CN105051182A - 对人体或动物细胞的细胞培养物进行制备的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对用来进行医学或药理学实验的人体或动物细胞，特别是哺乳动物细胞的细胞培养物(9)进行制备的方法。根据本发明，该方法至少包括以下步骤：将微生物制纤维素所制成的基底(3)插入器皿(1)中；将营养素溶液(2)加入器皿(1)中；将人体或动物细胞(4)贴附在基底(3)上；将器皿内容物温度调节至体温；并且等待，直到基底(3)完全被细胞集落(5)覆盖住，也就是说，实现融合为止。然后可以在用这种方法制备的细胞培养物(9)上进行医学或药理学实验。

Description

对人体或动物细胞的细胞培养物进行制备的方法和装置

现有技术

本发明涉及一种对权利要求1的前序部分所述的人体或动物细胞的细胞培养物进行制备的方法、一种根据将权利要求12的前序部分所述的带有若干个装有细胞培养物的深孔的微滴定培养板，以及一种根据将权利要求14的前序部分所述的细胞培养物的应用。

通常是在人类或动物类哺乳动物细胞的细胞培养物上进行对一定的生物活性物质的作用和效应进行研究的医学或药理学实验。将细胞培养物置于被试验的物质中并对细胞的反应进行分析研究。

如今通常会采用细胞培养物进行医学或药理学实验，细胞会附着在表面上，例如会粘附在细胞培养皿的底部。为此将人体或动物细胞的细胞悬液滴入到含有培养液的器皿中。然后细胞在培养液中沉淀和沉降在器皿的底部。在那里附着并且以主要与培养液中所含有的生长因子有关的分裂速率进行分裂。几天后，在器皿的底部形成所谓的细胞集落，该细胞集落将底部彻底覆盖住。然后这种细胞集落只在有限的时间里是性能稳定的。当细胞在器皿中停留时间过长时-通常是几天后-细胞会从底部脱附和死亡。因此有必要定期进行所谓的传代，会利用酶使细胞从器皿底部脱离下来、进行洗涤、分离和然后移液到另外一个器皿中重新进行

细胞分裂。这个过程被称为传代培养并且通常手动进行。它的成本相对高昂。此外，在经历每次传代后，细胞及其表型以及它的特性都会有所改变。也就是说，它们不再进行分化并且会从一个具有全部特性的分化阶段，例如皮肤细胞或肝细胞，而培育生长成非特殊性的和最终不适于进行分析研究的细胞。原则上适用的是，较新一代的细胞(子代细胞)通常比较老一代的细胞(原代细胞)的分化程度弱。经过若干次传代后，细胞悬液中所包含的细胞最终具有与原始种子细胞完全不同的特征。

后果是，时而在较老一代的细胞培养物，时而在较新一代的细胞培养物上进行的同一个实验可能会得出不同的实验结果。因此在已知的细胞培养物上所进行的实验只能在非常短的几天时间内是可复制的，因为细胞培养物会随着时间的推移而有所改变。

不断分裂的细胞的另一个缺点是，细胞会处在一个与生长中的生物体组织的状况有显著差异的状态中。生长中的机体里的细胞分裂是一个相对非常罕见的事件。它多半只是在组织缺损后才会发生和通常会随着炎症反应而出现。因此并不会对这些细胞的正常状态，而是会对极端情况进行检查研究。这些事实可以说明，为什么到目前为止利用这种细胞培养物所取得的实验结果经常很少是与临床检查结果相一致的。

因为到目前为止无法让静止的不分裂的细胞存活更长的时间，与之相反的是，会形成趋势，将特别是具有分裂活性的细胞用于药理学实验和缩短观察期。然而，正如从以上所述中不难解释的那样，这会导致结果更没有说服力。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种对用来进行医学和药理学实验的人体或动物细胞的细胞培养物进行制备的方法，可以通过该方法对细胞培养物进行制备，该细胞培养物可以在更长的时间里，特别是几星期里都保持性能稳定。因此可以在几星期的时间间隔里对同一个细胞培养物进行医学或药理学实验。此外，本发明要解决的问题是提供一种采用本发明所述方法进行制备的长时间稳定的细胞培养物，然后可以在该细胞培养物上进行所期望的医学或药理学实验。

