DE102012201475A1

DE102012201475A1 - Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE102012201475A1
Application number: DE102012201475A
Authority: DE
Inventors: Joachim Stehr; Federico Bürsgens; Lars Ullerich
Original assignee: GNA Biosolutions GmbH
Current assignee: HP Health Solutions Germany GmbH
Priority date: 2012-02-01
Filing date: 2012-02-01
Publication date: 2013-08-01
Anticipated expiration: 2032-02-02
Also published as: DE102012201475B4; RU2603253C2; ES2596452T3; US20160281139A1; CN104093860A; WO2013113910A1; EP2809806B1; CN107604052A; EP2809806A1; CA2862912A1; PL2809806T3; US20140377764A1; AU2013214098A1; US9382583B2; AU2013214098B2; EP3101143B1; EP3101143A1; BR112014018737A2; CA2862912C; JP2015511124A

Abstract

Ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren (1), in dem Nanopartikel (8) in einem Reaktionsvolumen (2) durch Anregung Wärme an ihre Umgebung übertragen.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren.
Hintergrund der Erfindung
Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Patentschrift US 4 683 202 offenbart ein Verfahren, mit dem mindestens eine spezifische Nukleinsäuresequenz aus einer Nukleinsäure oder aus einem Gemisch von Nukleinsäuren vervielfältigt werden kann, wobei jede Nukleinsäure aus zwei getrennten, komplementären Strängen, von gleicher oder ungleicher Länge, besteht. Das Verfahren umfasst: (a) Das Behandeln der Stränge mit zwei Primern für jede unterschiedliche spezifische Sequenz, die vervielfältigt wird, unter derartigen Bedingungen, dass für jede unterschiedliche Sequenz, die vervielfältigt wird, ein Extensionsprodukt für jeden Primer synthetisiert wird, das komplementär zu dem jeweiligen Nukleinsäurestrang ist; dabei werden besagte Primer so ausgewählt, dass sie im Wesentlichen komplementär zu unterschiedlichen Strängen jeder spezifischen Sequenz sind, so dass das Extensionsprodukt, das aus einem Primer synthetisiert wird, wenn es von seinem Komplement getrennt ist, als eine Vorlage für die Synthese des Extensionsprodukts des anderen Primers dienen kann; (b) das Trennen der Primer-Extensionsprodukte von den Vorlagen, an denen sie synthetisiert wurden, so dass einzelsträngige Moleküle entstehen; (c) das Behandeln der einzelsträngigen Moleküle aus dem Schritt (b) mit den Primern aus Schritt (a) unter derartigen Bedingungen, dass ein Primer-Extensionsprodukt synthetisiert wird, wobei jeder der Einzelstränge aus Schritt (b) als Vorlage verwendet wird. Die Schritte können nacheinander oder gleichzeitig ausgeführt werden. Zudem können die Schritte (b) und (c) wiederholt werden bis das erwünschte Ausmaß der Sequenz-Vervielfältigung erreicht ist. In dem Fall, dass in dem Verfahren die Schritte (a) und (c) mit Hilfe einer Polymerase ausgeführt werden, wird das Verfahren gewöhnlich als Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bezeichnet.
In der Internationalen Offenlegungsschrift WO 2007/143034 A1 werden Verfahren offenbart, die zur Durchführung einer PCR geeignet sein sollen. Die Verfahren können die Benutzung einer optischen Strahlenquelle zur Erhitzung in einer PCR umfassen. Die Verfahren können auch die Verwendung der Oberflächenplasmonenresonanz oder des Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers zur Überwachung einer PCR in Echtzeit einschließen. Die Verfahren können weiterhin die Immobilisierung eines Templates, Primers oder einer Polymerase auf einer Oberfläche wie Gold oder einer anderen Oberfläche, die in Bezug auf die Oberflächenplasmonenresonanz aktiv ist, umfassen.
Die Patentanmeldung US 2002/0061588 A1 offenbart Verfahren, um Nukleinsäuren lokal und direkt auf ein externes Signal ansprechbar zu machen. Das Signal wirkt nur auf eine oder mehrere spezifische lokalisierte Anteile der Nukleinsäure. Gemäß der Erfindung kann das Signal die Eigenschaften einer spezifischen Nukleinsäure und dadurch auch ihre Funktion verändern. Dementsprechend stellt die Erfindung Verfahren bereit, die die Struktur und Funktion einer Nukleinsäure in einer biologischen Probe regeln, ohne andere Bestandteile der Probe zu beeinflussen. In einer Ausführungsform transferiert ein Modulator Hitze auf eine Nukleinsäure oder einen Teil einer Nukleinsäure, was z. B. darin resultiert, dass inter- oder intramolekulare Bindungen destabilisiert werden und sich die Struktur und Stabilität der Nukleinsäure ändert. Bevorzugte Modulatoren schließen Metallnanopartikel, halbleitende Nanopartikel, magnetische Nanopartikel, Oxidnanopartikel und Chromophore ein. Es wird auch angeregt, diese Verfahren in Zusammenhang mit einer PCR zu verwenden. Insbesondere wird vorgeschlagen, eine PCR-Reaktion mit einem Modulator zu steuern.
Die Patentanmeldung US 2003/0143604 A1 betrifft die Verwendung von Nanopartikel-Detektions-Sonden zur Überwachung von Vervielfältigungsreaktionen, insbesondere PCR. Vornehmlich beschäftigt sich die Patentanmeldung mit der Verwendung von Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten, die mit einem Schutzreagens, wie bovines Serumalbumin, behandelt sind, um ein Target-Polynukleotid quantitativ und qualitativ zu detektieren. Die Patentanmeldung offenbart eine Nukleinsäure-Vervielfältigung und -Detektion unter Verwendung von Gold-Nanopartikel-Primern. In einem ersten Schritt wird dabei das Nukleinsäure-Target denaturiert in Anwesenheit der Gold-Nanopartikel, an denen Primer angebracht sind. In einem zweiten Schritt hybridisieren die Gold-Nanopartikel mit den daran angebrachten Primern an das Nukleinsäure-Target und eine Kopie der komplementären DNA-Sequenz wird erzeugt ausgehend von den Nukleinsäure-Primern, die an die Nanopartikel angebracht sind. Die Schritte eins und zwei werden wiederholt und das optische Signal, das durch das Binden von komplementären Nanopartikel-Sonden, die amplifiziert wurden, entsteht, wird gemessen.
Der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren bereitzustellen.
Erfindungsgemäße Lösung
Die Lösung der gestellten Aufgabe gelingt erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Das Verfahren dient zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren, wobei in einem Reaktionsvolumen Nanopartikel durch Anregung Wärme an ihre Umgebung übertragen.
Das Reaktionsvolumen ist der Raum, in dem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird. Der Raum kann von einem Reaktionsgefäß umgeben sein. Das Reaktionsvolumen enthält eine Probe. Die Probe enthält eine Flüssigkeit, vorzugsweise Wasser. Die Nukleinsäuren, die durch das Verfahren vervielfältigt werden können, können in der Probe enthalten sein.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel sind bevorzugt Partikel, die aufgrund ihrer Größe besondere optische Eigenschaften aufweisen, insbesondere charakteristische Absorptions- oder Streuspektren, die so im Volumenmaterial nicht oder nicht so deutlich hervortreten. Die Nanopartikel haben vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 2 und 500 nm, besonders vorzugsweise zwischen 3 und 300 nm und ganz besonders vorzugsweise zwischen 5 und 200 nm. Bevorzugte Nanopartikel haben einen Durchmesser zwischen 7 und 150 nm. Die Nanopartikel können sphärisch sein, es kommen aber insbesondere auch nicht-globuläre Formen in Frage, z. B. elongierte Nanopartikel (Nanorods). In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung umfasst der Nanopartikel mindestens einen Halbleiter oder ein Metall, vorzugsweise ein Edelmetall, z. B. Gold oder Silber. In einer Ausführung besteht der Nanopartikel vollständig aus dem Metall, in einer anderen bildet das Metall nur einen Teil des Nanopartikels, z. B. seine Hülle. Ein bevorzugter Nanopartikel kann ein Schale-Kern-Nanopartikel sein. Ein bevorzugter Nanopartikel kann an seiner Oberfläche Poren besitzen, die von Atomen oder Molekülen mit einer durch die Eigenschaften der Poren bestimmten Größe und Ladung besetzt werden können, besonders vorzugsweise lagern sich diese Atome oder Moleküle erst dann an den Nanopartikel an, wenn dieser sich in einer Lösung befindet. Erfindungsgemäß umfasst der Nanopartikel auch die an seiner Oberfläche angelagerten Atome und Moleküle. Bevorzugte Nanopartikel eignen sich aufgrund ihrer Materialabsorption oder Plasmonenresonanz dazu, optische Energie zu absorbieren.
Wenn durch Anregung eines Nanopartikels Wärme an seine Umgebung übertragen wird, bedeutet das erfindungsgemäß, dass Energie auf den Nanopartikel übertragen wird, wobei der Nanopartikel durch die Übertragung der Energie seine Umgebung erhitzt. Dabei wird vorzugsweise durch die Anregung der Nanopartikel die unmittelbare Umgebung der Nanopartikel stärker erhitzt als die weitere Umgebung der Nanopartikel. Gewöhnlich werden die Nanopartikel zunächst durch Anregung erhitzt und übertragen dann Wärme an ihre Umgebung. Es ist jedoch auch denkbar, dass durch die Anregung der Nanopartikel Wärme an deren Umgebung übertragen wird, ohne dass die Nanopartikel zuerst selbst erhitzt werden. Bevorzugt ist die Umgebung der Nanopartikel ein sphärisches Volumen, das den 100fachen Durchmesser des Nanopartikels hat, der sich in seinem Mittelpunkt befindet, besonders vorzugsweise hat es den 10fachen Durchmesser, ganz besonders vorzugsweise den 4fachen Durchmesser und vorzugsweise weniger als den 2fachen Durchmesser.
Bevorzugt wird durch die Anregung der Nanopartikel die Umgebung der Nanopartikel lokal erhitzt. Besonders schnelle Temperaturänderungen sind möglich, wenn das erhitzte Volumen nur einen kleinen Bruchteil des Gesamtvolumens ausmacht. Zum einen kann dann schon mit einem kleinen Energie-Eintrag durch Bestrahlung eine hohe Temperaturdifferenz erzeugt werden. Zum anderen ist eine sehr schnelle Abkühlung des erwärmten Volumens möglich, wenn ein ausreichend großes kaltes Temperatur-Reservoir im bestrahlten Volumen vorhanden ist, um nach der Bestrahlung die Nanopartikel und ihre Umgebung wieder abzukühlen Dies kann dadurch erreicht werden, dass die Nanopartikel hinreichend stark (um den gewünschten Temperaturhub zu erreichen) und hinreichend kurz (damit die Wärme lokalisiert bleibt) bestrahlt werden.
Eine lokale Erhitzung im Sinne der vorliegenden Erfindung liegt dementsprechend dann vor, wenn die Dauer der Anregung im jeweils bestrahlten Volumen (z. B. im Laserfokus) t kürzer oder gleich einer kritischen Anregungsdauer t1 gewählt wird. Hierbei ist t1 durch eine Zeit bestimmt, die die Wärme benötigt, um bei mittlerem Nanopartikelabstand von einem Nanopartikel zum nächsten zu diffundieren, multipliziert mit einem Skalierungsfaktor s1, und zwar ist bei einem mittleren Nanopartikelabstand |x| und einer Temperaturleitfähigkeit D des Mediums zwischen den Nanopartikeln t1 geben durch t1 = (s1·|x|)²/D, wobei die Temperaturleitfähigkeit D typischerweise in wässriger Lösung einen Wert von D = 10^–7 m²/s hat.
Der Skalierungsfaktor s1 ist ein Maß dafür, wie weit sich die Wärmefront eines Partikels während der Anregungsdauer ausbreitet. Die Temperaturerhöhung durch einen angeregten Nanopartikel im Abstand von einigen Nanopartikeldurchmessern ist nur ein sehr kleiner Bruchteil der maximalen Temperaturerhöhung auf der Partikeloberfläche. In einer Ausführung der Erfindung wird ein Überlapp der Wärmefronten von einigen Nanopartikeln zugelassen in dem Sinne, dass zur Definition der kritischen Anregungstemperatur t1 anhand der oben angegebenen Formel ein Skalierungsfaktor s1 größer als 1 verwendet wird. In einer anderen Ausführung der Erfindung wird kein Überlapp der Wärmefronten während der Anregungsdauer zugelassen (entspricht einer stark lokalisierten Erwärmung) in dem Sinne, dass zur Definition der kritischen Anregungstemperatur t1 anhand der oben angegebenen Formel ein Skalierungsfaktor s1 kleiner oder gleich 1 verwendet wird. Für die Definition der erfindungsgemäßen lokalen Erhitzung ist vorzugsweise s1 = 100, vorzugsweise s1 = 30 vorzugsweise s1 = 10, vorzugsweise s1 = 7, vorzugsweise s1 = 3 und ganz besonders vorzugsweise s1 = 1, vorzugsweise s1 = 0,7, vorzugsweise s1 = 0,3.
Werte für s1 > 1 können u. a. beispielsweise in solchen Fällen vorteilhaft sein, in denen das bestrahlte Volumen ein hohes Seitenverhältnis aufweist (etwa im Fokus eines moderat fokussierten Laserstrahls), so dass sich vergleichsweise viele Nanopartikel an der Oberfläche des bestrahlten Volumens befinden und sich daher weniger beheizte Nanopartikel in ihrer Umgebung befinden, und ein starker Wärmeabfluss aus dem bestrahlten Volumen heraus stattfindet, so dass der Erwärmungsbeitrag der weiter entfernten Nachbarn länger vernachlässigbar bleibt.
