EP2978838A1 - Verfahren und vorrichtung zum herstellen einer zellkultur aus menschlichen oder tierischen zellen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum herstellen einer zellkultur aus menschlichen oder tierischen zellen

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Publication number
EP2978838A1
EP2978838A1 EP14713437.3A EP14713437A EP2978838A1 EP 2978838 A1 EP2978838 A1 EP 2978838A1 EP 14713437 A EP14713437 A EP 14713437A EP 2978838 A1 EP2978838 A1 EP 2978838A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
cell culture
substrate
vessel
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP14713437.3A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Günter BERTHOLDT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xellutec GmbH
Original Assignee
Xellutec GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xellutec GmbH filed Critical Xellutec GmbH
Publication of EP2978838A1 publication Critical patent/EP2978838A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C12M37/04—Seals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/78—Cellulose

Definitions

  • the invention relates to a method for producing a cell culture from human or animal cells according to the preamble of
  • Patent claim 1 a microtiter plate with a plurality of wells filled with a cell culture, according to the preamble of claim 12, and a use of a cell culture according to the preamble of patent claim 14.
  • human or animal mammalian cells The cell culture is exposed to the substances to be tested and the reaction of the cells is examined.
  • cell cultures are usually used today in which cells are grown on a surface such as a cell surface. cling to the bottom of a cell culture vessel. For this purpose, a suspension of human or animal cells is pipetted into a vessel in which a
  • Nutrient solution is included.
  • the cells then sediment in the nutrient solution and settle at the bottom of the vessel. There they attach and divide at a rate that is essentially dependent on the growth factors contained in the nutrient solution. After a few days, a so-called cell lawn forms on the bottom of the vessel, completely covering the soil. However, this cell lawn is stable only for a limited time. If the cells remain in the vessel too long - usually after a few days - the cells will lift off the bottom of the vessel and die. It is therefore necessary at regular intervals a so-called passage
  • the cells in which the cells from the bottom of the vessel by means of an enzyme detached, washed, isolated and then pipetted into another vessel for re-cell division. This process is called passenger and usually done by hand. He is relatively expensive and expensive.
  • the cells change after each passage, their phenotype and their specific properties. That is, they dedifferentiate and develop from a more differentiated stage with very specific properties, such as: As skin cells or liver cells, too nonspecific and ultimately for
  • the same medical test which is performed once on a cell culture of an older and once on a cell culture of a younger generation, can give different results. Therefore, the tests made on the known cell cultures are reproducible only for a very short period of a few days, as the cell culture changes over time.
  • Another disadvantage of cells that constantly divide is that the cells are in a condition that differs significantly from the situation in a tissue of an adult organism.
  • Cell division in an adult body is a relatively rare event. It usually occurs only after tissue loss and usually goes with one
  • a method for producing a cell culture from human or animal cells, in particular from mammalian cells, for carrying out medical or pharmacological tests comprises at least the following steps:
  • the cell is tested on the basis of metabolic parameters whether and when the cells have reached their characteristic state and - Supplying a drug to be tested to the on-substrate cell culture.
  • the cell culture is preferably maintained at about 37 ° C.
  • the cells cover the substrate so tightly that the outer membranes of the cells touch each other completely, the cells stop dividing.
  • the cells need a certain amount of time to change and reach a so-called dormant phenotype.
  • dormant refers only to the fact that there are no more dramatic changes in shape as in cell division.For biochemical reasons, these cells are very active and produce factors that are typical for their differentiation state microbially produced cellulose stable for at least several weeks.
  • the cells may be slow to storage or for transport
  • the cell culture is preferably prepared from stem cells or from cells obtained from stem cells, such. Liver, heart or kidney cells, or cells other organs, such as B. the skin.
  • stem cells such as Liver, heart or kidney cells, or cells other organs, such as B. the skin.
  • a medical or pharmacological test can thus be carried out on known, well-defined cells.
  • these cells may be e.g. Example, by means of a method, as it is known from US 20030161818A1 or US 2003 015 45 06 A1.
  • the stem cells are obtained from human umbilical tissue.
  • the stem cells are located in the so-called substantia gelatinea funiculi umbilicalis, a gelatinous matrix rich in hyaluronic acids and chondroitin sulfates, also called “wharton's jelly", which is extracted by an enzymatic process (eg collagenase).
  • for. B. cells are used, which come directly from affected patients, creating a
  • the cells applied to the cellulose substrate are preferably those cells which have not previously been passaged.
  • the cell culture thus arises according to the invention by a unique cell division and growth process of original, so-called.
  • Primary cells such.
  • stem cells or derived cells that have not gone through a dedifferentiation process That is, the cells applied to the cellulose substrate are preferably cells having a zero passage number.
  • the transport can rather be done at ambient temperature, such. B. between 15 ° C and 30 ° C.
  • the temperature can also be higher or lower.
  • the ambient temperature is within the desired range, e.g. B. between 15 ° C and 30 ° C, it is sufficient to allow the cell culture to cool easily (without using a cooling device).
  • the cell culture could also be active, ie by means of a cooling device to be cooled down to the desired temperature.
  • the vessel is provided with a hermetic seal, e.g. a foil or a lid provided.
  • the hermetic seal is intended to prevent the entry or exit of media such as liquid or gas from or into the vessel.