根据本发明，通过独立权利要求所记载的特征解决了这个问题。可从从属权利要求中获悉本发明的其他实施方式。

根据本发明，建议采用一种对用来进行医学或药理学实验的人体或动物细胞，特别是哺乳动物细胞的细胞培养物进行制备的方法，该方法至少包括以下步骤：

-将微生物制纤维素所制成的基底插入器皿中；

-将营养素溶液加入器皿中；

-将人体或动物细胞贴附在基底上；

-将器皿内容物温度调节至所规定的温度，特别是调节至体温；

-等待，直到基底完全被细胞集落覆盖住，也就是说，所有细胞进行接触和停止进行分裂为止(视起始浓度和细胞种类而定，这可能持续几天至数周)；

-优选地，根据物质代谢-参数进行试验，对细胞是否和何时达到能反映出它的特征的状态进行检测并且

-将待试验的生物活性物质输入到位于基底上的细胞培养物中。

在将人体或动物细胞淀积在微晶纤维素基底之后，会进行细胞分裂和生长过程，在进行该过程时，基底会逐渐被细胞所覆盖。最优地，在体温，也就是在约37℃条件下进行这个过程。因此，优选地，在细胞分裂和生长过程中，将细胞培养物维持在约37℃的条件下。当细胞如此密集地覆盖在基底上，以至于细胞的外膜相互之间无缝隙地接触，细胞停止分裂。分裂过程停止后，细胞需要一定的时间来进行转化和实现所谓的静止的不分裂的表型。“静止的不分裂的”这个表达此处仅仅是指不再进行像细胞分裂时那样较大的形态改变。在生物化学方面，这些细胞非常有活性和能产生例如对于其分化状态来说是典型的因子。在这种状态下，细胞培养物在微生物制纤维素所制成的基底上数周内是性能稳定的。

在本发明所述方法的单个方法步骤方面应强调的是，不一定非得按照所给出的顺序来实施。例如可以在将营养素溶液加入器皿内之前就将人体或动物细胞贴附在基底上。可选择地，也可以先将营养素溶液加入器皿内和然后才插入基底。专业人员清楚，他可以在一定的范围内按照意愿对各个步骤的顺序作出规定。

为了进行储存或运输，可以缓慢地将细胞冷却至室温例如15°-30℃，尤其是18°-25℃。没有必要为了进行储存或运输而对细胞培养物进行冷冻，因为它们在室温下也能保持性能稳定。

根据本发明一种优选的实施方式，主要由干细胞或是由干细胞所获取的细胞、例如肝细胞、心肌细胞或肾细胞，或是例如皮肤等其他器官的细胞来制备细胞培养物。因此可以对已知的详细规定的细胞进行医学或药理学实验。在由干细胞所获取的细胞的情形下，例如可以借助在US20030161818A1或US20030154506A1中所公开的方法来对这些细胞进行制备。在这种情况下，可以由人体脐带组织来获取干细胞。干细胞位于所谓的人脐带华通胶中，一种胶冻样间质，富含透明质酸和硫酸软骨素，也叫“华通氏胶”(Wharton’sJelly)。可以通过一种酶消化过程(例如利用胶原酶)从脐带华通胶中提取干细胞。

二者择一地，当然也可以采用直接取自人体或动物体的这种细胞。例如这可通过对骨髓或脂肪组织进行活检来实现。根据本发明的一种实施方式，例如采用直接来源于有关患者的细胞，进而可以进行个性化治疗。

贴附在纤维素基底上的细胞主要是事先没有已经进行传代培养的这些细胞。根据本发明，通过一次性细胞分裂和生长过程从原始细胞，所谓的原代细胞，例如干细胞或是由干细胞所获取的没有经历分化过程的细胞来产生细胞培养物。也就是说，贴附在纤维素基底上的细胞主要是传代数等于零的细胞。可选地，但是也可以采用传代数小于等于五的细胞。