Das heißt, dass beispielsweise, bei einer Nanopartikelkonzentration von 1 nM, die einen mittlereren Nanopartikelabstand von |x| = 1,2 Mikrometern ergibt, ein erfindungsgemäßes lokales Erhitzen vorliegt, sofern die Anregungsdauer weniger als t1 = 14 Mikrosekunden beträgt (der Skalierungsfaktor ist hier s1 = 1 gewählt, D = 10^–7 m²/s). Es ist davon auszugehen, dass wenn t > t1 gewählt wird, die Wärme, die von den Nanopartikeln abgegeben wird, durch Diffusion während der Bestrahlung also eine Strecke zurücklegen kann, die größer ist als der mittlere Nanopartikelabstand, dies im Ergebnis zu einer Überlagerung der Wärmefronten vieler Nanopartikel führt, so dass im gesamten Volumen zwischen den Nanopartikeln eine Temperaturerhöhung stattfindet; die Temperaturerhöhung dürfte im bestrahlten Volumen räumlich umso homogener werden je länger geheizt wird, da nicht nur die Beiträge der nächsten Nanopartikel sondern auch weiter entfernter Nachbarn in die Temperaturverteilung um ein Nanopartikel herum eingeht.
Wenn das Reaktionsvolumen mit einer von den Nanopartikeln absorbierten Strahlung länger als t1 bestrahlt wird, wird die Erhitzung als global bezeichnet.
Ein erfindungsgemäß globales Erhitzen kann z. B. auch dadurch stattfinden, dass das Reaktionsvolumen von außen mit einem Peltier-Element oder einer Widerstandsheizung geheizt wird. Das globale Erhitzen kann auch dadurch erfolgen, dass z. B. das Reaktionsvolumen mit einer Strahlung bestrahlt wird, die von dem Wasser in der Probe stärker als oder ähnlich stark wie von den Nanopartikeln absorbiert wird. Temperaturerhöhung bedeutet hierbei die Differenz zwischen der Temperatur an einem Ort zum Beobachtungszeitpunkt unmittelbar nach der Anregung und der Temperatur am gleichen Ort zum Zeitpunkt unmittelbar vor der Anregung.
Globales Erhitzen und lokales Erhitzen kann auch gleichzeitig durchgeführt werden.
Bekannte Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren enthalten einen oder mehrere Schritte, in denen wenigstens Teile der Probe erhitzt werden müssen.
Durch die Erfindung ist es erreichbar, dass in dem Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren nicht das ganze Reaktionsvolumen erhitzt werden muss. Es ist hingegen möglich, nur spezifische Teile des Reaktionsvolumens durch Anregung von Nanopartikeln zu erhitzen. So ist es vorteilhafterweise möglich, nur die Teile des Reaktionsvolumens zu erhitzen, die zur Vervielfältigung der Nukleinsäuren erhitzt werden müssen. So können hitzeempfindliche Bestandteile der Probe geschont werden. Das lokale Erhitzen kann schneller sein als das globale Erhitzen des ganzen Reaktionsvolumens, wenn weniger Energie übertragen werden muss. Somit ist es durch die Erfindung mit Vorteil möglich, ein Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren bereitzustellen, das schneller ist und weniger Energie benötigt.
Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung
Eine Nukleinsäure kann insbesondere durch eine Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt werden. Die PCR wird in dem Reaktionsvolumen ausgeführt. Das Reaktionsvolumen enthält eine zu vervielfältigende Nukleinsäure, die als Original bezeichnet wird. Das Original ist ein Einzelstrang. Das Original kann in dem Reaktionsvolumen zusammen mit seinem komplementären Strang, der als Komplement bezeichnet wird, einen Doppelstrang bilden. Falls das Original zusammen mit dem Komplement in einem Doppelstrang vorliegen, muss dieser zunächst in einem ersten Schritt denaturiert werden, das heißt in zwei Einzelstränge aufgespalten werden. Das Denaturieren wird auch als Schmelzen bezeichnet. Das Denaturieren geschieht bei einer Temperatur, die als Denaturierungstemperatur bezeichnet wird. Das Reaktionsvolumen enthält ferner mindestens zwei Oligonukleotide, die als Primer bezeichnet werden. Einer der Primer wird als Vorwärtsprimer und ein anderer als Rückwärtsprimer bezeichnet. Der Vorwärtsprimer ist komplementär zum 3'-Ende des Originals. Der Rückwärtsprimer ist komplementär zum 3'-Ende des Komplements. In einem zweiten Schritt hybridisieren der Vorwärtsprimer mit dem Original und der Rückwärtsprimer mit dem Komplement. Die Hybridisierung der Primer mit den zu ihnen komplementären Teilen des Originals beziehungsweise des Komplements wird als Annealing bezeichnet. Der zweite Schritt findet bei einer Temperatur statt, die als Annealingtemperatur bezeichnet wird. Das Reaktionsvolumen enthält weiterhin eine DNA-Polymerase. Die DNA-Polymerase synthetisiert in einem dritten Schritt ausgehend von dem Vorwärtsprimer eine Kopie des Komplements. Ausgehend von dem Rückwärtsprimer synthetisiert die DNA-Polymerase eine Kopie des Originals. Durch die Synthese ist die Kopie des Komplements mit dem Original hybridisiert und die Kopie des Originals ist mit dem Komplement hybridisiert. Der dritte Schritt wird als Elongation bezeichnet und bei einer Temperatur ausgeführt, die Elongationstemperatur genannt wird. Daraufhin werden der erste, zweite und dritte Schritt zyklisch wiederholt bis das gewünschte Ausmaß der Vervielfältigung erreicht ist, wobei die Kopie des Originals das Original ist und die Kopie des Komplements das Komplement ist. Wenn das Original auf einem DNA-Einzelstrang liegt, der länger als das Original ist, so entstehen durch die PCR nicht nur Kopien des Originals, sondern auch in 3'-Richtung längere Kopien des besagten DNA-Einzelstrang, die das Original enthalten. Entsprechend entstehen in diesem Fall durch die PCR nicht nur Kopien des Komplements, sondern auch in 3'-Richtung längere Kopien des zum besagten DNA-Einzelstrang komplementären DNA-Einzelstrangs, die das Komplement enthalten.
Da die verschiedenen Schritte der PCR bei unterschiedlichen Temperaturen ausgeführt werden können, kann es notwendig sein, während der Schritte oder zwischen den Schritten einen oder mehrere Heizschritte und gegebenenfalls Kühlungsschritte auszuführen, in denen das Reaktionsvolumen oder Teile des Reaktionsvolumens erhitzt beziehungsweise gekühlt werden. Vorzugsweise wird das Erhitzen in dem oder mindestens einem der Heizschritte zumindest teilweise durch Anregung der Nanopartikel erreicht und ist vorzugsweise ein lokales Erhitzen.
In der PCR wird die Denaturierungstemperatur vorzugsweise so gewählt, dass die Einzelstränge der DNA aufschmelzen, aber zugleich die DNA-Polymerase nicht wesentlich geschädigt wird. Ein typischer Wert für die Denaturierungstemperatur ist z. B. 95°C. Die optimale Annealingtemperatur hängt für gewöhnlich von der Sequenz und Länge der Primer ab. Gewöhnlich werden die Primer so gestaltet, dass die Annealingtemperatur zwischen 50°C und 65°C liegt. Die optimale Elongationstemperatur hängt für gewöhnlich von der verwendeten DNA-Polymerase ab. Bei Verwendung der Taq Polymerase wird z. B. üblicherweise eine Elongationstemperatur von 72°C gewählt.
Hybridisieren bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung das Ausbilden eines Doppelstrangs aus zwei Einzelsträngen, die jeweils aus einer Nukleinsäure und/oder einem Oligonukleotid bestehen können. In geeigneten Reaktionsbedingungen führt das Hybridisieren in der Regel zu dem geringstmöglichen Energiezustand, der durch die Verbindung der beiden Einzelstränge erreicht werden kann. Mit anderen Worten bedeutet das, dass unter geeigneten Bedingungen die beiden Einzelstränge so aneinander binden, dass in Bezug auf die Sequenzen der beiden Einzelstränge die größtmögliche Komplementarität hergestellt ist.
Wenn eine Nukleinsäure A teilweise komplementär zu einer Nukleinsäure B ist, bedeutet dies, dass die Nukleinsäure A in einem Teil zu einem Teil der Nukleinsäure B komplementär ist.
Die Anregung der Nanopartikel geschieht vorzugsweise durch ein Wechselfeld, besonders vorzugsweise durch ein elektromagnetisches Wechselfeld, ganz besonders vorzugsweise optisch. Vorzugsweise geschieht die Anregung im Bereich vom fernen Infrarot bis zum fernen Ultraviolett (in einem Bereich von 100 nm bis 30 μm Wellenlänge), besonders vorzugsweise im Bereich vom nahen Infrarot bis zum nahen Ultraviolett (in einem Bereich von 200 nm bis 3 μm Wellenlänge), ganz besonders bevorzugt durch sichtbares Licht (in einem Bereich von 400 nm bis 800 nm Wellenlänge). Dies kann gegenüber dem herkömmlichen globalen Erhitzen des Reaktionsgefäßes von außen den Vorteil bieten, dass nicht die thermisch isolierende Wand des Reaktionsgefäßes überwunden werden muss, da die Energie direkt auf die Nanopartikel übertragen wird. So kann eine schnellere Heizung des gewünschten Anteils der Probe erreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Nanopartikel durch einen Laser angeregt. Besonders vorzugsweise hat das Laserlicht eine Frequenz, die die Oberflächenplasmonenresonanz der Nanopartikel anregt. Der Laser kann das Licht gepulst oder kontinuierlich zur Verfügung stellen. Der Laser kann z. B. ein Gaslaser, ein Diodenlaser oder ein diodengepumpter Festkörperlaser sein. Das Zeitintervall, in dem der Laser die Nanopartikel im jeweils bestrahlten Volumen anregt, liegt vorzugsweise im Bereich zwischen Picosekunden und Sekunden, besonders vorzugsweise zwischen Nanosekunden und Sekunden und ganz besonders vorzugsweise zwischen 10 ns und 500 μs. Bevorzugt ist das Zeitintervall der Anregung kürzer als es im Mittel dauert, bis die Wärme, die in der Umgebung der Nanopartikeln entsteht, den mittleren Teilchenabstand diffundiert, so dass im Mittel kein signifikanter Überlapp der Wärmefronten benachbarter Teilchen stattfindet. Besonders vorzugsweise ist das Zeitintervall der Anregung so gewählt, dass die Temperaturerhöhung um jeden bestrahlten Nanopartikel herum im Mittel in einer Entfernung von 20 Nanopartikeldurchmessern, besonders vorzugsweise 2 Nanopartikeldurchmessern, ganz besonders vorzugsweise 1 Nanopartikeldurchmesser, auf weniger als die Hälfte seines Maximums abfällt. In einer Ausführung ist eine möglichst kurze Bestrahlungsdauer des Lasers pro Volumen bevorzugt, so dass ein dehybridisierter DNA-Einzelstrang während des Denaturierens nur weniger als 100 nm, besonders vorzugsweise weniger als 20 nm, vom Nanopartikel weg diffundieren kann. Dadurch ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass der dehybridisierte DNA-Einzelstrang an ein Oligonukleotid auf demselben Nanopartikel bindet. Dies kann ein beschleunigtes erfindungsgemäßes Verfahren ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Konzentration der mit Primern konjugierten Nanopartikel kleiner als 10 nM, dabei beträgt das Zeitintervall der Anregung vorzugsweise zwischen 1 ns und 10 μs, besonders vorzugsweise zwischen 10 ns und 1 μs und ganz besonders vorzugsweise zwischen 15 ns und 300 ns. Das Zeitintervall der Anregung wird vorzugsweise nicht wesentlich kleiner als 1 ns gewählt, da sonst die Zeit der Erwärmung des DNA-Doppelstranges nicht dazu ausreicht, dass die beiden enthaltenen Einzelstränge sich durch Diffusion ausreichend voneinander trennen können, so dass sie nicht sofort wieder miteinander hybridisieren.
Der Tastgrad ist das Verhältnis von Zeitintervall der Anregung zu Dauer eines PCR-Zyklus. Der Tastgrad wird vorzugsweise so groß gewählt, dass die Anregung zu einem ausreichenden Denaturieren der DNA-Doppelstränge durch lokales Erhitzen führt. Zugleich wird der Tastgrad vorzugsweise so gewählt, dass die mittlere Temperaturerhöhung der gesamten Probe ausreichend klein gehalten wird, so dass keine störenden Einflüsse auf Hybridisierung, Elongation und Denaturieren auftreten. Vorzugsweise beträgt der Tastgrad für das bestrahlte Volumen weniger als 50%, besonders vorzugsweise weniger als 20% und ganz besonders vorzugsweise weniger als 1%. Der Tastgrad beträgt im bestrahlten Volumen geeigneterweise mehr als 10^–12, vorzugsweise mehr als 10^–10, besonders vorzugsweise mehr als 10^–9 und ganz besonders vorzugsweise mehr als 10^–8. Die Leistungsdichten, mit denen die Nanopartikel angeregt werden betragen vorzugsweise zwischen 20 W/mm² und 1000 kW/mm², besonders vorzugsweise zwischen 100 W/mm² und 100 kW/mm², ganz besonders vorzugsweise zwischen 250 W/mm² und 10 kW/mm².
In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird die Energie des Laserlichts durch die Materialabsorption der Nanopartikel auf diese übertragen. Das Licht, das zur Anregung der Nanopartikel verwendet wird, kann auch z. B. von einem thermischen Strahler, z. B. einer Blitzlampe stammen. In einer weiteren bevorzugten Ausführung der Erfindung, werden die Nanopartikel durch ein elektromagnetisches Wechselfeld oder elektromagnetische Wellen angeregt, die Wirbelströme in den Nanopartikeln erzeugen. Es ist bei geeigneter Gestaltung der Nanopartikel auch möglich, die Nanopartikel mit Ultraschall anzuregen.