  • the sealing of the vessel can in principle be carried out before or after cooling, but is preferably before
  • the vessel is sealed with a foil, e.g. is welded or glued to the vessel.
  • a lid could be provided which closes off the vessel.
  • the vessel with the cell culture therein can finally be packaged, then z. B. to a laboratory or a customer, who then performs the medical or pharmacological tests on the cell culture.
  • the packaging may comprise, for example, a box and optionally insulating material.
  • the packaging may also include a coolant.
  • the nutrient solution can be mixed, for example, with methyl cellulose, polyethylene glycol or another viscosity-increasing substance.
  • a higher-viscosity substance such as B. a gel-like substance are introduced into the vessel. But it could also be a solid, such. B. a body of microcrystalline cellulose can be placed on the cell culture. As a result, the cell culture is mechanically held on the bottom of the vessel and can only be difficult to tilt to the side or float.
  • the cells of the cell culture are not passaged, ie the cell lawn is preferably not detached and the cells are not separated as in the prior art and then applied again to another substrate for re-cell division. Rather, the cell culture is preferably prepared by a unique cell division and growth process from original cells, ie, cells that have not previously been passaged.
  • the cell culture is preferably packaged in the same vessel in which it has been cultured and optionally sent to a recipient. It does not have to be transferred to another vessel.
  • the above method is performed on a microtiter plate having a plurality of wells.
  • a substrate of microbially produced cellulose is inserted, filled in a nutrient solution and applied to the substrate or human or animal cells. Thereafter, the cells grow and divide until at least partially covering the substrate.
  • each cell of the microtiter plate contains a part of the same cell culture. The individual subcultures can then be used to perform the same or different medical or pharmacological tests.
  • the storage or transport of the cell culture is preferably carried out at
  • the entire microtiter plate is preferably sealed with a hermetic
  • the invention also relates to a microtiter plate having a plurality of wells, each filled with a substrate made of microbial cellulose which is populated by a cell culture.
  • the microtiter plate is located
  • a substance which is arranged on the cell culture and has a higher viscosity than the nutrient solution is contained in the individual wells of the microtiter plate.
  • the cell culture is held together with the substrate mechanically at the bottom of the vessel and can only be difficult to tilt to the side or float.
  • the invention also relates to a use of a cell culture from human or animal cells, in particular mammalian cells, which has been prepared according to one of the methods described above, for carrying out medical or pharmacological tests.
  • Fig. 1 a - 1 h different states of a method for producing a
  • Fig. 2 is a microtiter plate with several wells in which
  • Figures 1 a-1 h show various states of a method for
  • the cell culture 9 can later be used to perform medical or pharmacological tests.
  • Nutrient solution 2 filled (Fig. 1 a).
  • nutrient solution 2 for example, the nutrient medium of Schramm and Hestrin described in Biochemical Journal 58 of 1954, pages 345-352 can be used.
  • the nutrient solution may, for example, consist of 20 g of glucose, 5 g of yeast extract, 5 g of bactopeptone, 2.7 g of sodium phosphate and 1.15 g Citric acid monohydrate and 0.5 g of magnesium sulfate heptahydrate in one liter of water.
  • other nutrient solutions known in the art may also be used.
  • a substrate 3 made of microbial cellulose which may for example have the form of a platelet, is then placed in the vessel 1 (FIG. 1 b).
  • the two steps described above can also be performed in reverse order.
  • a substrate 3 of microcrystalline cellulose can be produced, for example, by means of a method as known from DE 10 2008 056 413.3 or WO 2010 052 019 A2.
  • microcrystalline cellulose are well known in the art.
  • a suspension of human or animal cells 4 is finally introduced into the vessel 1.
  • the applied to the substrate 3 cells can, for. B. stem cells or cells derived from stem cells, such as. As liver, heart or kidney cells, or cells of other organs, such as. B. the skin.
  • the cells 4 can z.
  • Example be prepared by a method, as it is known from US 02013025983A1, US 6410320B1 or US 7534607B1.
  • the cells 4 applied to the cellulose substrate are preferably those cells which have not previously been passaged.
  • the cell culture 9 thus arises from a unique cell division and growth process of original cells that have not undergone a dedifferentiation process. That is, the cells 4 applied to the cellulose substrate 3 are preferably cells having a passage number equal to zero.
  • the cells 4 then sediment in the nutrient solution 2 and settle on the surface of the cellulose substrate 3. At temperatures around 37 ° C then takes place a division and growth process, which forms on the substrate 3 within a few days, a so-called cell lawn 5, which completely covers the substrate 3, as shown in Fig. 1 d. Once the cell lawn 5 has reached the desired size and thickness, the cell division and growth process stops.
  • the vessel 1, including its contents, is then cooled to a lower temperature. According to a preferred embodiment of the invention, the vessel is allowed to cool to room temperature, e.g. B. to about 18 ° C to 25 ° C. It has been found that the cell culture 9 at these temperatures over several weeks, z. B.
  • an agent 10 increasing the viscosity of the nutrient solution 2 such as e.g. Methyl cellulose or polyethylene glycol (PEG) are added. This results after the addition of the agent 10
  • Cellulose can be placed on the cell culture 9. This can be prevented that the substrate 3 lifts off together with the cell culture 9 from the bottom of the vessel 1 and z. B. tilts or floats to the side. In a further step 1f, the vessel 1 can still be hermetically sealed
  • the hermetic seal 6 may be, for example, a foil which may be e.g. can be welded or glued to the vessel 1.
