens teilweise von einem Zellrasen bedeckt ist.
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Nach dem Aufbringen der menschlichen oder tierischen Zellen auf das Substrat aus mikrokristalliner Zellulose kommt es zu einem Zellteilungs- und Wachstumsprozess, bei dem das Substrat zunehmend von Zellen bedeckt wird. Dieser Prozess läuft bei Körpertemperatur, also bei etwa 37°C, optimal ab. Während des Zellteilungs- und Wachstumsprozesses wird die Zellkultur daher vorzugsweise auf etwa 37°C gehalten. Wenn die Zellen das Substrat so dicht bedecken, dass die äußeren Membranen der Zellen sich lückenlos gegenseitig berühren, hören die Zellen auf, sich zu teilen. In diesem Zustand ist die Zellkultur auf dem Substrat aus mikrobiell hergestellter Zellulose über mehrere Wochen stabil.
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Die Zellen können dann zur Lagerung oder für den Transport langsam auf Raumtemperatur von z. B. 15°–30°C, insbesondere 18°–25°C abgekühlt werden.
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Bezüglich der vorstehend genannten Verfahrensschritte ist zu betonen, dass diese nicht unbedingt in der angegebenen Reihenfolge ausgeführt werden müssen. So kann beispielsweise das Aufbringen von menschlichen oder tierischen Zellen auf das Substrat auch vor dem Einfüllen einer Nährstofflösung in das Gefäß erfolgen. Wahlweise könnte auch die Nährstofflösung zuerst in das Gefäß eingefüllt und danach erst das Substrat eingelegt werden. Dem Fachmann ist klar, dass er die Abfolge der einzelnen Schritte nach Wunsch festlegen kann.
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Für den Transport ist es nicht nötig, die Zellen, wie sonst üblich, einzufrieren; der Transport kann vielmehr bei Umgebungstemperatur erfolgen, wie z. B. zwischen 15°C und 30°C. Die Temperatur kann aber auch höher oder niedriger sein.
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Wenn die Umgebungstemperatur im gewünschten Bereich liegt, z. B. zwischen 15°C und 30°C, ist es ausreichend, die Zellkultur einfach abkühlen zu lassen (ohne Verwendung einer Kühleinrichtung). Die Zellkultur könnte aber auch aktiv, d. h. mittels einer Kühleinrichtung, auf die gewünschte Temperatur herunter gekühlt werden.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Gefäß mit einem hermetischen Verschluss, wie z. B. einer Folie oder einem Deckel versehen. Der hermetische Verschluss soll insbesondere das Eintreten oder Austreten von Medien, wie beispielsweise Flüssigkeit oder Gas aus dem bzw. in das Gefäß verhindern. Das Abdichten des Gefäßes kann prinzipiell vor oder nach dem Abkühlen durchgeführt werden, wird aber vorzugsweise vorher durchgeführt.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Gefäß mit einer Folie abgedichtet, die z. B. mit dem Gefäß verschweißt oder verklebt wird. Alternativ oder zusätzlich könnte auch ein Deckel vorgesehen sein, der das Gefäß abschließt.
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Das Gefäß mit der darin befindlichen Zellkultur kann schließlich noch verpackt werden, um es anschließend z. B. an ein Labor oder einen Kunden schicken zu können, der dann die medizinischen oder pharmakologischen Tests an der Zellkultur durchführt. Die Verpackung kann beispielsweise eine Schachtel und gegebenenfalls Dämmmaterial umfassen. Die Verpackung kann auch ein Kühlmittel umfassen.
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Um die Zellkultur nach deren Herstellung insbesondere für einen nachfolgenden Transport per Post, oder allgemein gegen mechanische Belastungen und Stöße zu schützen, wird vorgeschlagen, einen die Viskosität der Nährstofflösung erhöhenden Stoff oder einen Stoff mit einer höheren Viskosität als die Nährstofflösung in das Gefäß hinein zu geben. Gemäß der ersten Alternative kann die Nährstofflösung beispielsweise mit Methylzellulose, Polyethylenglykol oder einem anderen, die Viskosität erhöhenden Stoff, versetzt werden. Gemäß der zweiten Alternative könnte auch eine höher viskose Substanz, wie z. B. eine gelartige Substanz in das Gefäß eingebracht werden. Es könnte aber auch ein Feststoff, wie z. B. ein Körper aus mikrokristalliner Zellulose auf die Zellkultur aufgesetzt werden. Dadurch wird die Zellkultur mechanisch am Boden des Gefäßes festgehalten und kann nur noch schwer zur Seite kippen oder aufschwimmen.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen der Zellkultur nicht passagiert, d. h. der Zellrasen wird vorzugsweise nicht abgelöst und die Zellen werden nicht wie im Stand der Technik vereinzelt und danach wieder auf ein anderes Substrat zur erneuten Zellteilung aufgebracht. Die Zellkultur wird vielmehr vorzugsweise durch einen einmaligen Zellteilungs- und Wachstumsprozess hergestellt.