没有必要为了运输而像常见的那样对细胞进行冷冻；而是可以在环境温度下，例如在15°和30℃之间进行运输。但是温度也可以更高或是更低。

当环境温度在理想的范围内时，例如在15°和30℃之间时，让细胞培养物进行简单的冷却是够用的(没有使用冷却装置)。但是也可以主动地，也就是说，利用冷却装置将细胞培养物冷却降至所需要的温度。

根据本发明一种优选的实施方式，器皿配备有一个密封锁扣，例如一个薄膜或是一个顶盖。密封锁扣应尤其能防止例如液体或气体等培养基进入器皿中或是从器皿中逸出。原则上，可以在冷却之前或之后对器皿进行密封，但是以事先进行为宜。

根据本发明一种优选的实施方式，利用一个薄膜对器皿进行密封，该薄膜例如是与器皿焊接或粘合在一起的。二者择一地或者额外地也可以预先规定一个顶盖，该顶盖将器皿盖住。

为了然后能将其例如寄送给实验室或是客户，最后还可以对内部装有细胞培养物的器皿进行包装，该客户然后可以对细胞培养物进行医学或药理学实验。包装例如可以包括一个盒子和绝缘材料。包装也可以包括一种冷却剂。

为了特别是能通过邮寄对制备后的细胞培养物进行后续运输，或是保护其不遭受机械载荷和撞击，建议在器皿中加入一种能提高营养素溶液粘度的物质或是一种具有比营养素溶液更高粘度的物质。根据第一个二者择一的方案，例如可以在营养素溶液中掺入亚甲基纤维素、聚乙二醇或是其他能提高粘度的物质。根据第二个二者择一的方案，也可以在器皿中加入一种粘性更高的物质，例如一种冻胶状物质。但是也可以在细胞培养物上放置一个固体，例如一个微晶纤维素体。这样细胞培养物就可以粘附在器皿的底部和难以翻向一侧或是浮起。

根据本发明一种优选的实施方式，不对细胞培养物的细胞进行传代，也就是说，优先地，细胞集落不进行脱落和细胞并没有像现有技术那样进行分离和然后重新贴附在另一个基底上进行重新的细胞分裂。细胞培养物更优选为通过一次性细胞分裂和生长过程由原始细胞，也就是说由事前没有进行传代的细胞来进行制备。

优选地，在同一个对其进行培养的器皿中对细胞培养物进行包装和需要时，寄送给一个收件人。不必非得将它转装到其他器皿中。

根据本发明一种优选的实施方式，在一个微滴定培养板上进行前面已提到的方法，该微滴定培养板具有大量深孔。在每个深孔中插入有微生物制纤维素所制成的基底，加入有营养素溶液和将人体或动物细胞贴附在基底上。然后细胞进行生长和分裂，直到基底至少被部分覆盖住为止。在微滴定培养板的各个深孔中最终会分布有一部分同一种细胞培养物。然后可以采用各个部分培养物进行同一种或是不同的医学以及药理学实验。

细胞培养物的储存或运输优选地在环境温度下进行。没有必要像通常的那样，对细胞培养物进行冷冻。

如上所述，整个微滴定培养板优选地配备有一个密封锁扣。最终还可以对微滴定培养板进行包装和寄送。

本发明也涉及一种带有若干个深孔的微滴定培养板，该深孔中装入有一种由微生物制纤维素所制成的基底，一种细胞培养物在该基底上进行增殖。微滴定培养板优选地处在环境温度下和既不进行冷却，也不进行加热。但是也可以将它冷却到室温以下的温度，例如冷却到5℃至10℃。

根据本发明一种优选的实施方式，在微滴定培养板的各个深孔中含有一种属于细胞培养物的和具有比营养素溶液更高粘度的物质。这样细胞培养物就可以和基底一起粘附在器皿的底部和难以翻向一侧或是浮起。