  • a lid with a seal could be provided.
  • the vessel 1 is finally packed in step 1 g.
  • the vessel 1 is packed in a box 12 and additionally protected by a filler 13 against mechanical shocks and damage.
  • the cell culture 9 is preferably shipped in the same vessel 1 in which it has also been cultivated.
  • FIG. 1 h also shows how a substance 14 to be tested is applied to the cell culture 9, while the cell culture 9 is still located on the substrate 3. The reaction of the cells to the substance is then diagnosed.
  • FIG. 2 shows a microtiter plate 8 with a plurality of wells 7, each serving as a vessel 1 according to FIGS. 1 a to 1 g.
  • a substrate 3 of microcrystalline cellulose which is populated by a cell culture 9.
  • the preparation of the cell cultures 9 can be produced simultaneously in accordance with the method steps shown in FIGS. 1a to 1d.
  • the microtiter plate 8 is cooled to room temperature and z. B. closed by means of a film 6, as shown in Fig. 1f. In each of the wells 7 is then part of the same cell culture.
  • microtiter plate 8 If the microtiter plate 8 is to be shipped, it is packed in a further step according to FIG. 1 g. The customer thus receives one

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer Zellkultur (9) aus menschlichen oder tierischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen, zum Durchführen medizinischer oder pharmakologischer Tests. Gemäß der Erfindung umfasst das Verfahren wenigstens die folgenden Schritte: Einlegen eines Substrats (3) aus mikrobiell hergestellter Zellulose in ein Gefäß (1); Einfüllen einer Nährstofflösung (2) in das Gefäß (1); Aufbringen von menschlichen oder tierischen Zellen (4) auf das Substrat (3); Temperieren des Gefäßinhalts auf etwa Körpertemperatur; und Warten, bis das Substrat (3) komplett von einem Zellrasen (5) bedeckt ist, d.h. Konfluenz erreicht wurde. An der so hergestellten Zellkultur (9) können dann medizinische oder pharmakologische Tests durchgeführt werden.

Description

Beschreibung
Verfahren und Vorrichtung zum Herstellen einer Zellkultur aus menschlichen oder tierischen Zellen
Stand der Technik Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer Zellkultur aus menschlichen oder tierischen Zellen gemäß dem Oberbegriff des
Patentanspruchs 1 , eine Mikrotiterplatte mit mehreren Näpfchen, die mit einer Zellkultur befüllt sind, gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 12, sowie eine Verwendung einer Zellkultur gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 14.
Medizinische oder pharmakologische Tests, bei denen die Wirkung bestimmter Wirkstoffe untersucht wird, werden in der Regel an Zellkulturen aus
menschlichen oder tierischen Säugetierzellen durchgeführt. Dabei wird die Zellkultur den zu testenden Stoffen ausgesetzt und die Reaktion der Zellen untersucht.
Für medizinische oder pharmakologische Tests werden heute in der Regel Zellkulturen verwendet, bei denen die Zellen auf einer Oberfläche, wie z.B. auf dem Boden eines Zellkulturgefäßes anhaften. Dazu wird eine Suspension aus menschlichen oder tierischen Zellen in ein Gefäß pipettiert, in dem eine
Nährlösung enthalten ist. Die Zellen sedimentieren dann in der Nährlösung und setzen sich am Boden des Gefäßes ab. Dort heften sie sich an und teilen sie sich mit einer Teilungsrate, die im Wesentlichen von den in der Nährlösung enthaltenen Wachstumsfaktoren abhängig ist. Nach wenigen Tagen bildet sich am Boden des Gefäßes ein sogenannter Zellrasen, der den Boden vollständig bedeckt. Dieser Zellrasen ist jedoch nur eine begrenzte Zeit stabil. Wenn die Zellen zu lange im Gefäß verbleiben - in der Regel nach einigen Tagen -heben sich die Zellen vom Boden des Gefäßes ab und sterben. Es ist daher erforderlich, in regelmäßigen Abständen eine sogenannte Passage
durchzuführen, bei der die Zellen vom Gefäßboden mittels eines Enzyms abgelöst, gewaschen, vereinzelt und dann in ein anderes Gefäß zur erneuten Zellteilung hinein pipettiert werden. Dieser Prozess wird Passagieren genannt und üblicherweise von Hand durchgeführt. Er ist relativ aufwendig und teuer. Darüber hinaus verändern die Zellen nach jeder Passage, ihren Phänotyp sowie ihre spezifischen Eigenschaften. D.h. sie dedifferenzieren und entwickeln sich von einem differenzierteren Stadium mit ganz spezifischen Eigenschaften, wie z. B. Hautzellen oder Leberzellen, zu unspezifischen und letztlich für
Untersuchungen ungeeignete Zellen. Prinzipiell gilt, dass Zellen einer jüngeren Passage (Tochtergeneration) üblicherweise weniger differenziert sind als Zellen einer älteren Passage (Elterngeneration). Nach mehreren Passagen haben die in der Suspension enthaltenen Zellen schließlich völlig andere Eigenschaften als die ursprünglichen Ausgangszellen.