Der Begriff Oligonukleotid umfasst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorzugsweise nicht nur (Desoxy)-Oligo-Ribonukleide, sondern auch Oligonukleotide, die ein oder mehrere Nukleotid-Analoga mit Modifikationen an ihrem Backbone (z. B. Methylphosphonate, Phosphothioate oder Peptide Nucleic Acids [PNA], insbesondere an einem Zucker des Backbone (z. B. 2'-O-Alkylderivate, 3'- und/oder 5'-Aminoribosen, Locked Nucleic Acids [LNA], Hexitol Nucleic Acids, Morpholinos, Glycol Nucleic Acid (GNA), Threose Nucleic Acid (TNA) oder Tricyclo-DNA, vergleiche hierzu den Aufsatz von D. Renneberg und C. J. Leumann, "Watson-Crick base-pairing properties of Tricyclo-DNA", J. Am. Chem. Soc., 2002, Bd. 124, Seiten 5993–6002, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist) enthalten oder die Basen-Analoga enthalten, z. B. 7-Deazapurine oder Universalbasen wie Nitroindol oder modifizierte natürliche Basen wie N4-Ethyl-Cytosin. In einer Ausführung der Erfindung sind die Oligonukleotide Konjugate oder Chimären mit nicht-nukleosidischen Analoga, z. B. PNA. Die Oligonukleotide enthalten in einer Ausführung der Erfindung, an einer oder mehreren Positionen nicht-nukleosidische Einheiten wie Spacer, z. B. Hexaethylenglycol oder C_n-Spacer mit n zwischen 3 und 6. Soweit die Oligonukleotide Modifikationen enthalten, sind diese so gewählt, dass auch mit der Modifikation eine Hybridisierung mit natürlichen DNA/RNA-Analyten möglich ist. Bevorzugte Modifikationen beeinflussen das Schmelzverhalten, vorzugsweise die Schmelztemperatur, insbesondere um Hybride mit unterschiedlichen Graden der Komplementarität ihrer Basen unterscheiden zu können (Mismatch-Diskriminierung). Bevorzugte Modifikationen umfassen LNA, 8-Aza-7-Deaza-Purine, 5-Propinyl-Uracil und -Cytosin und/oder abasische Unterbrechungen im Oligonukleotid. Weitere Modifikationen im Sinne der Erfindung sind z. B. Modifikationen mit Biotin, Thiol und Fluoreszenzdonor- und Fluoreszenzakzeptormolekülen.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die Nanopartikel mit Oligonukleotiden konjugiert. Die Nanopartikel bilden in dieser Weise Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate. Damit kann mit Vorteil erreicht werden, dass Oligonukleotide, die Teile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind, durch Anregung der Nanopartikel spezifisch erhitzt werden, ohne dass das ganze Reaktionsvolumen erhitzt werden muss. In einer besonders bevorzugten Ausführung sind die Nanopartikel mit Primern konjugiert. Ganz besonders vorzugsweise sind die Nanopartikel mit den Vorwärts- und Rückwärtsprimern der PCR konjugiert. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind auf einer Sorte von Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten Vorwärtsprimer, jedoch keine Rückwärtsprimer und auf einer anderen Sorte Rückwärtsprimer, jedoch keine Vorwärtsprimer angebracht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist eine Sorte von Konjugaten aus Nanopartikeln und Oligonukleotiden sowohl mit Vorwärts- als auch Rückwärtsprimern konjugiert. In dieser Ausführung wird in einer PCR ausgehend von dem Vorwärtsprimer auf einem Nanopartikel ein zu dem Original komplementärer neuer DNA-Einzelstrang geschrieben. Dieser neue DNA-Einzelstrang ist mit dem Nanopartikel konjugiert, da der neue DNA-Einzelstrang den Vorwärtsprimer enthält. Unmittelbar nach dem Schreiben bildet der neue DNA-Einzelstrang mit dem Original einen Doppelstrang. In einem darauffolgenden Denaturieren wird der neue DNA-Einzelstrang vom Original getrennt. Bei einer Annealingtemperatur hybridisiert der neue DNA-Einzelstrang mit einem Rückwärtsprimer, der sich auf der Oberfläche des Nanopartikels befindet, so dass eine Schleife entsteht. Für das Hybridisieren mit dem Rückwärtsprimer desselben Nanopartikels muss nur ein kurzer Weg zurückgelegt werden. Für das Hybridisieren mit einem Rückwärtsprimer auf einem anderen Nanopartikel muss bei bevorzugten Konzentrationen von Nanopartikeln im Mittel ein längerer Weg zurückgelegt werden. Somit ist es in dieser Ausführungsform mit Vorteil erreichbar, dass das Annealing schneller stattfindet und die PCR schneller durchlaufen werden kann.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die Nanopartikel so mit den Primern verbunden, dass kovalente Bindungen mit mehr als einem Thiol zwischen Primern und Nanopartikeln vorhanden sind. PCR-Puffer enthalten in der Regel Dithiothreitol, das die Thiolbindung zwischen Gold-Nanopartikeln und Primer destabilisiert und das insbesondere bei thermischer Belastung, wie z. B. während des Denaturierens, dazu führen kann, dass sich Primer von den Nanopartikeln lösen. Kovalente Bindungen mit mehr als einem Thiol zwischen Primern und Nanopartikeln können das Ablösend der Primer verringern und so die Effizienz der PCR erhöhen.
In einer bevorzugten Ausführung werden Gegensequenzen eingesetzt, die sich mit solchen Oligonukleotiden verbinden können, die sich von den Nanopartikeln, mit denen sie zuvor verbunden waren, gelöst haben. Gegensequenzen sind Oligonukleotide. Es kann in dem Verfahren vorkommen, dass sich Oligonukleotide, die mit Nanopartikeln konjugiert sind, von diesen ablösen und damit frei werden. In dem Fall, dass diese freien Oligonukleotide die erfindungsgemäßen Primer sind, können diese freien Primer an das Original oder Komplement binden. Da die freien Primer jedoch nicht an Nanopartikel gebunden sind, können die freien Primer nicht durch Anregung der Nanopartikel von dem Original beziehungsweise Komplement dehybridisiert werden. Dadurch sinkt die Effizienz und Sensitivität des Verfahrens. Die Gegensequenzen sind zumindest teilweise komplementär zu den freien Oligonukleotiden und binden an diese mit ausreichender Affinität, so dass die Funktion der freien Oligonukleotide beschränkt wird. Dadurch kann die Effizienz und Sensitivität des Verfahrens gesteigert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführung des Verfahrens werden bereits vor der Zugabe des Originals zur Probe Gegensequenzen in einer ausreichenden Menge zur Probe gegeben, um die freien Primer zu blockieren. Zugleich ist die Menge klein genug, dass sich auf den Nanopartikeln noch eine ausreichend große Zahl an nicht blockierten Primern befindet. Dies ist möglich, wenn die Zahl der Primer auf den Nanopartikeln die Zahl der freien Primer übersteigt.
In einer bevorzugten Ausführung sind auf den Nanopartikeln Füllmoleküle aufgebracht. Die Füllmoleküle verhindern die unerwünschte Aggregation der Nanopartikel in der Probe. Damit dienen die Füllmoleküle mit Vorteil der Stabilisierung der Nanopartikel. Durch die Füllmoleküle kann die Ladung der Nanopartikel moduliert werden. Dadurch kann die Salzkonzentration, die sich in der Umgebung der Nanopartikel befindet so angepasst werden, dass die DNA-Polymerase möglichst schnell synthetisieren kann und das Verfahren mit Vorteil schnell durchgeführt werden kann. Die Füllmoleküle können aus Oligonukleotiden bestehen, die jedoch keine Primer sind und bevorzugt kürzer als die Primer sind. Die Füllmoleküle können auch z. B. aus Polymeren, wie z. B. Polyethylenglykol bestehen. Die Füllmoleküle erlauben es in einer bevorzugten Ausführungsform, die Anzahl der Primer auf den Nanopartikeln zu verringern und stattdessen mehr Füllsequenzen zu verwenden, ohne dass wesentliche Einbußen an der Effizienz des Verfahrens verursacht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung des Verfahrens weisen die Oligonukleotide auf den Nanopartikeln als Teilsequenz eine Spacersequenz auf. Die Spacersequenz liegt dabei auf der dem Nanopartikel zugewandten Seite des jeweiligen Oligonukleotids. So dient die Spacersequenz dem übrigen Teil des Oligonukleotids als Abstandhalter. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein Oligonukleotid sowohl eine Teilsequenz, die die Funktion eines Primers hat und als Primersequenz bezeichnet wird, als auch eine Teilsequenz, die eine Spacersequenz ist. Dadurch, dass die Primersequenzen durch die Spacersequenzen von den Nanopartikeln weiter beabstandet sind, können vorteilhafterweise die zu vervielfältigenden Nukleinsäuren und die DNA-Polymerasen einen besseren Zugang zu den Primersequenzen finden. In einer bevorzugten Ausführung bleiben nach ihrer Synthese die Kopien des Originals und des Komplements über die Spacersequenzen auf der Oberfläche der Nanopartikel befestigt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Spacersequenzen Erkennungssequenzen von Restriktionsendonukleasen auf, so dass die synthetisierten Kopien von den Nanopartikeln abgeschnitten werden können. Dies geschieht bevorzugt nach dem Ende des Verfahrens, kann aber auch während des Verfahrens geschehen. So ist es mit dem Verfahren möglich, Kopien von Nukleinsäuren herzustellen, die frei in der Probe vorliegen. In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens sind die Spacersequenzen mindestens genauso lang wie die Füllmoleküle, so dass die Primersequenzen nicht durch die Füllmoleküle verdeckt werden.
In einer bevorzugten Ausführung ist die Wärme, die durch die Anregung der Nanopartikel auf deren Umgebung übertragen wird, ausreichend, um die Oligonukleotide auf der Oberfläche der Nanopartikel von mit den Oligonukleotiden hybridisierten Nukleinsäuren zu dehybridisieren. In dieser Ausführung sind Nanopartikel mit Oligonukleotiden konjugiert und zumindest ein Teil dieser Oligonukleotide sind mit zumindest teilweise komplementären Nukleinsäuren hybridisiert. Durch die Anregung der Nanopartikel wird thermische Energie an das umliegende Wasser übertragen, so dass bevorzugt die Temperatur des Wassers um die Nanopartikel ausreicht, um die Oligonukleotide von den mit ihnen verbundenen Nukleinsäuren zu denaturieren. In einer besonders bevorzugten Ausführung ist das erfindungsgemäße Verfahren eine PCR und die Nanopartikel sind mit Primern konjugiert. Beim Durchführen der PCR entstehen so vorzugsweise doppelsträngige PCR-Produkte, wobei jeweils mindestens ein Einzelstrang der doppelsträngigen PCR-Produkte mit einem Nanopartikel konjugiert ist. Durch Anregung der Nanopartikel ist es in dieser Ausführungsform mit Vorteil erreichbar, die Denaturierungstemperatur um die Nanopartikel zu erzeugen und das Denaturieren der doppelsträngigen PCR-Produkte durchzuführen, ohne das gesamte Reaktionsvolumen zu erhitzen. Dadurch kann das Denaturieren beschleunigt werden und so die PCR schneller ablaufen. In einer weiteren bevorzugten Ausführung werden auch die Annealingtemperatur und die Elongationstemperatur durch die Anregung der Nanopartikel erzeugt. So muss vorzugsweise im Vergleich zur Erhitzung der ganzen Probe auf die Annealing- und Elongationstemperatur nur eine geringe Energie übertragen werden. Besonders bevorzugt findet Denaturieren, Annealing und Elongation der PCR ohne ein globales Erhitzen, sondern ausschließlich über ein lokales Erhitzen durch Anregung der Nanopartikel statt. Dadurch kann das Verfahren ohne eine Einrichtung zum globalen Erhitzen durchgeführt werden, so dass ein geringerer apparativer Aufwand zur Durchführung des Verfahrens benötigt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung umfasst das Verfahren einen globalen Erhitzungsschritt. Dabei wird die Temperatur mindestens eines Verfahrensschritts zumindest teilweise durch globales Erhitzen erreicht. In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das Verfahren eine PCR und die Annealingtemperatur wird durch globales Erhitzen des Reaktionsvolumens erreicht. Ganz besonders vorzugsweise wird das Reaktionsvolumen über das ganze Verfahren hinweg durch globales Erhitzen in einem vorbestimmten Temperaturbereich gehalten, in dem das Annealing stattfindet. Dabei werden die Elongationstemperatur und die Denaturierungstemperatur durch Anregung der Nanopartikel erreicht. So kann mit Vorteil die Einrichtung, die das globale Erhitzen erzeugt, in ihrer Konstruktion sehr einfach gehalten werden, da sie nur eine vorbestimmte Temperatur halten muss.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird die Annealingtemperatur und die Elongationstemperatur durch globales Erhitzen erreicht und ausschließlich das Denaturieren durch Anregung der Nanopartikel erzeugt. So kann mit Vorteil erreicht werden, dass die Einrichtung, die das globale Erhitzen hervorruft, einen Temperaturzyklus mit nur zwei unterschiedlichen Temperaturen erzeugen muss und damit konstruktiv einfach gehalten werden kann. Die Elongation und das Annealing finden gewöhnlich jeweils in einem engen Temperaturbereich statt. Dahingegen muss zum Denaturieren nur eine bestimmte Temperatur übertroffen werden. Daher können Inhomogenitäten in der Anregung der Nanopartikel zur Erzeugung des Denaturierens ein geringeres Problem sein als beim Einstellen der Annealing- und Elongationstemperatur. Folglich kann eine bevorzugte Ausführung, in der die Anregung der Nanopartikel ausschließlich zum Denaturieren dient, technisch einfacher realisiert werden. Insbesondere gilt dies für den besonders bevorzugten Fall, in dem die Annealingtemperatur und die Elongationstemperatur sehr nah beieinander liegen, z. B. bei einer Annealingtemperatur von 60°C und einer Elongationstemperatur von 72°C, so dass das globale Erhitzen nur eine geringe Temperaturerhöhung erzeugen muss.