此外，本发明还涉及一种用来进行医学或药理学实验的根据上述方法所制备的人体或动物细胞，特别是哺乳动物细胞的细胞培养物的应用。

下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。其中：

图1a-1h本发明一种实施方式所述人体或动物细胞的细胞培养物的制备方法的不同状态；和

图2带有若干个深孔的微滴定培养板，深孔中装有一种根据本发明所述方法制备的细胞培养物。

图1a-1h示出了一种人体或动物细胞的细胞培养物9的制备方法的不同状态。细胞培养物9日后可用于进行医学或药理学实验。

为了制备细胞培养物9，首先在器皿1中装入营养素溶液2(图1a)。例如可以将在1954年的《生物化学杂志58》(BiochemicalJournal58)，第345-352页中所描述的Schramm和Hestrin培养基用作营养液2。营养液在例如每升水中可以含有20g葡萄糖、5g酵母提取物、5g细菌蛋白胨、2.7g磷酸钠、1.15g一水柠檬酸和0.5g七水硫酸镁。二者择一地，也可以采用其他在现有技术中所公开的营养素溶液。

作为下一步，然后将由微生物制纤维素所制成的基底3放入器皿1中(图1b)，该基底例如可以具有片式形状。也可以按相反的顺序进行前面两项所述步骤。可以采用DE102008056413.3或WO2010052019A2所公开的方法对由微生物制纤维素所制成的基底3进行制备。现有技术对其他用于制备微生物纤维素的制备方法进行了充分的公开。

在图1c中，将人体或动物细胞4的细胞悬液加入器皿1中。贴附在基底3上的细胞可以是例如干细胞或是由干细胞所获取的细胞、例如肝细胞、心肌细胞或肾细胞，或是例如皮肤等其他器官的细胞。可以借助在US02013025983A1、US6410320B1或US7534607B1中所公开的方法来对细胞4进行制备。二者择一地，当然也可以采用直接取自人体或动物体的这种细胞4。

贴附在纤维素基底上的细胞4主要是事先没有已经进行传代培养的这些细胞。通过一次性细胞分裂和生长过程从没有经历分化过程的原始细胞来产生细胞培养物9。也就是说，贴附在纤维素基底3上的细胞4优选为是传代数等于零的细胞。

细胞4然后在营养素溶液2中沉降和淀积在微晶纤维素基底3的表面上。在约37℃条件下进行细胞分裂和生长过程，在进行该过程时，会在几天的时间里在基底3上形成所谓的细胞集落5，如图1d所示，基底3完全被该细胞集落覆盖住。

细胞集落5一达到所期望的尺寸和厚度，分裂和生长过程就会停止。然后将器皿1及其内容物冷却至更低的温度。根据本发明一种优选的实施方式，将器皿冷却至室温，例如18°-25℃。经证明，细胞培养物9在该温度下、能在几星期的时间里，例如3星期、4星期或更上时间都保持性能稳定和特别是细胞不会凋亡。现在可以视细胞的种类，在细胞上进行实验，例如针对肉皮细胞的血管瘤添加物质，可能的毒性物质对肝细胞的效应和作用，或者对心肌细胞的心率的影响。

最佳地，可以在另外一个步骤1e中添加一种可提高营养素溶液2的粘度的物质10，例如亚甲基纤维素或聚乙二醇(PEG)。在图1f中用参考标记11对添加物质10后所产生的培养基进行标识。

代替物质10或者额外地，也可以加入一种具有比营养素溶液更高粘度的物质或是在细胞培养物9上放置一个固体。例如可以在细胞培养物9上放置一个微晶纤维素体。这样可以避免基底3和细胞培养物9一起从器皿1的底部脱附和例如翻向一侧或是浮起。

在另外一个步骤1f中，还可以用一个密封锁扣6对器皿1进行密封，以防止培养基逸出或侵入。密封锁扣6例如可以是一个薄膜，该薄膜例如可以和器皿1焊接或粘合在一起。可选地，当然也可以预先规定一个带密封圈的顶盖(未示出)。

为了对包括器皿1在内的细胞培养物9进行寄送，还会最后在步骤1g中对器皿1进行包装。在显示的实施例中，将器皿1装入一个盒子12中和额外地通过一种填充料13来避免受到机械撞击和损伤。