Dies hat zur Folge, dass derselbe medizinische Test, der einmal an einer Zellkultur einer älteren und einmal an einer Zellkultur einer jüngeren Generation durchgeführt wird, unterschiedliche Ergebnisse liefern kann. Deshalb sind die an den bekannten Zellkulturen vorgenommenen Tests nur während eines sehr kurzen Zeitraums von wenigen Tagen reproduzierbar, da sich die Zellkultur im Laufe der Zeit verändert.
Ein weiterer Nachteil von Zellen, die sich ständig teilen ist, dass die Zellen sich damit in einem Zustand befinden, der sich erheblich von der Situation in einem Gewebe eines erwachsenen Organismus unterscheidet. Eine Zellteilung in einem erwachsenen Körper ist ein vergleichsweise sehr seltenes Ereignis. Es tritt zumeist nur nach Gewebeverlust auf und geht in der Regel mit einer
Entzündungsreaktion einher. Infolgedessen untersucht man bei diesen Zellen nicht den Normalzustand, sondern eigentlich eine Extremsituation. Diese Tatsache könnte erklären, warum bisher Testergebnisse, die unter Verwendung solcher Zellkulturen gewonnen wurden, oft wenig mit klinischen Befunden übereinstimmen.
Da es bisher nicht möglich war, ruhende Zellen für längere Zeit am Leben zu halten, hat sich im Gegensatz ein Trend entwickelt, besonders teilungsaktive Zellen für pharmakologische Tests zu verwenden und den
Beobachtungszeitraum zu verkürzen. Dies führt jedoch dazu, dass die Ergebnisse noch weniger aussagekräftiger werden, wie man sich unschwer aus dem oben Gesagten erklären kann.
Offenbarung der Erfindung
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen einer Zellkultur aus menschlichen oder tierischen Zellen zum Durchführen medizinischer und pharmakologischer Tests zu schaffen, mit dem eine Zellkultur hergestellt werden kann, die über einen längeren Zeitraum, insbesondere über mehrere Wochen, stabil ist. Dadurch wird es möglich, medizinische oder pharmakologische Tests im Abstand von mehreren Wochen an derselben Zellkultur durchzuführen. Darüber hinaus ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte, langzeitstabile Zellkultur zu schaffen, an der dann die gewünschten
medizinischen oder pharmakologischen Tests durchgeführt werden können.
Die genannten Aufgaben werden gemäß der Erfindung durch die in den unabhängigen Ansprüchen angegebenen Merkmale gelöst. Weitere
Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen einer Zellkultur aus menschlichen oder tierischen Zellen, insbesondere aus Säugetierzellen, zum Durchführen medizinischer oder pharmakologischer Tests, vorgeschlagen, das wenigstens folgende Schritte umfasst:
- Einlegen eines Substrats aus mikrobiell hergestellter Zellulose in ein Gefäß;
- Einfüllen einer Nährstofflösung in das Gefäß;
- Aufbringen von menschlichen oder tierischen Zellen auf das Substrat;
- Temperieren des Gefäßinhalts auf eine vorgegebene Temperatur,
insbesondere Körpertemperatur;
- Warten, bis das Substrat komplett mit einem Zellrasen bedeckt ist, d.h. dass sich alle Zellen berühren und aufgehört haben, sich zu teilen (das kann, je nach Anfangskonzentration und Zellart wenige Tage bis mehrere Wochen dauern);
- Vorzugsweise wird anhand von Stoffwechsel-Parametern getestet, ob und wann die Zellen den für sie charakteristischen Zustand erreicht haben und - Zuführen eines zu testenden Wirkstoffs zu der auf dem Substrat befindlichen Zellkultur.
Nach dem Aufbringen der menschlichen oder tierischen Zellen auf das Substrat aus mikrokristalliner Zellulose kommt es zu einem Zellteilungs- und
Wachstumsprozess, bei dem das Substrat zunehmend von Zellen bedeckt wird. Dieser Prozess läuft bei Körpertemperatur, also bei etwa 37°C, optimal ab. Während des Zellteilungs- und Wachstumsprozesses wird die Zellkultur daher vorzugsweise auf etwa 37°C gehalten. Wenn die Zellen das Substrat so dicht bedecken, dass die äußeren Membranen der Zellen sich lückenlos gegenseitig berühren, hören die Zellen auf, sich zu teilen. Nach Einstellung des
Teilungsprozesses benötigen die Zellen eine gewisse Zeit, sich umzustellen und einen sog. ruhenden Phänotyp zu erreichen. Der Ausdruck„ruhend" bezieht sich hierbei nur darauf, dass keine dramatischen Formveränderungen wie bei der Zellteilung mehr ablaufen. Biochemisch sind diese Zellen sehr aktiv und produzieren z.B. Faktoren, die für ihren Differenzierungszustand typisch sind. In diesem Zustand ist die Zellkultur auf dem Substrat aus mikrobiell hergestellter Zellulose mindestens über mehrere Wochen stabil.