In einer besonders bevorzugten Ausbildung ist die Annealingtemperatur gleich der Elongationstemperatur. Dabei ist das Verfahren als PCR ausgeführt. Wenn die Annealingtemperatur gleich der Elongationstemperatur ist, so ist gewöhnlich zur Durchführung der PCR nur ein Temperaturzyklus mit zwei unterschiedlichen Temperaturen nötig, wodurch das Verfahren in einem einfachen Aufbau durchgeführt werden kann.
Besonders vorzugsweise werden die Schmelztemperaturen der Primer und die verwendete DNA-Polymerase so gewählt, dass bei der Schmelztemperatur die verwendete DNA-Polymerase noch mit ausreichender Geschwindigkeit DNA synthetisieren kann. In einer besonders bevorzugten Ausbildung wird die Elongationstemperatur, die gleich der Annealingtemperatur ist, durch globales Erhitzen erreicht und das Denaturieren wird durch Anregung der Nanopartikel erreicht. Auf diese Weise kann die Einrichtung, die das globale Erhitzen hervorruft, konstruktiv einfach gestaltet werden, da sie nur eine Temperatur halten muss.
In einer bevorzugten Ausführung findet zu jedem Zeitpunkt des Verfahrens die Anregung nur eines Anteils der Nanopartikel statt. Dazu können z. B. die Mittel, die der Anregung der Nanopartikel dienen, so gestaltet sein, dass sie nur in einem Teil des Reaktionsvolumens die dort vorliegenden Nanopartikel anregen. In einer besonders bevorzugten Ausführung werden die Nanopartikel durch einen Laser optisch angeregt und die Optik, die das Licht des Lasers in das Reaktionsvolumen leitet, ist so gestaltet, dass nur in einen Teil des Reaktionsvolumens Licht geleitet wird. Der Anteil der Nanopartikel, der angeregt wird, ändert sich bevorzugt im Laufe des Verfahrens. Mit anderen Worten ist eine erste Menge der Nanopartikel, die zu einem ersten Zeitpunkt angeregt werden, nicht identisch mit einer zweiten Menge der Nanopartikel, die zu einem zweiten Zeitpunkt angeregt werden. In diesem Fall können eine beliebige Zahl von Nanopartikeln in der ersten und eine beliebige Zahl von Nanopartikeln in der zweiten Menge vorhanden sein, solange erste und zweite Menge nicht identisch sind. Von den beiden genannten Mengen kann sich z. B. eine mit der anderen teilweise überschneiden, so dass die beiden Mengen eine Schnittmenge bilden. Die eine Menge kann z. B. eine Teilmenge der anderen Menge sein, so dass die eine Menge weniger Nanopartikel enthält als die andere Menge. Die beiden Mengen können z. B. auch so gestaltet sein, dass sie keine Schnittmenge bilden und damit kein Nanopartikel zugleich in der ersten Menge als auch in der zweiten Menge vorhanden ist. Eine der beiden Mengen kann auch die leere Menge sein, so dass z. B. zu einem Zeitpunkt Nanopartikel angeregt werden und zu einem anderen Zeitpunkt keine Nanopartikel angeregt werden. In einer bevorzugten Ausführung enthalten die erste und die zweite Menge im Wesentlichen die gleiche Anzahl von Nanopartikeln. Besonders vorzugsweise regt ein Laser zu verschiedenen Zeiten verschiedene Anteile der Nanopartikel an. Dadurch kann in der Ausführung des Verfahrens ein Laser mit einer kleineren Leistung verwendet werden, die gerade dazu ausreicht, einen Anteil der Nanopartikel anzuregen. In einer besonders bevorzugten Ausführung werden zwei oder mehrere Laser dazu verwendet, verschiedene Anteile der Nanopartikel anzuregen. Dadurch ist es mit Vorteil möglich, verschiedene Anteile der Nanopartikel anzuregen, ohne dass ein optisches Element benötigt wird, das den Laser auf verschiedene Teile des Reaktionsvolumens richtet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung der Erfindung findet eine gerichtete Bewegung der Probe relativ zu einem anregenden Feld statt, so dass zu verschiedenen Zeiten Nanopartikel in verschiedenen Teilvolumina der Probe angeregt werden. Besonders bevorzugt ist das anregende Feld das Licht eines Lasers. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung wird das Licht des Lasers durch ein optisches Element so gelenkt, dass zu verschiedenen Zeiten Nanopartikel in verschiedenen Teilvolumina des Reaktionsvolumens mit dem Licht angeregt werden. Das optische Element kann dazu beweglich angeordnet sein, z. B. kann das optische Element einen beweglichen Spiegel, einen räumlichen Modulator oder einen akustooptischen Modulator enthalten. Es kann auch der Laser selbst beweglich angeordnet sein. Die Bewegung der Probe kann auch so realisiert werden, dass das Reaktionsgefäß, das die Probe enthält, bewegt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführung wird sowohl der Laserstrahl als auch das Reaktionsgefäß bewegt. In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird die Probe im Reaktionsvolumen bewegt, so dass das Licht des Lasers zu verschiedenen Zeiten verschiedene Teilvolumina der Probe erfasst. Dies kann z. B. dadurch erreicht werden, dass die Probe in dem Reaktionsvolumen gerührt wird, z. B. durch einen Magnetrührer. Das Reaktionsvolumen kann z. B. eine langgestreckte Form annehmen, z. B. ein Kanal oder einen Schlauch. Die Probe kann z. B. durch einen Kanal bewegt werden, wobei die Probe an einer oder mehreren Stellen einen Laserstrahl durchläuft. Besonders vorzugsweise fließt eine Probe durch einen Kanal und passiert n Positionen, an denen jeweils ein Laserstrahl auf die Probe in dem Kanal gerichtet ist, wobei durch den linearen Fluss der Probe durch die n Laserstrahlen eine PCR mit n Zyklen durchlaufen wird. So kann vorteilhafterweise das Verfahren mit einer geringen Anzahl von beweglichen Teilen ausgeführt werden. Durch die Verwendung eines Kanals ist auch eine Miniaturisierung, z. B. im Sinne eines Lab-on-a-Chip möglich. Vorzugsweise wird durch den Laserstrahl das Denaturieren erzeugt, während Elongations- und Annealingtemperatur durch globales Erhitzen erzeugt werden. Besonders bevorzugt ist die Elongations- gleich der Annealingtemperatur, so dass durch globales Erhitzen nur eine Temperatur gehalten werden muss. Auf diese Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise mit einem geringen Aufwand ausgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in dem Verfahren eine DNA-Polymerase verwendet, die thermolabil ist. In dem Fall, dass die Anregung der Nanopartikel zum Denaturieren verwendet wird, kann vermieden werden, dass das ganze Reaktionsvolumen hohen Temperaturen ausgesetzt wird. Es ist vielmehr möglich, nur die unmittelbare Umgebung der Nanopartikel auf die Denaturierungstemperatur zu bringen. Die DNA-Polymerasen, die sich nicht in dieser unmittelbaren Umgebung befinden, werden so keinen hohen Temperaturen ausgesetzt. Dadurch ist es möglich, auch DNA-Polymerasen zu verwenden, die nicht hitzestabil, also thermolabil sind. Somit besteht durch den Einschluss der thermolabilen DNA-Polymerasen eine größere Auswahl an Polymerasen für das erfindungsgemäße Verfahren. Durch die größere Auswahl an DNA-Polymerasen können die Reaktionsbedingungen in einem größeren Ausmaß verändert werden und gleichzeitig eine ausreichende Funktion der jeweiligen DNA-Polymerase aufrechterhalten werden. Damit die zu vervielfältigenden Nukleinsäuren an die negativ geladenen Oligonukleotide auf den Nanopartikeln binden können, kann es notwendig sein, Stoffe – insbesondere Salze – in der Probe in einer Konzentration zu verwenden, die die Funktion einer thermostabilen DNA-Polymerase negativ beeinflussen, was die Effizienz des Verfahrens senkt. Die größere Auswahl an DNA-Polymerasen – insbesondere solchen, die eine hohe Toleranz für Salze haben – kann so dazu führen, dass eine Steigerung der Effizienz des Verfahrens erreicht wird. Teil der größeren Auswahl an DNA-Polymerasen sind kleine DNA-Polymerasen wie z. B. das Klenow-Fragment und Phi29. In der Nähe der Nanopartikel können große thermostabile DNA-Polymerasen durch die aufgebrachten und gegebenenfalls bereits elongierten Primer eine sterische Hinderung erfahren. Dadurch kann es sein, dass die DNA-Polymerase nicht an die zu kopierende Nukleinsäure gelangt oder die DNA-Polymerase abbricht, bevor sie eine vollständige Kopie des Originals oder Komplements synthetisiert hat, was eine Verringerung der Effizienz des Verfahrens bedeutet. Die größere Auswahl an DNA-Polymerasen ermöglicht so eine Erhöhung der Effizienz des Verfahrens. Durch die größere Auswahl an DNA-Polymerasen stehen mit Vorteil auch Enzyme mit niedrigeren Herstellungskosten zur Verfügung. Die DNA-Polymerasen, die sich nicht in der unmittelbaren Umgebung der Nanopartikel befinden, erfahren eine geringere hitzebedingte Deaktivierung. Dadurch kann mit Vorteil eine geringere Menge an DNA-Polymerase in dem Verfahren eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind sowohl lösliche Primer als auch Primer auf Nanopartikeln in dem Reaktionsvolumen vorhanden. Die löslichen Primer sind nicht an Nanopartikel konjugiert, sondern liegen gelöst in der Probe vor. Die löslichen Primer haben vorzugsweise kleinere Ausmaße als die Nanopartikel-Primer-Konjugate und können in höherer Konzentration als die Nanopartikel-Primer-Konjugate vorliegen. Daher können die löslichen Primer einen besseren und schnelleren Zugang zu langen, doppelsträngigen Nukleinsäuren, wie z. B. genomischer DNA haben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden in einem ersten Schritt des Verfahrens die langen, doppelsträngigen Nukleinsäuren durch globales Erhitzen des gesamten Reaktionsvolumens denaturiert, woraufhin die gelösten Primer mit den Nukleinsäuren hybridisieren. Die PCR läuft dabei zunächst in einem oder mehreren Zyklen bei globalem Erhitzen ab, dabei synthetisiert die DNA-Polymerase die gewünschten, kurzen Kopien der langen, doppelsträngigen Nukleinsäuren. Danach wird die PCR fortgeführt, wobei auch lokales Erhitzen durch Anregung der Nanopartikel eingesetzt wird.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung kann die Partikeldiffusion der Nanopartikel-Primer-Konjugate durch optische Felder verstärkt. Durch optische Wirbelfelder (nach Silvia Albaladejo et al., Nano Letters, 2009, Band 9, Ausgabe 10, Seiten 3527 bis 3531, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist) mit denen die Nanopartikel angeregt werden oder durch optische Kräfte (nach Arthur Ashkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, Band 94, Ausgabe 10, Seiten 4853 bis 4860, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist), die auf die Nanopartikel ausgeübt werden, kann die Nanopartikeldiffusion erhöht werden. Dadurch kann mit Vorteil erreicht werden, dass bei einer gegebenen Nanopartikelkonzentration eine schnellere Hybridisierung der zu vervielfältigenden Nukleinsäuren mit den Primern auf den Nanopartikeln stattfindet. Dies kann zur Beschleunigung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden.