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Die Zellkultur wird vorzugsweise in demselben Gefäß in dem sie gezüchtet worden ist, verpackt und gegebenenfalls an einen Empfänger verschickt. Sie muss also nicht in ein anderes Gefäß umgefüllt werden.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das vorstehend genannte Verfahren an einer Mikrotiterplatte durchgeführt, die eine Vielzahl von Näpfchen aufweist. In jedes der Näpfchen wird ein Substrat aus mikrobiell hergestellter Zellulose eingelegt, eine Nährstofflösung eingefüllt und menschliche oder tierische Zellen auf das Substrat aufgebracht. Danach wachsen und teilen sich die Zellen, bis sie das Substrat wenigstens teilweise bedeckt haben. In den einzelnen Näpfchen der Mikrotiterplatte befindet sich schließlich jeweils ein Teil derselben Zellkultur. Die einzelnen Teilkulturen können dann dazu verwendet werden, denselben oder unterschiedliche medizinische bzw. pharmakologische Tests durchzuführen.
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Die Lagerung oder der Transport der Zellkultur erfolgt vorzugsweise bei Umgebungstemperatur. Ein Einfrieren der Zellkultur, wie bislang üblich, ist nicht erforderlich.
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Die gesamte Mikrotiterplatte wird vorzugsweise mit einem hermetischen Verschluss versehen, wie vorstehend beschrieben. Sie kann schließlich noch verpackt und verschickt werden.
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Die Erfindung betrifft auch eine Mikrotiterplatte mit mehreren Näpfchen, die jeweils mit einem aus mikrobieller Zellulose hergestelltem Substrat, das von einer Zellkultur besiedelt ist, befüllt sind. Die Mikrotiterplatte befindet sich vorzugsweise auf etwa Umgebungstemperatur und wird weder gekühlt noch erwärmt. Sie könnte zur Aufbewahrung aber auch auf Temperaturen unterhalb der Zimmertemperatur, z. B. auf 5°C bis 10°C abgekühlt werden.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist in den einzelnen Näpfchen der Mikrotiterplatte ein Stoff enthalten, der auf der Zellkultur angeordnet ist und eine höhere Viskosität aufweist als die Nährstofflösung. Dadurch wird die Zellkultur mitsamt dem Substrat mechanisch am Boden des Gefäßes festgehalten und kann nur noch schwer zur Seite kippen oder aufschwimmen.
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Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch noch eine Verwendung einer Zellkultur aus menschlichen oder tierischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen, die gemäß einem der vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, zur Durchführung medizinischer oder pharmakologischer Tests.
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Die Erfindung wird nachstehend anhand der beigefügten Zeichnungen beispielhaft näher erläutert. Es zeigen:
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1a–1g verschiedene Zustände eines Verfahrens zum Herstellen einer Zellkultur aus menschlichen oder tierischen Zellen gemäß einer Ausführungsform der Erfindung; und
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2 eine Mikrotiterplatte mit mehreren Näpfchen, in denen sich jeweils eine gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Zellkultur befindet.
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1 zeigt verschiedene Zustände eines Verfahrens zum Herstellen einer Zellkultur 9 aus menschlichen oder tierischen Zellen. Die Zellkultur 9 kann später zum Durchführen medizinischer oder pharmakologischer Tests verwendet werden.
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Zum Herstellen der Zellkultur 9 wird zunächst ein Gefäß 1 mit einer Nährstofflösung 2 befüllt (1a). Als Nährlösung 2 kann beispielsweise das im Biochemical Journal 58 von 1954, Seiten 345–352 beschriebene Nährmedium von Schramm und Hestrin verwendet werden. Die Nährlösung kann z. B. aus 20 g Glukose, 5 g Hefeextrakt, 5 g Bactopepton, 2,7 g Natriumphosphat und 1,15 g Zitronensäure-Monohydrat und 0,5 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat in einem Liter Wasser umfassen. Alternativ können auch andere aus dem Stand der Technik bekannte Nährstofflösungen verwendet werden.
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Als nächster Schritt wird dann ein aus mikrobieller Zellulose hergestelltes Substrat
3, das beispielsweise die Form eines Plättchens aufweisen kann, in das Gefäß
1 hinein gelegt (
1b). Die beiden vorstehend beschriebenen Schritte können auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden. Ein Substrat
3 aus mikrokristalliner Zellulose kann beispielsweise mittels eines Verfahrens hergestellt werden, wie es aus der
DE 10 2008 056 413.3 oder der
WO 2010 052 019 A2 bekannt ist. Andere Herstellungsverfahren zum Herstellen mikrokristalliner Zellulose sind aus dem Stand der Technik hinreichend bekannt.