Bezüglich der einzelnen Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens ist zu betonen, dass diese nicht unbedingt in der angegebenen Reihenfolge ausgeführt werden müssen. So kann beispielsweise das Aufbringen von menschlichen oder tierischen Zellen auf das Substrat auch vor dem Einfüllen einer Nährstofflösung in das Gefäß erfolgen. Wahlweise könnte auch die Nährstofflösung zuerst in das Gefäß eingefüllt und danach erst das Substrat eingelegt werden. Dem Fachmann ist klar, dass er die Abfolge der einzelnen Schritte in einem gewissen Rahmen nach Wunsch festlegen kann.
Die Zellen können zur Lagerung oder für den Transport langsam auf
Raumtemperatur von z. B. 15°-30°C, insbesondere 18°-25°C abgekühlt werden.
Es ist nicht notwendig, die Zellkultur zur Lagerung oder für den Transport einzufrieren, da sie auch bei Raumtemperatur stabil bleibt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Zellkultur vorzugsweise aus Stammzellen oder aus Zellen hergestellt, die aus Stammzellen gewonnen wurden, wie z. B. Leber-, Herz- oder Nierenzellen, oder Zellen anderer Organe, wie z. B. der Haut. Ein medizinischer bzw. pharmakologischer Test kann somit an bekannten, genau definierten Zellen durchgeführt werden. Im Falle von aus Stammzellen gewonnenen Zellen können diese Zellen z. B. mit Hilfe eines Verfahrens hergestellt werden, wie es aus der US 20030161818A1 oder der US 2003 015 45 06 A1 bekannt ist. Hierbei werden die Stammzellen aus menschlichen Nabelschnurgewebe gewonnen. Die Stammzellen befinden sich in der sog. substantia gelatinea funiculi umbilicalis, einer gelatinösen Matrix, reich an Hyaluronsäuren und Chondroitinsulfaten, auch„Wharton's Jelly" genannt. Die Extraktion erfolgt über einen enzymatischen Prozess (z.B. mit Hilfe von Collagenase).
Alternativ können natürlich auch solche Zellen verwendet werden, die direkt einem menschlichen oder tierischen Körper entnommen wurden. Dies geschieht z.B. über eine Biopsie aus dem Knochenmark oder aus dem Fettgewebe.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung können z. B. Zellen eingesetzt werden, die direkt aus betroffenen Patienten stammen, wodurch eine
personalisierte Therapie möglich wird.
Die auf das Zellulosesubstrat aufgebrachten Zellen sind vorzugsweise solche Zellen, die zuvor nicht bereits passagiert worden sind. Die Zellkultur entsteht also erfindungsgemäß durch einen einmaligen Zellteilungs- und Wachstumsprozess aus originären, sog. primären Zellen, wie z. B. Stammzellen oder daraus gewonnen Zellen, die keinen Dedifferenzierungsprozess durchlaufen haben. D.h., bei den auf das Zellulosesubstrat aufgebrachten Zellen handelt es sich vorzugsweise um Zellen mit einer Passagezahl gleich Null. Wahlweise könnten aber auch Zellen mit einer Passagezahl von kleiner gleich fünf verwendet werden.
Für den Transport ist es nicht nötig, die Zellen, wie sonst üblich, einzufrieren; der Transport kann vielmehr bei Umgebungstemperatur erfolgen, wie z. B. zwischen 15°C und 30°C. Die Temperatur kann aber auch höher oder niedriger sein.
Wenn die Umgebungstemperatur im gewünschten Bereich liegt, z. B. zwischen 15 °C und 30°C, ist es ausreichend, die Zellkultur einfach abkühlen zu lassen (ohne Verwendung einer Kühleinrichtung). Die Zellkultur könnte aber auch aktiv, d.h. mittels einer Kühleinrichtung, auf die gewünschte Temperatur herunter gekühlt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Gefäß mit einem hermetischen Verschluss, wie z.B. einer Folie oder einem Deckel versehen. Der hermetische Verschluss soll insbesondere das Eintreten oder Austreten von Medien, wie beispielsweise Flüssigkeit oder Gas aus dem bzw. in das Gefäß verhindern. Das Abdichten des Gefäßes kann prinzipiell vor oder nach dem Abkühlen durchgeführt werden, wird aber vorzugsweise vorher
durchgeführt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Gefäß mit einer Folie abgedichtet, die z.B. mit dem Gefäß verschweißt oder verklebt wird. Alternativ oder zusätzlich könnte auch ein Deckel vorgesehen sein, der das Gefäß abschließt.
Das Gefäß mit der darin befindlichen Zellkultur kann schließlich noch verpackt werden, um es anschließend z. B. an ein Labor oder einen Kunden schicken zu können, der dann die medizinischen oder pharmakologischen Tests an der Zellkultur durchführt. Die Verpackung kann beispielsweise eine Schachtel und gegebenenfalls Dämmmaterial umfassen. Die Verpackung kann auch ein Kühlmittel umfassen.