In einer Ausführung der Erfindung wird die Konzentration der Produkte der Vervielfältigungsreaktion durch Testsonden bestimmt. Testsonden sind Nanopartikel, die auf ihrer Oberfläche Oligonukleotide mit Testsequenzen aufweisen. In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens weisen die Oligonukleotide der Testsonden als Teilsequenz eine Spacersequenz auf. Die Spacersequenz liegt dabei auf der dem Nanopartikel zugewandten Seite des jeweiligen Oligonukleotids. So dient die Spacersequenz dem übrigen Teil des Oligonukleotids als Abstandhalter. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein Oligonukleotid der Testsonden sowohl eine Teilsequenz, die als Testsequenz bezeichnet wird, als auch eine Teilsequenz, die eine Spacersequenz ist. In einer bevorzugten Ausführung sind auf den Testsonden Füllmoleküle aufgebracht. Die Testsequenzen können mit Produkten der Vervielfältigungsreaktion hybridisieren. Dabei sind die Testsequenzen vorzugsweise zumindest teilweise komplementär zu den Produkten der Vervielfältigungsreaktion. In einer bevorzugten Ausführung sind erste Nanopartikel mit Vorwärtsprimern konjugiert. In Anwesenheit des Originals und einer DNA-Polymerase werden die Vorwärtsprimer verlängert, so dass Komplemente entstehen, die über die Vorwärtsprimer an die ersten Nanopartikel gebunden sind. Ein Komplement besteht dabei aus dem Vorwärtsprimer und einer Verlängerungssequenz, die durch das Verlängern des Vorwärtsprimers entsteht. Besonders vorzugsweise wird unter Verwendung von freien und/oder nanopartikelgebundenen Rückwärtsprimern eine PCR durchgeführt, so dass in einer exponentiellen Vervielfältigung vorzugsweise eine große Anzahl von Kopien des Originals und nanopartikelgebundenen Komplementen entstehen. Ganz besonders bevorzugt sind weisen die ersten Nanopartikel auf ihrer Oberfläche sowohl Vorwärtsprimer als auch Rückwärtsprimer auf. In einem optionalen Zwischenschritt werden die Originale und gegebenenfalls deren Kopien von den Komplementen durch lokales oder globales Erhitzen denaturiert. Die ersten Nanopartikel werden dann mit Testsonden zusammengeführt, wenn dies nicht schon zuvor geschehen ist. Die Testsequenzen der Testsonden sind komplementär zu den Verlängerungssequenzen, so dass die Testsonden über Testsequenzen an die verlängerten Vorwärtsprimer auf den ersten Nanopartikeln binden können. Bei geeigneten Reaktionsbedingungen kommt die Verbindung der ersten Nanopartikel mit den Testsonden in dem Ausmaß zustande, in dem auch nanopartikelgebundene Komplemente vorliegen. Das bedeutet, dass wenn keine Verlängerungssequenzen entstehen, auch keine Verbindung von Testsonden und ersten Nanopartikeln entsteht. Besonders vorzugsweise werden die Reaktionsbedingungen der erfindungsgemäßen Vervielfältigung und des Nachweises durch Testsonden so gewählt, dass das Ausmaß der Verbindung von ersten Nanopartikeln mit Testsonden darüber Rückschlüsse zulässt, welche Konzentration des Originals vor der Vervielfältigung in der Probe vorlag. Durch die Verbindung der ersten Nanopartikel mit den Testsonden kann eine messbare Veränderung entstehen, z. B. eine Rotverschiebung oder Verbreiterung der Plasmonenresonanz im Extinktionsspektrum. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung ist die messbare Veränderung, die durch die Verbindung von Testsonden und ersten Nanopartikeln entsteht, proportional zur Konzentration des Originals in der Probe vor der Vervielfältigung. So kann mit Vorteil mit einfachen Mitteln ein Konzentrationsnachweis erfolgen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung umfasst das Verfahren Vorwärtsprimer, die mit ersten Nanopartikeln konjugiert sind und freie und/oder nanopartikelgebundene Rückwärtsprimer. Besonders bevorzugt ist es, dass die ersten Nanopartikel sowohl Vorwärtsprimer als auch Rückwärtsprimer auf ihrer Oberfläche aufweisen. In einem ersten Schritt werden die Vorwärtsprimer in Anwesenheit des Originals durch eine DNA-Polymerase zu nanopartikelgebundenen Komplementen verlängert. In einem zweiten Schritt werden ausgehend von den Rückwärtsprimern, die an das nanopartikelgebundene Komplement binden, Kopien des Originals synthetisiert. Danach werden die ersten Nanopartikel mit Testsonden zusammengeführt, wenn dies nicht schon zuvor geschehen ist. Die Testsequenzen sind in dieser Ausführung komplementär zu den Vorwärtsprimern. Wenn die Vorwärtsprimer nicht verlängert wurden, dann können die Testsonden gut an die ersten Nanopartikel binden. Wenn die Vorwärtsprimer verlängert wurden, dann wird die Bindung von Testsequenzen an Vorwärtsprimern durch sterische Hinderung behindert. Wenn eine neu synthetisierte Kopie des Originals mit dem verlängerten Vorwärtsprimer hybridisiert ist, so wird die Bindung der Testsequenz an den verlängerten Vorwärtsprimer verhindert. In dieser Weise sinkt das Ausmaß der Verbindung zwischen ersten Nanopartikeln und Testsonden in dem Ausmaß in dem Produkte der Vervielfältigungsreaktion, das heißt Komplemente und Kopien des Originals, synthetisiert wurden. Bei geeigneter Wahl der Reaktionsbedingungen kann so ein Konzentrationsnachweis des Originals in der Probe durchgeführt werden, so dass eine messbare Veränderung desto geringer ist, je mehr Original in der Probe vor der Vervielfältigung vorhanden war. Die messbare Veränderung kann dabei z. B. eine Rotverschiebung oder Verbreiterung der Plasmonenresonanz im Extinktionsspektrum sein. So kann mit Vorteil ein einfacher Test gestaltet werden, der die Bestimmungen von Konzentrationen spezifischer Nukleinsäuren zulässt.
Durch die Erfindung ist es möglich, ein verbessertes Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren bereitzustellen.
Kurzbeschreibung der Figuren
Es zeigen:
1 in einer schematischen Darstellung die erfindungsgemäßen Nanopartikel, die mit Füllmolekülen, Spacersequenzen und Primersequenzen konjugiert sind;
2 in einer weiteren schematischen Darstellung die erfindungsgemäßen Nanopartikel, die mit Füllmolekülen, Spacersequenzen und Primersequenzen konjugiert sind;
3 in einer schematischen Darstellung einen Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Laser, einem zweidimensionalen Spiegelscanner und einer Probe;
4 in einer schematischen Darstellung einen weiteren Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Laser, einem Spiegel und einer relativ zum Laserstrahl bewegten Probe;
5 in einer schematischen Darstellung einen weiteren Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Laser, einem eindimensionalen Spiegelscanner und einer eindimensional bewegten Probe;
6 in einer schematischen Darstellung die erfindungsgemäßen Nanopartikel und die erfindungsgemäßen Testsonden zum positiven Nachweis von DNA;
7 in einer schematischen Darstellung einen weiteren Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Laser, einem zweidimensionalen Spiegelscanner und Probenröhrchen in einem Wasserbad;
8 in zwei Diagrammen die Ergebnisse von Vervielfältigungsreaktionen mit globalem und lokalem Erhitzen mit Testsonden zum positiven Nachweis von DNA;
9 in schematischer Darstellung die erfindungsgemäßen Nanopartikel und die erfindungsgemäßen Testsonden zum negativen Nachweis von DNA;
10 in zwei Diagrammen die Ergebnisse von Vervielfältigungsreaktionen mit globalem und lokalem Erhitzen mit Testsonden zum negativen Nachweis von DNA;
11 in einem Diagramm die Ergebnisse von Vervielfältigungsreaktionen mit dem nicht thermostabilen Klenow-Fragment;
12 in einem Diagramm die Ergebnisse von Vervielfältigungsreaktionen bei unbewegtem und bewegtem Laserstrahl;
13 in einer schematischen Darstellung einen Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer Lichtquelle, einem ablenkenden Element und beweglich angeordneten Probenröhrchen;
14 in einer schematischen Darstellung einen Ausschnitt eines erfindungsgemäßen Nanopartikels mit Füllmolekülen und Oligonukleotiden und DNA-Polymerasen;
15 in vier Diagrammen die Ergebnisse von Vervielfältigungsreaktionen mit Testsonden zum negativen Nachweis von DNA;
und
16 in einer schematischen Darstellung einen ersten Laser zum Anregen von Nanopartikeln in einem Probenröhrchen und einen zweiten Laser und eine Photodiode zur Messung der Transmission der Probe.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung anhand mehrerer Ausführungsbeispiele
1 zeigt ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren 1, das als PCR ausgeführt ist. In einem Reaktionsvolumen 2 sind erste Nanopartikel 3 enthalten. Die ersten Nanopartikel 3 weisen an ihrer Oberfläche Oligonukleotide 4 auf, wie in 1a gezeigt. Eine Sorte von Oligonukleotiden 4 enthalten jeweils als Teilsequenz eine Primersequenz 5 mit der Sequenz A und als weitere, optionale Teilsequenz eine Spacersequenz 6 S. Eine Primersequenz 5 ist definiert als die Sequenz eines Primers 7. Die Spacersequenz 6 S dient dazu, die Primersequenz 5 weit genug von der Oberfläche der Nanopartikel 8 wegzuhalten, so dass eine zu vervielfältigende Nukleinsäure 1 mit einer besseren Effizienz an die Primersequenz 5 binden kann und die DNA-Polymerase 10 einen besseren Zugang zu der Primersequenz 5 finden kann. Die Oligonukleotide 4 mit der Primersequenz 5 A sind z. B. mit einer Thiol-Bindung an der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 befestigt, so dass das 3'-Ende vom ersten Nanopartikel 3 abgewandt ist. Optional kann sich eine weitere Sorte von Oligonukleotiden 4 auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 befinden, dies sind die Füllmoleküle 9 F. Mit den Füllmolekülen 9 kann die Ladung der Nanopartikel 8 moduliert werden, so dass es nicht zu unerwünschten Aggregationen der Nanopartikel 8 kommt. Darüber hinaus können die Füllmoleküle 9 den Abstand der Primersequenzen 5 zueinander auf der Oberfläche der Nanopartikel 8 vergrößern, so dass die zu vervielfältigenden Nukleinsäuren 1 und die DNA-Polymerase 10 einen besseren Zugang zu den Primersequenzen 5 haben. Dies kann die Effizienz des Verfahrens erhöhen. Die Spacersequenz 6 ist dabei bevorzugt mindestens so lang wie die Füllmoleküle 9, so dass mit Vorteil die Primersequenzen 5 aus den Füllmolekülen 9 hervorragen.
In dem Reaktionsvolumen 2 befindet sich eine Probe 11, die die ersten Nanopartikel 3 aus 1a mit den Primersequenzen 5, Spacersequenzen 6 und Füllmolekülen 9 enthält und die darüber hinaus dNTPs und DNA-Polymerase 10 aufweist. Eine nachzuweisende Nukleinsäure 1 kann in der Probe 11 vorhanden sein. In diesem Ausführungsbeispiel ist die nachzuweisende Nukleinsäure 1 ein DNA-Einzelstrang, der auch als Original 12 bezeichnet wird und eine Teilsequenz A' sowie eine Teilsequenz B' aufweist. Das Original 12 kann auch noch weitere Teilsequenzen aufweisen, z. B. als Überhänge am 5'- oder 3'-Ende oder zwischen den beiden Teilsequenzen A' und B'. In 1b bindet das Original 12 mit seiner Teilsequenz A' an die Primersequenz 5 A auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3. In 1c ist gezeigt, dass eine DNA-Polymerase 10 an das Original 12 und die mit dem Original 12 hybridisierte Primersequenz 5 A bindet. Daraufhin synthetisiert die DNA-Polymerase 10 in einem Elongationsschritt, der in 1d gezeigt wird, ausgehend vom 3'-Ende der Primersequenz 5 A eine zum Original 12 komplementäre Nukleinsäure 1, die als Komplement 13 bezeichnet wird und die mit der Spacersequenz 6 auf der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 verbunden ist. In 1e wird der erste Nanopartikel 3 dann mit Licht bestrahlt, das von dem ersten Nanopartikel 3 aufgrund seiner plasmonischen oder materiellen Eigenschaften absorbiert wird und in Wärme umgewandelt wird. Die Wärme wird an die Umgebung des ersten Nanopartikels 3 abgegeben und ist im Bereich des Originals 12 und des mit ihm hybridisierten, neu synthetisierten Komplements 13 dazu ausreichend, dass das Original 12 von dem Komplement 13 denaturiert. Das Original 12 ist nunmehr erneut frei, wie in 1f dargestellt, so dass es an eine weitere Primersequenz 5 binden kann und weitere nanopartikelgebundene Komplemente 13 in weiteren Zyklen des Verfahrens synthetisiert werden können. Dabei entsteht ein linearer Anstieg der Konzentration der Komplemente 13 mit steigender Zyklenzahl. Die in 1g und 1h beschriebenen Verfahrensschritte werden in diesem Dokument weiter unten ausgeführt.
In 2 ist eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt, in dem Nanopartikel 8 sich in einer Probe 11 befinden. Die Nanopartikel 8 weisen an ihrer Oberfläche Füllmoleküle 9 F auf. Ferner sind die Nanopartikel 8 mit Oligonukleotiden 4 konjugiert. Eine erste Sorte von Oligonukleotiden 4 bestehen aus einer Spacersequenz 6 S und einer Primersequenz 5 A. Eine zweite Sorte von Oligonukleotiden 4 besteht aus einer Spacersequenz 6 S und einer Primersequenz 5 B'. Das zu vervielfältigende Original 12 ist in diesem Ausführungsbeispiel ein einzelsträngiges DNA-Molekül mit den Teilsequenzen A, C und B (nicht gezeigt). Durch eine DNA-Polymerase 10 wurde ein zu dem Original 12 komplementärer Strang ausgehend von der Primersequenz B' auf der Oberfläche des Nanopartikels 8 synthetisiert, so dass, wie in 2a gezeigt, sich nun auf dem Nanopartikel 8 ein DNA-Einzelstrang mit der Sequenz S, B', C' und A' befindet. Zugleich ist in 2a zu sehen, dass durch eine DNA-Polymerase eine Kopie des Originals 12 ausgehend von der Primersequenz 5 A, die mit der Spacersequenz 6 S auf der Oberfläche des Nanopartikels 8 verbunden ist, synthetisiert wurde. Wie durch einen Pfeil in 2a gezeigt, hybridisiert die auf dem Nanopartikel 8 befestigte Kopie des Originals 12 mit ihrer Teilsequenz B an eine Primersequenz 5 B' auf der Oberfläche desselben Nanopartikels 8. Durch einen zweiten Pfeil in 2a ist gezeigt, dass das auf der Oberfläche des Nanopartikels 8 synthetisierte Komplement 13 mit seiner Teilsequenz A' an eine Primersequenz 5 A auf der Oberfläche desselben Nanopartikels 8 hybridisiert. Das Ergebnis der beiden genannten Hybridisierungen ist in 2b dargestellt. Dabei bilden sowohl das Original 12 als auch das Komplement 13 eine Schleife auf der Oberfläche des Nanopartikels 8. In 2c ist zu sehen, dass ausgehend von dem Primer 7 B' ein zu dem Original 12 komplementärer Strang synthetisiert wird, der über eine Spacersequenz 6 S mit der Oberfläche des Nanopartikels 8 verbunden ist. Durch eine weitere DNA-Polymerase 10 wird ausgehend von der Primersequenz 5 A eine Kopie des Originals 12 synthetisiert, die ebenfalls über eine Spacersequenz 6 mit der Oberfläche des Nanopartikels 8 verbunden ist. Das Ergebnis der beiden Synthesen ist in 2d zu sehen. In dieser Ausführungsform befinden sich sowohl der Vorwärtsprimer 14 als auch der Rückwärtsprimer 15 auf demselben Nanopartikel 8. Auf diese Weise kann ein neu synthetisierter DNA-Strang zurück an einen Primer 7 auf demselben Nanopartikel 8 hybridisieren. Dies kann zu einer Beschleunigung des erfindungsgemäßen Verfahrens führen, da der neu synthetisierte DNA-Strang keine weiten Wege zurücklegen muss, um auf einen komplementären Primer 7 zu treffen. Vielmehr kann der neu synthetisierte DNA-Strang besonders schnell an einen komplementären Primer 7 auf der Oberfläche desselben Nanopartikels 8 binden, was besonders dadurch erleichtert wird, dass die lokale Konzentration der Primer 7 auf dem Nanopartikel 8 besonders hoch ist. Nach dem Anregen des Nanopartikels 8 in 2d, zum Beispiel durch einen Laser 16, dehybridisieren die Kopien des Originals 12 und die Kopien des Komplements 13, die jeweils über Spacersequenzen 6 auf der Oberfläche des Nanopartikels 8 befestigt sind. Daraufhin kann eine Kopie des Originals 12 die an einem Nanopartikel 8 befestigt ist mit einem Komplement 13, das auf der Oberfläche eines anderen, identischen Nanopartikels 8 befestigt ist, hybridisieren. Durch die Hybridisierung werden die Nanopartikel 8 verbunden, so dass eine messbare Veränderung entsteht. Die messbare Veränderung kann zum Beispiel in einem Farbumschlag der Probe 11 bestehen. Durch die in 2a bis 2e dargestellte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, einen einfachen Test bereitzustellen, der zum Nachweis des Originals 12 dient.