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In 1c wird schließlich eine Suspension aus menschlichen oder tierischen Zellen 4 in das Gefäß 1 eingebracht. Die Zellen 4 sedimentieren dann in der Nährstofflösung 2 und setzen sich auf der Oberfläche des Zellulose-Substrats 3 ab. Bei Temperaturen um die 37°C findet dann ein Teilungs- und Wachstumsprozess statt, wobei sich auf dem Substrat 3 innerhalb weniger Tage ein sogenannter Zellrasen 5 bildet, der das Substrat 3 vollständig bedeckt, wie in 1d zu sehen ist.
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Sobald der Zellrasen 5 die gewünschte Größe und Dicke erreicht hat, stoppt der Zellteilungs- und Wachstumsprozess. Das Gefäß 1 einschließlich seines Inhalts wird dann auf eine niedrigere Temperatur abgekühlt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Gefäß auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, z. B. auf etwa 18°C bis 25°C. Es hat sich gezeigt, dass die Zellkultur 9 bei diesen Temperaturen über mehrere Wochen hinweg, z. B. über drei, vier oder auch mehr Wochen stabil bleibt und die Zellen insbesondere nicht absterben.
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Optional kann in einem weiteren Schritt 1e ein die Viskosität der Nährstofflösung 2 erhöhendes Mittel 10, wie z. B. Methylzellulose oder Polyethylengykol (PEG) zugefügt werden. Das sich nach dem Hinzufügen des Mittels 10 ergebende Medium ist in 1f mit dem Bezugszeichen 11 gekennzeichnet.
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Anstelle des Mittels 10 oder zusätzlich könnte auch ein Stoff mit einer höheren Viskosität als die Nährstofflösung auf die Zellkultur 9 aufgebracht werden. So könnte z. B. ein weiterer Körper aus mikrokristalliner Zellulose auf die Zellkultur 9 aufgesetzt werden. Dadurch kann verhindert werden, dass sich das Substrat 3 zusammen mit der Zellkultur 9 vom Boden des Gefäßes 1 abhebt und z. B. zur Seite kippt oder aufschwimmt.
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In einem weiteren Schritt 1f kann das Gefäß 1 noch mit einem hermetischen Verschluss 6 abgedichtet werden, um das Austreten bzw. Eindringen von Medium zu verhindern. Bei dem hermetischen Verschluss 6 kann es sich beispielsweise um eine Folie handeln, die z. B. mit dem Gefäß 1 verschweißt oder verklebt werden kann. Wahlweise könnte natürlich auch ein Deckel mit einer Dichtung (nicht gezeigt) vorgesehen sein.
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Um die Zellkultur 9 einschließlich des Gefäßes 1 zu verschicken, wird das Gefäß 1 in Schritt 1g schließlich noch verpackt. Im dargestellten Ausführungsbeispiel ist das Gefäß 1 in einer Schachtel 12 eingepackt und zusätzlich durch einen Füllstoff 13 gegenüber mechanischen Stößen und Beschädigungen geschützt.
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Gemäß der Erfindung wird die Zellkultur 9 vorzugsweise in demselben Gefäß 1 verschickt, in dem sie auch kultiviert worden ist.
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Aus den einzelnen Verfahrensschritten 1a bis 1g wird deutlich, dass es nicht erforderlich ist, die Zellen der Zellkultur 9 zu passagieren, d. h. der Zellrasen 5 wird nicht vom Substrat 3 abgelöst, und die Zellen werden nicht vereinzelt und danach wieder auf ein anderes Substrat zur erneuten Zellteilung aufgebracht.
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2 zeigt eine Mikrotiterplatte 8 mit mehreren Näpfchen 7, die jeweils als Gefäß 1 entsprechend der Figuren 1a bis 1g dienen. In jedem der Näpfchen 7 befindet sich ein Substrat 3 aus mikrokristalliner Zellulose, das von einer Zellkultur 9 besiedelt ist. Die Herstellung der Zellkulturen 9 kann dabei entsprechend der in den 1a bis 1d gezeigten Verfahrensschritte gleichzeitig hergestellt werden.
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Nachdem die einzelnen Zellkulturen 9 die gewünschte Größe erreicht haben, wird die Mikrotiterplatte 8 auf Raumtemperatur abgekühlt und z. B. mittels einer Folie 6 verschlossen, wie in 1f dargestellt ist. In jedem der Näpfchen 7 befindet sich dann ein Teil derselben Zellkultur.
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Sofern die Mikrotiterplatte 8 verschickt werden soll, wird sie in einem weiteren Schritt entsprechend 1g verpackt. Der Kunde erhält somit eine Mikrotiterplatte mit einer fertigen, über viele Wochen stabilen Zellkultur 9, an der er die gewünschten medizinischen oder pharmakologischen Tests durchführen kann.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102008056413 [0029]
- WO 2010052019 A2 [0029]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Biochemical Journal 58 von 1954, Seiten 345–352 [0028]