Um die Zellkultur nach deren Herstellung insbesondere für einen nachfolgenden Transport per Post, oder allgemein gegen mechanische Belastungen und Stöße zu schützen, wird vorgeschlagen, einen die Viskosität der Nährstofflösung erhöhenden Stoff oder einen Stoff mit einer höheren Viskosität als die
Nährstofflösung in das Gefäß hinein zu geben. Gemäß der ersten Alternative kann die Nährstofflösung beispielsweise mit Methylzellulose, Polyethylenglykol oder einem anderen, die Viskosität erhöhenden Stoff, versetzt werden. Gemäß der zweiten Alternative könnte auch eine höher viskose Substanz, wie z. B. eine gelartige Substanz in das Gefäß eingebracht werden. Es könnte aber auch ein Feststoff, wie z. B. ein Körper aus mikrokristalliner Zellulose auf die Zellkultur aufgesetzt werden. Dadurch wird die Zellkultur mechanisch am Boden des Gefäßes festgehalten und kann nur noch schwer zur Seite kippen oder aufschwimmen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen der Zellkultur nicht passagiert, d.h. der Zellrasen wird vorzugsweise nicht abgelöst und die Zellen werden nicht wie im Stand der Technik vereinzelt und danach wieder auf ein anderes Substrat zur erneuten Zellteilung aufgebracht. Die Zellkultur wird vielmehr vorzugsweise durch einen einmaligen Zellteilungs- und Wachstumsprozess aus originären Zellen, d.h. Zellen, die zuvor nicht passagiert worden sind, hergestellt.
Die Zellkultur wird vorzugsweise in demselben Gefäß in dem sie gezüchtet worden ist, verpackt und gegebenenfalls an einen Empfänger verschickt. Sie muss also nicht in ein anderes Gefäß umgefüllt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das vorstehend genannte Verfahren an einer Mikrotiterplatte durchgeführt, die eine Vielzahl von Näpfchen aufweist. In jedes der Näpfchen wird ein Substrat aus mikrobiell hergestellter Zellulose eingelegt, eine Nährstofflösung eingefüllt und menschliche oder tierische Zellen auf das Substrat aufgebracht. Danach wachsen und teilen sich die Zellen, bis sie das Substrat wenigstens teilweise bedeckt haben. In den einzelnen Näpfchen der Mikrotiterplatte befindet sich schließlich jeweils ein Teil derselben Zellkultur. Die einzelnen Teilkulturen können dann dazu verwendet werden, denselben oder unterschiedliche medizinische bzw. pharmakologische Tests durchzuführen.
Die Lagerung oder der Transport der Zellkultur erfolgt vorzugsweise bei
Umgebungstemperatur. Ein Einfrieren der Zellkultur, wie bislang üblich, ist nicht erforderlich.
Die gesamte Mikrotiterplatte wird vorzugsweise mit einem hermetischen
Verschluss versehen, wie vorstehend beschrieben. Sie kann schließlich noch verpackt und verschickt werden.
Die Erfindung betrifft auch eine Mikrotiterplatte mit mehreren Näpfchen, die jeweils mit einem aus mikrobieller Zellulose hergestelltem Substrat, das von einer Zellkultur besiedelt ist, befüllt sind. Die Mikrotiterplatte befindet sich
vorzugsweise auf etwa Umgebungstemperatur und wird weder gekühlt noch erwärmt. Sie könnte zur Aufbewahrung aber auch auf Temperaturen unterhalb der Zimmertemperatur, z. B. auf 5°C bis 10°C abgekühlt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist in den einzelnen Näpfchen der Mikrotiterplatte ein Stoff enthalten, der auf der Zellkultur angeordnet ist und eine höhere Viskosität aufweist als die Nährstofflösung.
Dadurch wird die Zellkultur mitsamt dem Substrat mechanisch am Boden des Gefäßes festgehalten und kann nur noch schwer zur Seite kippen oder aufschwimmen.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch noch eine Verwendung einer Zellkultur aus menschlichen oder tierischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen, die gemäß einem der vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, zur Durchführung medizinischer oder pharmakologischer Tests.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der beigefügten Zeichnungen beispielhaft näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 a - 1 h verschiedene Zustände eines Verfahrens zum Herstellen einer
Zellkultur aus menschlichen oder tierischen Zellen gemäß einer Ausführungsform der Erfindung; und
Fig. 2 eine Mikrotiterplatte mit mehreren Näpfchen, in denen sich
jeweils eine gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Zellkultur befindet.
Die Figuren 1 a-1 h zeigen verschiedene Zustände eines Verfahrens zum
Herstellen einer Zellkultur 9 aus menschlichen oder tierischen Zellen. Die Zellkultur 9 kann später zum Durchführen medizinischer oder pharmakologischer Tests verwendet werden.
Zum Herstellen der Zellkultur 9 wird zunächst ein Gefäß 1 mit einer
Nährstofflösung 2 befüllt (Fig. 1 a). Als Nährlösung 2 kann beispielsweise das im Biochemical Journal 58 von 1954, Seiten 345-352 beschriebene Nährmedium von Schramm und Hestrin verwendet werden. Die Nährlösung kann z.B. aus 20 g Glukose, 5 g Hefeextrakt, 5 g Bactopepton, 2,7 g Natriumphosphat und 1 ,15 g Zitronensäure-Monohydrat und 0,5 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat in einem Liter Wasser umfassen. Alternativ können auch andere aus dem Stand der Technik bekannte Nährstofflösungen verwendet werden.