In 3 ist ein Aufbau dargestellt, der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Der Aufbau enthält eine Lichtquelle 17, die in diesem Beispiel als Laser 16 ausgeführt ist und einen zweidimensionalen Spiegelscanner 18, der Licht von dem Laser 16 auf die Probe 11 lenken kann. Der zweidimensionale Spiegelscanner 18 kann dabei den Laserstrahl in zwei Dimensionen ablenken. Die Denaturierung in der Probe 11 geschieht in diesem Aufbau dadurch, dass ein Laserstrahl auf einen Teil der Probe 11 fokussiert wird. Im Laufe des Verfahrens wird der Laserstrahl so abgelenkt, dass er auf unterschiedliche Teile der Probe 11 trifft. In dem in 3 gezeigten Beispiel wird der Laserstrahl durch den Spiegelscanner 18 so abgelenkt, dass der Laserstrahl das Reaktionsvolumen 2, in dem sich die Probe 11 befindet, zeilenförmig abfährt. Der Weg, den der Laserstrahl zurücklegt wird in 3 in der Probe 11 gestrichelt dargestellt. Dadurch, dass zu jedem Zeitpunkt des Verfahrens nur Teile der Probe 11 angeregt wird, können Laser 16 mit einer kleineren Leistung verwendet werden. Da Anregungen von unter einer Mikrosekunde ausreichen, um DNA mit Hilfe von optothermisch geheizten Nanopartikeln 8 zu denaturieren, kann bei typischen Fokusdurchmessern eines Lasers 16 von etwa 10 bis 100 μm ein Laserstrahl mit einer Geschwindigkeit von etwa 10 bis 100 m/s die Probe 11 abtasten und dabei an jedem Punkt, den der Laserstrahl überfährt, zu einer Denaturierung der DNA führen. Dies ermöglicht ein sehr schnelles Abtasten auch von großen Probenvolumina. Das komplette Abtasten einer Fläche von 1 cm² dauert z. B. bei einem Fokusdurchmesser von 78 μm und 128 Zeilen im Zeilenabstand von 78 μm und einer Zeilenlänge von 1 cm bei einer Geschwindigkeit des abtastenden Laserstrahls von 10 m/s nur 128 ms. Dies ist vorteilhafterweise wesentlich kürzer als ein Denaturierungsschritt durch globales Erhitzen in der Regel erfordern würde. Mit optischen Elementen wie z. B. einem in 3 gezeigten Spiegelscanner 18 und sogenannten F-Theta-Linsen können eine gute Homogenität der Fokusqualität und -größe über die gesamte abgetastete Probe 11 erreicht werden. Alternativ zu einem kontinuierlich emittierenden Laser 16 kann auch ein gepulster Laser 16 oder ein thermischer Strahler eingesetzt werden.
In 4 ist ein Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt, bei dem ein Laser 16 und ein Spiegel 19 unbeweglich angeordnet ist und der Laserstrahl des Lasers 16 durch den Spiegel 19 auf die Probe 11 gelenkt wird. Dabei ist die Probe 11 in zwei Dimensionen beweglich angeordnet, so dass durch Bewegung der Probe 11, die ganze Probe 11 oder große Teile der Probe 11 von dem Fokus des Lasers 16 erfasst werden können.
In 5 ist ein Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt, bei dem ein Laser 16 unbeweglich angeordnet ist und ein Spiegelscanner 18 den Laserstrahl des Lasers 16 in einer Richtung ablenken kann. Die Probe 11 ist dabei in einer Richtung beweglich angeordnet, so dass durch Bewegung des Spiegelscanners 18 und der Probe 11 die ganze Probe 11 oder große Teile der Probe 11 durch den Laserstrahl erfasst werden können.
Eine Möglichkeit zum Nachweis einer Nukleinsäure 1 durch erfindungsgemäße PCR ist in 6 dargestellt. Dabei befinden sich in einer Probe erste Nanopartikel 3, die an ihrer Oberfläche Füllmoleküle 9 F und erste Oligonukleotide 20 aufweisen. Die ersten Oligonukleotide 20 bestehen aus einer Spacersequenz 6 S und einer Primersequenz 5 A, wie in 6a gezeigt. Wenn ein Original 12 mit den Teilsequenzen A' und B' in der Probe 11 vorhanden ist, so hybridisiert das Original 12 auf die komplementäre Primersequenz 5 A auf einem der ersten Nanopartikel 3. Durch eine DNA-Polymerase 10 wird ausgehend von der Primersequenz 5 A das Komplement 13 mit den Teilsequenzen A und B geschrieben, so dass das Komplement 13 über die Spacersequenz 6 S mit der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 verbunden ist, wie in 6c gezeigt. In einem nächsten Schritt werden die in 6d gezeigten Testsonden 21 zur Probe gegeben. Die Testsonden 21 sind zweite Nanopartikel 22, die an ihrer Oberfläche Füllmoleküle 9 und zweite Oligonukleotide 23 aufweisen. Die zweiten Oligonukleotide 23 enthalten eine Spacersequenz 6 S und eine Testsequenz 5 B'. Die Testsequenz 5 B' kann mit der komplementären Teilsequenz B des Komplements 13 auf der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 hybridisieren, wie in 6f gezeigt. Dadurch werden erste Nanopartikel 3 und zweite Nanopartikel 22 verbunden, so dass eine messbare Veränderung entstehen kann. Wenn das Original 12 in der Probe 11 nicht vorhanden ist, so entsteht an der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 kein Komplement 13, wie in 6b zu sehen ist. Da sich auf den ersten Nanopartikeln 3 jedoch kein Komplement 13 befindet, können erste Nanopartikel 3 und zweite Nanopartikel 22 sich nicht verbinden und die messbare Veränderung entsteht nicht. Die Sequenz B' ist in dieser Ausführungsform komplementär zur Sequenz B, sie kann aber auch zu Teilen der Sequenz A komplementär sein. Die Spacersequenz 6 S auf den ersten Nanopartikeln 3 ist mit der Spacersequenz 6 S auf den zweiten Nanopartikeln 22 identisch. In einer weiteren Ausführungsform können jedoch auf den ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 22 auch unterschiedliche Spacersequenzen 6 verwendet werden. Es können auch mehrere unterschiedliche Spacersequenzen 6 auf derselben Sorte von Nanopartikeln 8 verwendet werden. Die Puffer- und Hybridisierungsbedingungen, z. B. Temperatur, Salzkonzentrationen, Nanopartikelkonzentrationen, Konzentrationen sonstiger Pufferzusätze, pH-Wert, werden bevorzugt so gewählt, dass nur nach erfolgter Verlängerung der Primersequenz 5 A auf den ersten Nanopartikeln 3 eine Hybridisierung entstehen kann, die die ersten Nanopartikeln 3 mit den zweiten Nanopartikeln 22 verbindet. Die Verbindung der ersten Nanopartikel 3 mit den zweiten Nanopartikeln 22 kann z. B. als Rotverschiebung und Verbreiterung der Plasmonenresonanz im Extinktionsspektrum nachgewiesen werden. Die Verbindung kann auch z. B. durch Messung der Transmissionsänderung bei einer oder mehreren Wellenlängen nach optothermischer Anregung der Nanopartikel 8 und hieraus resultierender Denaturierung der Nukleinsäuren 1, die die ersten Nanopartikel 3 mit den zweiten Nanopartikeln 22 verbinden, detektiert werden. Die Testsonden 21 können in einem speziellen Hybridisierungspuffer zur Verfügung gestellt werden, zu dem zumindest ein Teil der Probe 11, die die ersten Nanopartikel 3 enthält, nach dem Verfahrensschritt, der die Synthese des Komplements 13 ermöglicht, hinzugegeben wird. Die Testsonden 21 können auch bereits von Beginn des Verfahrens an in der Probe zusammen mit den ersten Nanopartikeln 3 vorliegen. In diesem Fall können die Testsonden 21 passiviert werden, so dass sie nicht als Primer 7 wirken. Das Passivieren der Testsonden 21 kann darin bestehen, dass die Primersequenz 5 auf den Testsonden 21 so gewählt wird, dass bei der Annealingtemperatur während der PCR keine Hybridisierung der genannten Primersequenz 5 mit dem Original 12 stattfindet, sondern erst nach anschließender Absenkung der Temperatur. Das Passivieren der Testsonden 21 kann auch so geschehen, dass die zweiten Oligonukleotide 23, die Teilsequenzen des Originals 12 enthalten, am 3'-Ende auf den zweiten Nanopartikeln 22 befestigt sind, so dass die DNA-Polymerase 10 die zweiten Oligonukleotide 23 nicht verlängern kann. In diesem Fall können die zweiten Oligonukleotide 23 an ihrem 5'-Ende frei sein oder mit den zweiten Nanopartikeln 22 verbunden sein. Die Testsonden 21 können auch dadurch passiviert sein, dass eine Basenmodifikation, z. B. mit Dideoxycytosin (ddC) am 3'-Ende der zweiten Oligonukleotide 23 die Elongation verhindert.