根据本发明，优选地，在也对其进行培养的同一个器皿1中对细胞培养物9进行寄送。

从单个方法步骤1a至1g中可以看出，没有必要对细胞培养物9的细胞进行传代，也就是说，优先地，细胞集落5不从基底3上脱离，和细胞并没有进行分离和然后重新贴附在另一个基底上进行重新的细胞分裂。细胞培养物9更优选为通过唯一一次的细胞分裂和生长过程进行制备。

在图1h中还显示了，当细胞培养物9还在基底3上时，该如何将被检测的物质14贴附在细胞培养物9上。然后会对细胞对物质的反应进行诊断。

图2示出了带有若干个深孔7的微滴定培养板8，根据图1a至1g，该微滴定培养板可用作器皿1。在每个深孔7中装入有一种由微生物制纤维素所制成的基底3，一种细胞培养物9在该基底上进行增殖。可以根据图1a至1d所示的方法步骤同时对细胞培养物9进行制备。

在单个细胞培养物9达到所期望的尺寸大小后，将将微滴定培养板8冷却至室温和例如如图1f所示，利用一个薄膜6进行封闭。然后会在每个深孔7中分布有一部分同一种细胞培养物。

如果应对微滴定培养板8进行寄送，如图1g所示，会在另外一个步骤中对它进行包装。客户因此会收到一个装有制备好的在数周里性能稳定的细胞培养物9的微滴定培养板，他可以在该微滴定培养板进行所期望的医学或药理学实验。

Claims (14)

1.对用来进行医学或药理学实验的人体或动物细胞，特别是哺乳动物细胞的细胞培养物(9)进行制备的方法，包括以下步骤：

-将微生物制纤维素所制成的基底(3)插入器皿(1)中；

-将营养素溶液(2)加入器皿(1)内；

-将人体或动物细胞(4)贴附在基底(3)上；

-将器皿内容物温度调节至所规定的温度，特别是调节至体温；和

-等待，直到基底(3)完全被细胞集落(5)覆盖住，细胞不再进行分裂和具有静止的不分裂的表型为止。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将制备后的细胞培养物(9)冷却至室温。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在进行医学或药理学实验之前没有对细胞培养物(9)进行冷冻。

4.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于：贴附在基底(3)上的细胞(4)是干细胞或是由干细胞所获取的细胞。

5.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于：没有事先对贴附在基底(3)上的细胞(4)进行传代培养或者具有传代数小于等于五和特别是具有传代数小于等于二。

6.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于：在对细胞培养物(9)进行制备之后和进行医学或药理学实验之前，器皿(1)配备有一个密封锁扣。

7.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于：不对细胞(4)进行传代，也就是说，细胞集落(5)不从基底(3)上脱离，和细胞(4)并没有进行分离和然后重新贴附在基底(3)上进行重新的细胞分裂。

8.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于：在对其进行培养的同一个器皿(1)中对细胞培养物(9)进行包装。

9.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于：同时可在若干个器皿(1、7)上进行该方法。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：器皿是微滴定培养板(8)的深孔(7)。

11.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于：额外在器皿(1、7)中加入一种能提高营养素溶液(2)粘度的物质(10)或是一种具有比营养素溶液(2)更高粘度的物质。

12.带有若干个深孔(7)的微滴定培养板(8)，该深孔中装入有一种由微生物制纤维素所制成的基底(3)，一种细胞培养物(9)在该基底上进行增殖，其特征在于：细胞培养物(9)包括事先没有进行传代培养的细胞和各个深孔(7)是密封的。

13.根据权利要求12所述的微滴定培养板(8)，其特征在于：它额外含有一种能提高营养素溶液(2)粘度的物质(10)或者一种属于细胞培养物(9)的和具有比营养素溶液(2)更高粘度的物质。

14.用来进行医学或药理学实验的根据上述一种方法所制备的人体或动物细胞(4)，特别是哺乳动物细胞的细胞培养物(9)的应用。