Als nächster Schritt wird dann ein aus mikrobieller Zellulose hergestelltes Substrat 3, das beispielsweise die Form eines Plättchens aufweisen kann, in das Gefäß 1 hinein gelegt (Fig. 1 b). Die beiden vorstehend beschriebenen Schritte können auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden. Ein Substrat 3 aus mikrokristalliner Zellulose kann beispielsweise mittels eines Verfahrens hergestellt werden, wie es aus der DE 10 2008 056 413.3 oder der WO 2010 052 019 A2 bekannt ist. Andere Herstellungsverfahren zum Herstellen
mikrokristalliner Zellulose sind aus dem Stand der Technik hinreichend bekannt.
In Fig. 1 c wird schließlich eine Suspension aus menschlichen oder tierischen Zellen 4 in das Gefäß 1 eingebracht. Die auf das Substrat 3 aufgebrachten Zellen können z. B. Stammzellen oder Zellen sein, die aus Stammzellen gewonnen wurden, wie z. B. Leber-, Herz- oder Nierenzellen, oder Zellen anderer Organe, wie z. B. der Haut. Die Zellen 4 können z. B. mit Hilfe eines Verfahrens hergestellt werden, wie es aus der US 02013025983A1 , US 6410320B1 oder der US 7534607B1 bekannt ist. Alternativ können natürlich auch solche Zellen 4 verwendet werden, die direkt einem menschlichen oder tierischen Körper entnommen wurden.
Die auf das Zellulosesubstrat aufgebrachten Zellen 4 sind vorzugsweise solche Zellen, die zuvor nicht bereits passagiert worden sind. Die Zellkultur 9 entsteht also durch einen einmaligen Zellteilungs- und Wachstumsprozess aus originären Zellen, die keinen Dedifferenzierungsprozess durchlaufen haben. D.h., bei den auf das Zellulosesubstrat 3 aufgebrachten Zellen 4 handelt es sich vorzugsweise um Zellen mit einer Passagezahl gleich Null.
Die Zellen 4 sedimentieren dann in der Nährstofflösung 2 und setzen sich auf der Oberfläche des Zellulose-Substrats 3 ab. Bei Temperaturen um die 37°C findet dann ein Teilungs- und Wachstumsprozess statt, wobei sich auf dem Substrat 3 innerhalb weniger Tage ein sogenannter Zellrasen 5 bildet, der das Substrat 3 vollständig bedeckt, wie in Fig. 1 d zu sehen ist. Sobald der Zellrasen 5 die gewünschte Größe und Dicke erreicht hat, stoppt der Zellteilungs- und Wachstumsprozess. Das Gefäß 1 einschließlich seines Inhalts wird dann auf eine niedrigere Temperatur abgekühlt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Gefäß auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, z. B. auf etwa 18°C bis 25°C. Es hat sich gezeigt, dass die Zellkultur 9 bei diesen Temperaturen über mehrere Wochen hinweg, z. B. über drei, vier oder auch mehr Wochen stabil bleibt und die Zellen insbesondere nicht absterben. An den Zellen können nun je nach Art der Zellen Tests durchgeführt werden, so z.B. Zugabe von Substanzen zur Blutgefäßneubildung an Endothelzellen, die Wirkung möglicher toxischer Substanzen auf Leberzellen, oder die Beeinflussung der Schlagfrequenz von Herzmuskelzellen.
Optional kann in einem weiteren Schritt 1 e ein die Viskosität der Nährstofflösung 2 erhöhendes Mittel 10, wie z.B. Methylzellulose oder Polyethylengykol (PEG) zugefügt werden. Das sich nach dem Hinzufügen des Mittels 10 ergebende
Medium ist in Fig. 1f mit dem Bezugszeichen 1 1 gekennzeichnet.
Anstelle des Mittels 10 oder zusätzlich könnte auch ein Stoff mit einer höheren Viskosität als die Nährstofflösung oder ein Festkörper auf die Zellkultur 9 aufgebracht werden. So könnte z. B. ein weiterer Körper aus mikrokristalliner
Zellulose auf die Zellkultur 9 aufgesetzt werden. Dadurch kann verhindert werden, dass sich das Substrat 3 zusammen mit der Zellkultur 9 vom Boden des Gefäßes 1 abhebt und z. B. zur Seite kippt oder aufschwimmt. In einem weiteren Schritt 1f kann das Gefäß 1 noch mit einem hermetischen
Verschluss 6 abgedichtet werden, um das Austreten bzw. Eindringen von Medium zu verhindern. Bei dem hermetischen Verschluss 6 kann es sich beispielsweise um eine Folie handeln, die z.B. mit dem Gefäß 1 verschweißt oder verklebt werden kann. Wahlweise könnte natürlich auch ein Deckel mit einer Dichtung (nicht gezeigt) vorgesehen sein.
Um die Zellkultur 9 einschließlich des Gefäßes 1 zu verschicken, wird das Gefäß 1 in Schritt 1 g schließlich noch verpackt. Im dargestellten Ausführungsbeispiel ist das Gefäß 1 in einer Schachtel 12 eingepackt und zusätzlich durch einen Füllstoff 13 gegenüber mechanischen Stößen und Beschädigungen geschützt. Gemäß der Erfindung wird die Zellkultur 9 vorzugsweise in demselben Gefäß 1 verschickt, in dem sie auch kultiviert worden ist.