In der Ausführung des Verfahrens, die in 6 gezeigt ist, werden erste Nanopartikel 3 aus Gold mit einem Durchmesser von 60 nm mit Oligonukleotiden 4 funktionalisiert (nach J. Hurst et al., Anal. Chem., 78(24), 8313–8318, 2006, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist). Dabei werden zu einem Teil Oligonukleotid 4 ID1 und als Füllmolekül 9 zu vier Teilen Oligonukleotid 4 ID2 eingesetzt. Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die ersten Nanopartikel 3 in einer Konzentration von 200 pM in einem PBS Puffer (20 mM PBS, 10 mM NaCl, 0,01% Tween 20, 0,01% Azid, 1 mM EDTA, pH 7,5) vor. Die Vervielfältigungsreaktion wird in einem Gesamtvolumen von 10 μl in 200 μl Probenröhrchen 24 durchgeführt (5 μl DreamTaq PCR Mastermix 2x (bezogen von Fermentas), 0,1 μl NaCl 5 M, 0,1 μl MgCl₂ 250 mM, 0,1 μl MgSO₄ 250 mM, 1 μl der funktionalisierten ersten Nanopartikel 200 pM, 1 μl Oligonukleotid 4 ID3 (als zu vervielfältigendes Original 12, dabei beträgt die zu bestimmende Konzentration des Originals 12 in dem Gesamtvolumen von 10 μl z. B. 0 pM, 10 pM, 20 pM oder 50 pM) gelöst in Wasser mit 100 nM Oligonukleotid 4 ID4 (Oligonukleotid 4 ID4 dient hierbei zur Absättigung von Oberflächen, z. B. während der Aufbewahrung des Original 12 vor der Reaktion), 2,7 μl Wasser). Wie in 7 dargestellt, werden die Probenröhrchen 24 D in einer Glasküvette 25 in einem Wasserbad 26 auf eine Temperatur von 65°C, was sowohl die Annealing- als auch die Elongationstemperatur darstellt, gebracht. Das Wasserbad 26 dient neben der Temperierung auch der besseren Einkopplung des Lasers 16 in die nicht-plane Oberfläche der Probenröhrchen 24. Das Wasser im Wasserbad 26 ermöglicht, dass der Brechungsindexunterschied zwischen dem Äußeren und dem mit PCR-Reaktionsmix gefüllten Inneren der Probenröhrchen 24 reduziert wird und somit eine Brechung des Laserstrahls und damit ein negativer Einfluss auf die Fokusqualität und -schärfe unterdrückt wird. Dadurch wird mit Vorteil das Einkoppeln des Lasers 16 verbessert. Der Laser 16, der zum Anregen der Nanopartikel dient, ist ein frequenzverdoppelter diodengepumpter Nd:YAg-Laser (Coherent Verdi V10), der bei einer Ausgangsleistung von 1,5 W mit einer F-Theta-Linse (Jenoptik, Brennweite 100 mm) hinter einem Spiegelscanner 18 (Cambridge Technologies, Pro Series 1) in die Probenröhrchen 24 im Wasserbad 26 fokussiert wird (Fokusdurchmesser circa 20 μm). Der Spiegelscanner 18 erlaubt, den Fokus zeilenweise durch die Probenröhrchen 24 zu bewegen, wie auch schon in 3 gezeigt, und somit das gesamte PCR-Reaktionsvolumen an der optothermischen Vervielfältigung zu beteiligen. Pro Probenröhrchen 24 werden 400 Zeilen mit einem Abstand von circa 12 μm bei einer Zeilengeschwindigkeit in dem Probenröhrchen 24 von circa 2 m/s mit dem Fokus abgefahren. Dies entspricht einem Zyklus im ersten Probenröhrchen 24. Anschließend werden nacheinander alle anderen Probenröhrchen 24 abgefahren, so dass jedes Probenröhrchen 24 einen Zyklus erfahren hat. Nach einer Wartedauer von 40 s nach dem Durchfahren des ersten Probenröhrchens 24 wird der nächste Zyklus gestartet und dies sooft wiederholt, bis jedes Probenröhrchen 24 insgesamt 25 Zyklen durchlaufen hat. Als Ausgangskonzentration des Originals 12 wird im ersten Probenröhrchen 24 0 pM, im zweiten Probenröhrchen 24 20 pM und im dritten Probenröhrchen 24 50 pM gewählt. Zur Negativkontrolle wird ein viertes Probenröhrchen 24 in das Wasserbad 26 eingesetzt, das ebenfalls das Original 12 in einer Konzentration von 50 pM aufweist, aber nicht vom Laserstrahl getroffen wird. Nachdem das erste, zweite und dritte Probenröhrchen 24 25 Zyklen durchlaufen hat, werden alle vier Probenröhrchen 24 aus dem Wasserbad 26 entfernt. Zur Untersuchung des Effektes der Laserzyklen und der Konzentration des Originals 12 dient eine Testsonde 21, die unter den gewählten Puffer- und Hybridisationsbedingungen nur auf die durch Verlängerung der nanopartikelgebundenen Primer 7 entstandenen Teilsequenzen hybridisieren kann. Dabei ist die Verlängerung der Primer 7 komplementär zum Original 12, wie in 6c gezeigt. Zur Herstellung der Testsonden 21 werden zweiten Nanopartikel 22 aus Gold mit einem Durchmesser von 60 nm mit Oligonukleotiden 4 funktionalisiert (nach J. Hurst, supra). Dabei wird zu einem Teil Oligonukleotid 4 ID5 und als Füllmolekül 9 zu vier Teilen Oligonukleotid 4 ID2 eingesetzt. Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die zweiten Nanopartikel 22 in einer Konzentration von 200 pM in einem PBS Puffer (20 mM PBS, 10 mM NaCl, 0,01% Tween 20, 0,01% Azid, 1 mM EDTA, pH 7,5) vor. Für die Hybridisierung der Oligonukleotide 4 auf den ersten Nanopartikeln 3 mit den Oligonukleotiden 4 auf den zweiten Nanopartikeln 22 wird ein modifizierter Phosphatpuffer eingesetzt (13 mM PBS, 200 mM NaCl, 0,02% Tween 20, 1 mM EDTA, 20 mM Natriumcitrat, 1 μg/ml PVP10, pH 7,5). 10 μl Hybridisierungsansatz enthalten 2,25 μl des modifizierten Phosphatpuffers, 3 μl Formamid, 2 μl NaCl 5M, 0,25 μl der 200 pM Testsonden-Lösung und 2,5 μl der entsprechenden PCR-Lösung aus der optothermischen Vervielfältigung, die die ersten Nanopartikel 3 enthält. Falls in dem Probenröhrchen eine ausreichende Menge des Originals 12 mit der Sequenz ID3 vorlag, so wird auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 das Oligonukleotid 4 mit der Sequenz ID1 verlängert und kann mit dem Oligonukleotid 4 mit der Sequenz ID5 auf der Oberfläche der Testsonde 21 hybridisieren, wie in 6f dargestellt. Der Nachweis dieser Hybridisierung erfolgt mittels optothermischer Anregung der Nanopartikel 8 (nach EP 2162549 , dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist). Die Probenröhrchen 24 werden dazu, wie in 16 dargestellt, mit Pulsen eines ersten Lasers 27 beschossen (50 μs Pulsdauer, 532 nm Wellenlänge, circa 700 mW Spitzenleistung, Fokusdurchmesser circa 30 μm). Hierdurch werden die Nanopartikel 8 optothermisch erhitzt und geben Wärme an ihre Umgebung ab. Falls erste Nanopartikel 3 und zweite Nanopartikel 22 durch die Hybridisierung von Oligonukleotiden 4, wie in 6f dargestellt, verbunden sind, so werden sie durch den Laserpuls getrennt. Dies kann durch einen in 16 dargestellten zweiten Laser 28 (Wellenlänge hier 630 nm, Leistung 5 mW kontinuierlich) nachgewiesen werden, dessen Fokus (30 μm Durchmesser) mit dem Fokus des ersten Lasers 27, der vorzugsweise ausschließlich zum Dehybridisieren genutzt wird, überlagert wird und der die Extinktion vor und nach dem Laserpuls des ersten Lasers 27 abfragt. Der optische Pfad auf dem die Extinktionsänderung optothermisch induziert und gemessen wird beträgt circa 2 mm. Die Intensität des durch diese Schicht transmittierten Lichts des zweiten Lasers 28 wird mit einer Photodiode 35 gemessen. Aus der Differenz des Photodiodenstromes vor und nach dem Puls wird die optothermisch induzierte Transmissionsänderung bestimmt, die durch das Dehybridisieren der verlängerten ersten Oligonukleotide 20 und zweiten Oligonukleotide 23 zwischen den Nanopartikeln 8 und das darauffolgende Auseinanderdiffundieren der Nanopartikel 8 erzeugt wird.
In 8a ist die relative Transmissionsänderung gezeigt, die durch den Laserpuls des ersten Lasers 27 und die hierdurch entstehende Dehybridisierung der Oligonukleotide 4 zwischen den ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 22 erzeugt wird und Maß für das Vorhandensein von Gold-DNA-Gold-Bindungen in dem Probenröhrchen 24 ist. Unterhalb des Diagramms in 8a ist in einer ersten Zeile die Anzahl der durchlaufenen Zyklen zu sehen. In einer zweiten Zeile, die unterhalb der ersten Zeile liegt, ist die Konzentration des Originals 12 in pM im Probenröhrchen 24 vor der Durchführung der Vervielfältigung dargestellt. Gezeigt sind auf der rechten Seite des Diagramms in 8a im Abschnitt B von links nach rechts das erste, zweite und dritte Probenröhrchen 24, das jeweils 25 optothermische Zyklen durchlaufen hat sowie das vierte Probenröhrchen 24 ohne optothermische Behandlung. Hier ist deutlich zu sehen, dass die gemessene Transmissionsänderung als Indikator für Gold-DNA-Gold-Bindungen mit steigender Konzentration des Originals 12 vor der Vervielfältigung ansteigt, wenn die 25 Zyklen durchlaufen wurden. Für das erste Probenröhrchen 24 ohne Original 12 und das vierte Probenröhrchen 24 ohne optothermische Behandlung ist nur eine geringe Transmissionsänderung zu beobachten. Dies zeigt, dass hier keine Verlängerung der Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 stattgefunden hat und somit auch keine Bindung zur Testsonde möglich ist. Lediglich nach dem Durchlaufen der optothermischen Zyklen und bei Vorhandensein des Originals kann es zu einer Verlängerung der Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 durch die DNA-Polymerase 10 kommen, was zu einer Verbindung der ersten Nanopartikel 3 mit den zweiten Nanopartikeln 22 und schließlich zu einer Transmissionsänderung als Folge der optothermisch induzierten Trennung der Nanopartikel 8 führt.
Als Vergleich ist in 8a im Abschnitt A auf der linken Seite das Ergebnis eines analogen Experimentes zu sehen, bei dem das Erhitzen der DNA jedoch nicht lokal durch optothermische Anregung der Nanopartikel 8 erfolgt, sondern global das gesamte Reaktionsvolumen 2 in einem herkömmlichen Thermocycler (Labnet Multi Gene II) erfolgt. Hier werden von links nach rechts das erste bis vierte Probenröhrchen 24 gezeigt, deren Inhalt identisch zu dem im vorigen Absatz beschriebenen Experiment ist. Erstes, zweites und drittes Probenröhrchen 24 wurden einem klassischen PCR-Protokoll unterzogen (93°C für 1 s, 53°C für 20 s, 35 Zyklen). Wie bei der optothermischen Erhitzung ist auch hier zu sehen, dass je mehr Original 12 vor der Vervielfältigung in dem jeweiligen Probenröhrchen 24 vorhanden war, desto größer fällt die gemessene Transmissionsänderung aus, die durch den Laserpuls und die hierdurch dehybridisierende DNA zwischen den ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 22 erzeugt wird und das Maß für das Vorhandensein von Gold-DNA-Gold-Bindungen in der Lösung ist. Das vierte Probenröhrchen 24, das zwar 50 pM des Originals 12 enthält, aber nicht zyklisch erhitzt wurde, zeigt nahezu keine Transmissionsänderung. Hier wurde also nicht in einem ausreichenden Umfang Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 verlängert.
8b zeigt ein ähnliches Experiment mit globaler Erhitzung des gesamten Reaktionsvolumens 2, jedoch bei konstanter Konzentration des Originals 12 im Probenröhrchen 24 von 10 pM vor der Vervielfältigung (zweite Zeile unterhalb des Diagramms) und ansteigender Zyklenzahl (erste Zeile unterhalb des Diagramms). Hier ist deutlich zu sehen, dass mit steigender Zyklenzahl auch die gemessene Transmissionsänderung größer wird, ein klares Zeichen dafür, dass umso mehr Primer 7 auf den ersten Nanopartikeln 3 verlängert werden, je mehr Zyklen durchlaufen werden und somit ein klares Zeichen dafür, dass der Ursprung des gemessenen Signals tatsächlich die erfolgte Elongation der Oligonukleotide 4 auf den ersten Nanopartikeln 3 durch die DNA-Polymerase 10 ist.
In einer Ausführung des Verfahrens wird nach dem Verlängern der Primersequenz 5 auf der Oberfläche 4 der ersten Nanopartikel 3, bei der ein nanopartikelgebundenes Komplement 13 entsteht, ein freier Rückwärtsprimer 15 verwendet, der an das 3'-Ende des Komplements bindet. In 1g ist gezeigt, dass das bereits synthetisierte Komplement 13 mit den Teilsequenzen A und B, das über eine Spacersequenz 6 auf der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 verbunden ist, mit einem zuvor frei in der Probe 11 vorhandenen Primer 7 B' hybridisiert. Dabei hat der Primer 7 die Sequenz B' und ist mit der Teilsequenz B des Komplements 13 verbunden. Ausgehend vom Primer 7 mit der Sequenz B' synthetisiert die DNA-Polymerase eine Kopie des Originals 12. In 1g wird auch gezeigt, dass das Original 12 an eine weitere Primersequenz 5 A auf der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 gebunden hat und eine DNA-Polymerase 10 ausgehend von der Primersequenz 5 A ein weiteres Komplement synthetisiert. Das Original 12, die Kopie des Originals 12 und die beiden mit dem ersten Nanopartikel verbundenen Komplemente 13 sind in 1h dargestellt. Eine nachfolgende Denaturierung durch Anregung der ersten Nanopartikel 3 führt dazu, dass das Original 12 und seine Kopie frei werden. Dabei können sowohl das Original 12 als auch seine Kopie in folgenden Schritten des Verfahrens als Vorlage zur Vervielfältigung dienen. Nach einer Wartedauer, die gegebenenfalls zur Hybridisierung von Original 12 und Kopien des Originals 12 mit Primersequenzen 5 A auf den ersten Nanopartikeln 3 und von freien Primern B' mit auf den ersten Nanopartikeln 3 bereits elongierten Primersequenzen 5 nötig ist, kann mit einer weiteren Anregung der ersten Nanopartikel 3 der nächste Zyklus des Verfahrens durchgeführt werden. Vorzugsweise wird der Zyklus wiederholt, bis sich ausreichend viele verlängerte Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 befinden und/oder ausreichend viele Kopien des Originals 12 in der Probe 11 befinden, um einen Nachweis der erfolgten Vervielfältigung beziehungsweise des Vorhandenseins des Originals 12 in der Probe 11 durchführen zu können. Durch einen freien Primer 7 B' ist, wie in 1g und 1h gezeigt, eine exponentielle Vervielfältigung des Originals 12 möglich. In 1a bis 1f ist ohne diesen freien Primer 7 jedoch nur eine lineare Vervielfältigung des nanopartikelgebundenen Komplements 13 zu erreichen.
Die Denaturierung der DNA kann in einem Ausführungsbeispiel in weniger als einer Millisekunde erfolgen. Auch bei 40 Zyklen benötigen die Denaturierung der DNA und das darauf folgende Abkühlen auf die Elongationstemperatur in diesem Ausführungsbeispiel insgesamt nur wenige Millisekunden. Dies bedeutet, dass die Dauer des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht mehr durch technische Limitationen wie die Heiz- und Kühlrate herkömmlicher Thermocycler bestimmt wird. Auch die Thermalisierungszeiten im Reaktionsvolumen 2 entfallen, da die Wärme stets in der Umgebung der Nanopartikel 8 erzeugt wird und sich eine Gleichgewichtstemperaturverteilung innerhalb von Nanosekunden einstellt. Dadurch kann eine PCR wesentlich beschleunigt werden.