Aus den einzelnen Verfahrensschritten 1 a bis 1 g wird deutlich, dass es nicht erforderlich ist, die Zellen der Zellkultur 9 zu passagieren, d.h. der Zellrasen 5 wird nicht vom Substrat 3 abgelöst, und die Zellen werden nicht vereinzelt und danach wieder auf ein anderes Substrat zur erneuten Zellteilung aufgebracht. Die Zellkultur 9 wird vielmehr in einem einzigen Wachstums- und Zellteilungsprozess hergestellt.
In Fig. 1 h ist schließlich noch dargestellt, wie eine zu testende Substanz 14 auf die Zellkultur 9 aufgebracht wird, während sich die Zellkultur 9 weiterhin auf dem Substrat 3 befindet. Die Reaktion der Zellen auf die Substanz wird dann diagnostiziert.
Fig. 2 zeigt eine Mikrotiterplatte 8 mit mehreren Näpfchen 7, die jeweils als Gefäß 1 entsprechend der Figuren 1 a bis 1 g dienen. In jedem der Näpfchen 7 befindet sich ein Substrat 3 aus mikrokristalliner Zellulose, das von einer Zellkultur 9 besiedelt ist. Die Herstellung der Zellkulturen 9 kann dabei entsprechend der in den Figuren 1 a bis 1 d gezeigten Verfahrensschritte gleichzeitig hergestellt werden.
Nachdem die einzelnen Zellkulturen 9 die gewünschte Größe erreicht haben, wird die Mikrotiterplatte 8 auf Raumtemperatur abgekühlt und z. B. mittels einer Folie 6 verschlossen, wie in Fig. 1f dargestellt ist. In jedem der Näpfchen 7 befindet sich dann ein Teil derselben Zellkultur.
Sofern die Mikrotiterplatte 8 verschickt werden soll, wird sie in einem weiteren Schritt entsprechend Fig. 1 g verpackt. Der Kunde erhält somit eine
Mikrotiterplatte mit einer fertigen, über viele Wochen stabilen Zellkultur 9, an der er die gewünschten medizinischen oder pharmakologischen Tests durchführen kann.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zum Herstellen einer Zellkultur (9) aus menschlichen oder
tierischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen, zum Durchführen medizinischer oder pharmakologischer Tests, umfassend folgende Schritte:
Einlegen eines Substrats (3) aus mikrobiell hergestellter Zellulose in ein Gefäß (1 );
Einfüllen einer Nährstofflösung (2) in das Gefäß (1 );
Aufbringen von menschlichen oder tierischen Zellen (4) auf das Substrat (3);
Temperieren des Gefäßinhalts auf eine vorgegebene Temperatur, vorzugsweise auf etwa Körpertemperatur; und
Warten, bis das Substrat (3) komplett von einem Zellrasen (5) bedeckt ist, die Zellen sich nicht mehr teilen und einen ruhenden Phänotyp angenommen haben.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkultur (9) nach deren Herstellung auf etwa Raumtemperatur abgekühlt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die
Zellkultur (9) vor dem Durchführen eines medizinischen oder
pharmakologischen Tests nicht eingefroren wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die auf das Substrat (3) aufgebrachten Zellen (4) Stammzellen oder aus Stammzellen gewonnene Zellen sind.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die auf das Substrat (3) aufgebrachten Zellen (4) zuvor nicht passagiert worden sind oder eine Passagezahl von kleiner gleich fünf und insbesondere kleiner gleich zwei aufweisen.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass das Gefäß (1 ) nach der Herstellung der Zellkultur (9) und vor der Durchführung des medizinischen oder pharmakologischen Tests mit einem hermetischen Verschluss versehen wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Zellen (4) nicht passagiert werden, d.h., der Zellrasen (5) wird nicht vom Substrat (3) abgelöst, und die Zellen (4) werden nicht vereinzelt und danach wieder auf ein Substrat (3) zur erneuten
Zellteilung aufgebracht.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Zellkultur (9) in demselben Gefäß (1 ), in dem sie gezüchtet wurde, verpackt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass das Verfahren an mehreren Gefäßen (1 , 7) gleichzeitig durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Gefäße
Näpfchen (7) einer Mikrotiterplatte (8) sind.
1 1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass ein die Viskosität der Nährstofflösung (2) erhöhender Stoff (10), oder ein Stoff mit einer höheren Viskosität als die Nährstofflösung (2) zusätzlich in das Gefäß (1 ,7) eingebracht wird.
12. Mikrotiterplatte (8) mit mehreren Näpfchen (7), die jeweils mit einem aus mikrobieller Zellulose hergestelltem Substrat (3), das von einer Zellkultur (9) besiedelt ist, befüllt sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkultur (9) Zellen umfasst, die zuvor nicht passagiert worden sind, und dass die einzelnen Näpfchen (7) hermetisch abgedichtet sind.
13. Mikrotiterplatte (8) nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich einen die Viskosität der Nährstofflösung (2) erhöhenden Stoff (10), oder einen Stoff mit einer höheren Viskosität als die Nährstofflösung (2) enthält, der auf der Zellkultur (9) angeordnet ist.
14. Verwendung einer Zellkultur (9) aus menschlichen oder tierischen Zellen (4), insbesondere Säugetierzellen, die gemäß einem vorstehend beanspruchten Verfahren hergestellt wurde, zur Durchführung medizinischer oder
pharmakologischer Tests.
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