Eine Möglichkeit die erfolgte Vervielfältigung nachzuweisen ist in 9 dargestellt. 9a und 9c fassen die exponentielle Vervielfältigung unter Verwendung eines gelösten Rückwärtsprimers 7 B' zusammen, wie sie schon in 1a bis 1h gezeigt ist. Danach werden Testsonden 21 zur Probe 11 hinzugegeben. Die Testsonden 21 bestehen in diesem Ausführungsbeispiel aus zweiten Nanopartikeln 22, die auf ihrer Oberfläche neben optionalen Füllmolekülen 9 auch mit der Testsequenz A' funktionalisiert sind, wie in 9d gezeigt. Optional kann zwischen der Testsequenz A' und der Oberfläche der zweiten Nanopartikel 22 noch eine Spacersequenz 6 S sein, die nicht identisch mit der Spacersequenz 6 S auf den ersten Nanopartikeln 3 aus 1 oder 9a sein muss. Die Testsequenz A' ist zumindest zu einem Teil der Primersequenz 5 A auf den ersten Nanopartikeln 3 komplementär. Die Testsequenz A' tritt gegenüber der Primersequenz 5 A in Konkurrenz mit den in dem Verfahren in 1a bis 1h gebildeten Kopien des Originals 12 mit der Teilsequenz A'. Das heißt, wenn viele Kopien des Originals 12 vorhanden sind, dann sind die Primersequenzen 5 A auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 bereits mit den Teilsequenzen A' der Kopien des Originals 12 besetzt. Die Primersequenzen 5 A können dann nicht oder nur in geringem Umfang mit den Testsequenzen A' auf den zweiten Nanopartikeln 22 hybridisieren. Damit werden die ersten Nanopartikel 3 mit den zweiten Nanopartikeln 22 nicht oder nur in einem geringem Ausmaß verbunden. Wie in 9c dargestellt, sind die elongierten Primersequenzen 5 A auf den ersten Nanopartikeln 3 hybridisiert mit dem Original 12 und seinen Kopien und bilden damit starre, doppelsträngige DNA, die ein sterisches Hindernis darstellen kann, auch dadurch wird ein Verbinden von ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 22 bei hoher Zahl von Kopien des Originals 12 verhindert. Bei Abwesenheit oder geringer Zahl von Original 12 und Kopien des Originals 12, liegen die ersten Nanopartikel 3 überwiegend mit unbesetzten Primersequenzen 5 A vor, wie in 9b gezeigt. Wenn nun die Testsonden 21 hinzugegeben werden, hybridisieren ihre zweiten Oligonukleotide 23 A' mit den unbesetzten Primersequenzen 5 A auf den ersten Nanopartikeln 3. Dabei werden die ersten mit den zweiten Nanopartikeln 22 verbunden, wie in 9e gezeigt. In dieser Ausführungsform ist das Ausmaß der Verbindung von ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 22 umso schwächer, je mehr Kopien des Originals 12 durch die Vervielfältigungsreaktion entstanden sind, was wiederum von der Konzentration des Originals 12 zu Beginn der Vervielfältigungsreaktion abhängt. Die Puffer- und Hybridisierungsbedingungen (z. B. Temperatur, Salzkonzentrationen, Nanopartikelkonzentrationen, Konzentrationen sonstiger Pufferzusätze, pH-Wert) werden so gewählt, dass bei erfolgter spezifischer Verlängerung der Primersequenz 5 A und erfolgter Synthese von Kopien des Originals 12 eine möglichst effiziente Unterdrückung der Hybridisierung der Primersequenzen 5 A mit den zweiten Oligonukleotiden 23 A' stattfindet. Zugleich werden die genannten Bedingungen so gewählt, dass bei nicht erfolgter Vervielfältigung eine möglichst effiziente Hybridisierung der Primersequenzen 5 A mit den zweiten Oligonukleotiden 23 A' entsteht. Die aus der Hybridisierung resultierende Verbindung von ersten Nanopartikeln 3 mit zweiten Nanopartikeln 22 kann z. B. als Rotverschiebung und Verbreiterung der Plasmonenresonanz im Extinktionsspektrum nachgewiesen werden oder durch Messung der Transmissionsänderung bei einer oder mehreren Wellenlängen nach optothermischer Anregung der Nanopartikel 8 und hieraus resultierender Denaturierung der nanopartikelverbindenden DNA. Alternativ kann der Nachweis beziehungsweise eine Quantifizierung der in dem Verfahren erzeugten Kopien des Originals 12 z. B. auch durch PCR, Realtime-PCR, quantitative Realtime-PCR, Gel-Elektrophorese oder mittels farbstoffgelabelten Sonden erfolgen.
Für die in 9 dargestellte Ausführung des Verfahrens werden erste Nanopartikel 3 aus Gold mit einem Durchmesser von 60 nm mit Oligonukleotiden 4 funktionalisiert, wie schon in dem in 6 gezeigten Ausführungsbeispiel, wobei hier das Verhältnis von Oligonukleotid 4 ID1 zu Oligonukleotid 4 ID2 1:9 beträgt. Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die ersten Nanopartikel 3 in einer Konzentration von 200 pM in einem PBS-Puffer (20 mM PBS, 10 mM NaCl, 0,01% Tween 20, 0,01% Azid, 1 mM EDTA, pH 7,5) vor. Die Vervielfältigungsreaktion wird in 10 μl Gesamtvolumen in 200 μl Probenröhrchen 24 durchgeführt (5 μl DreamTaq PCR Mastermix 2x (bezogen von Fermentas), 0,1 μl NaCl SM, 0,1 μl MgCl₂ 250 mM, 0,1 μl MgSO₄ 250 mM, 1 μl der funktionalisierten ersten Nanopartikel 3 200 pM, 1 μl Rückwärtsprimer ID6 500 nM, 1 μl Oligonukleotid 4 ID3 (als zu vervielfältigendes Original 12, dabei ist die zu bestimmende Konzentration des Originals 12 in dem Gesamtvolumen von 10 μl z. B. 0 pM oder 10 pM) gelöst in Wasser mit 100 nM Oligonukleotid 4 ID4 (Oligonukleotid 4 ID4 dient hierbei zur Absättigung von Oberflächen, z. B. während der Aufbewahrung des Original 12 vor der Reaktion), 1,7 μl Wasser). Die Probenröhrchen 24 werden in einer Glasküvette 25 in einem Wasserbad 26, wie in 7 dargestellt, auf 54°C temperiert. Dabei stellt 54°C sowohl die Annealing- als auch die Elongationstemperatur dar. Das Wasserbad 26 dient neben der Temperierung auch der besseren Einkopplung des Lasers 16 in die nicht-plane Oberfläche der Probenröhrchen 24. Das Wasser im Wasserbad 26 ermöglicht, dass der Brechungsindexunterschied zwischen dem Äußeren und dem mit PCR-Reaktionsmix gefüllten Inneren der Probenröhrchen 24 reduziert wird und somit eine Brechung des Laserstrahls und damit ein negativer Einfluss auf die Fokusqualität und -schärfe unterdrückt wird. Dadurch wird mit Vorteil das Einkoppeln des Lasers 16 verbessert. Der Laser 16, der zum Anregen der Nanopartikel 8 dient, ist ein frequenzverdoppelter diodengepumpter Nd:YAg-Laser (Coherent Verdi V10), der bei einer Ausgangsleistung von 3 W mit einer F-Theta-Linse (Jenoptik, Brennweite 100 mm) hinter einem Spiegelscanner 18 in die Probenröhrchen 24 im Wasserbad 26 fokussiert wird. Der Spiegelscanner 18 erlaubt, den Fokus zeilenweise durch die Probenröhrchen 24 zu bewegen, wie auch schon in 3 gezeigt, und somit das gesamte Reaktionsvolumen 2 an der optothermischen Vervielfältigung zu beteiligen. Pro Probenröhrchen 24 werden 400 Zeilen mit einem Abstand von circa 12 μm bei einer Zeilengeschwindigkeit in dem Probenröhrchen 24 von circa 2 m/s mit dem Fokus abgefahren. Dies entspricht einem Zyklus im ersten Probenröhrchen 24. Anschließend werden nacheinander alle anderen Probenröhrchen 24 abgefahren, so dass jedes Probenröhrchen 24 einen Zyklus erfahren hat. Nach einer Wartedauer von 40 s nach dem Durchfahren des ersten Probenröhrchens 24 wird der nächste Zyklus gestartet und dies wird entsprechend der vorgesehenen Zyklenzahl wiederholt. Es werden 7 Probenröhrchen 24 untersucht, die in 10a von links nach rechts dargestellt sind. Das erste und zweite Probenröhrchen 24 enthalten kein Original 12. In den dritten bis siebten Probenröhrchen 24 liegen als Ausgangskonzentration 10 pM des Originals 12 vor. Zur Kontrolle werden das erste und das dritte Probenröhrchen 24 nicht optothermisch behandelt. Das vierte Probenröhrchen 24 wurde mit 5 Zyklen, das fünfte Probenröhrchen 24 mit 15 Zyklen und das sechste Probenröhrchen 24 mit 25 Zyklen optothermisch behandelt. Das zweite und das siebte Probenröhrchen 24 wurden mit der Maximalzahl von 35 Zyklen optothermisch behandelt. Alle Probenröhrchen 24 sind über die gleiche Zeit hinweg im Wasserbad 26, lediglich die optothermische Ansteuerung ist unterschiedlich. Nachdem das zweite und siebte Probenröhrchen 24 alle 35 Zyklen durchlaufen haben, werden alle sieben Probenröhrchen 24 aus dem Wasserbad 26 entfernt. Ein Vorteil des Verfahrens ist, dass ohne großen Aufwand unterschiedliche Proben 11 mit einer unterschiedlichen Zyklenzahl behandelt werden können, dies kann z. B. in einer parallelisierten quantitativen PCR angewandt werden.
Zur Untersuchung des Effektes der Laserzyklen und der Konzentration des Originals 12 dient die Testsonde 21, die unter den gewählten Primer- und Hybridisierungsbedingungen vorzugsweise auf mit Primersequenzen 5 funktionalisierten ersten Nanopartikeln 3 hybridisieren kann, die nicht durch komplementäre Kopien des Originals 12 blockiert sind, die in der Vervielfältigungsreaktion erzeugt wurden. Dies entspricht der Testsonde 21, wie sie in 9 gezeigt ist. Zur Herstellung der Testsonden 21 wurden zweite Nanopartikel 22 aus Gold mit einem Durchmesser von 60 nm mit Oligonukleotiden 4 funktionalisiert (nach J. Hurst, supra). Dabei wurde zu vier Teilen Oligonukleotid 4 ID2 und zu einem Teil Oligonukleotid 4 ID7 eingesetzt. Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten lagen die zweiten Nanopartikel 22 in einer Konzentration von 200 pM in einem PBS Puffer (20 mM PBS, 10 mM NaCl, 0,01% Tween 20, 0,01% Azid, 1 mM EDTA, pH 7,5) vor. Für die Hybridisierung wurde ein modifizierter Phosphatpuffer eingesetzt (13 mM PBS, 200 mM NaCl, 0,02% Tween 20, 1 mM EDTA, 20 mM Natriumcitrat, 1 μg/ml PVP10, pH 7,5). 10 μl Hybridisierungsansatz enthalten 5,75 μl des modifizierten Phosphatpuffers, 1,5 μl Formamid, 0,25 μl der 200 pM Testsonden-Lösung und 2,5 μl der entsprechenden PCR-Lösung aus der optothermischen Vervielfältigungsreaktion, die die ersten Nanopartikel 3 enthält. Der Nachweis der Verbindung von ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 22 erfolgt durch optothermische Anregung der Nanopartikel 8, wie in 8a beschrieben. 10a zeigt die Transmissionsänderung, die durch den Laserpuls und die hierdurch dehybridisierende DNA zwischen den ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 22 erzeugt wird und ein Maß für das Vorhandensein von Gold-DNA-Gold-Bindungen in der Probe 11 ist. Gezeigt sind in 10a auf der linken Seite im Abschnitt A das erste und das zweite Probenröhrchen 24, die jeweils kein Original 12 enthalten, wobei das erste Probenröhrchen 24 keinen und das zweite Probenröhrchen 24 35 optothermische Zyklen durchlaufen hat. Beide Probenröhrchen 24 zeigen eine hohe gemessene Transmissionsänderung als Indikator für ein hohes Maß an Gold-DNA-Gold-Bindungen. Die unterschiedliche Anzahl an durchlaufenen Zyklen hat also in diesem Fall ohne Original 12 keinen Einfluss auf die gemessene Transmissionsänderung beziehungsweise auf das Maß an Gold-DNA-Gold-Bindungen, da kein Original 12 zur Vervielfältigung zur Verfügung stand und somit keine Blockierung der Primersequenzen 5 durch Kopien des Originals 12 stattfinden kann.
10a zeigt auf der rechten Seite im Abschnitt B das dritte bis siebte Probenröhrchen 24 mit steigender optothermischer Zyklenzahl in der Vervielfältigungsreaktion bei Ausgangskonzentration des Originals 12 von 10 pM. Hier ist deutlich zu sehen, dass die gemessene Transmissionsänderung als Indikator für Gold-DNA-Gold-Bindungen im Wesentlichen mit steigender durchlaufener optothermischer Zyklenzahl sinkt. Dies zeigt, dass umso mehr Kopien des Originals 12 erzeugt werden, je mehr Zyklen durchlaufen werden. Dabei ist bemerkenswert, dass bei der Ausgangskonzentration des Originals 12 von 10 pM zweimal so viele erste Nanopartikel 3 wie Originale 12 in der Probe 11 vorliegen. Jeder erste Nanopartikel 3 trägt dabei typischerweise 1000 bis 10000 Primersequenzen 5. In der Ausgangskonzentration des Originals 12 werden somit etwa eine in 2000 Primersequenzen 5 blockiert, was zu keiner signifikanten Unterdrückung der Gold-DNA-Gold-Bindungen zwischen ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 22 führt. Eine effektive Unterdrückung der Gold-DNA-Gold-Bindungen, die in 10a mit steigender optothermischer Zyklenzahl zu sehen ist, ist erst durch starke Vervielfältigung der ursprünglich geringen Konzentration des Originals 12 möglich.
10b werden mit einer alternativen Nachweismethode die Konzentration der Kopien des Originals 12 nach der Vervielfältigungsreaktion dargestellt. Dabei werden die Proben 11 aus den sieben Probenröhrchen 24 aus 10a zunächst 50fach mit Wasser verdünnt und anschließend eine Realtime-PCR durchgeführt, die einen quantitativen Nachweis der Kopien des Originals 12 erlaubt. Dazu wird ein Realtime-PCR-Ansatz verwendet, wobei 10 μl Ansatz aus 5 μl 2x Phusion Blood-PCR-Puffer (einschließlich dNTPs und MgCl₂; Biozym), 0,2 μl Phusion Blood Polymerase, 1 μl SybrGreen I (10x; Roche), 1 μl Primer ID5 5 μM und 1 μl Primer ID8 5 μM, 0,8 μl H2O und 1 μl der 50fach verdünnten Probe 11 enthalten. Für die Realtime-PCR wird zunächst eine Denaturierung bei 98°C für 1 min ausgeführt, anschließend finden 40 Zyklen statt, die jeweils aus 1 s bei 98°C, 5 s bei 66°C und 1 s bei 72°C bestehen. Die Fluoreszenz des SybrGreen I wird jeweils am Ende der Annealingphase bei 66°C gemessen. Für die Realtime-PCR wurde eine Stratagene Mx3005P von Agilent Technologies genutzt. Aufgetragen ist in 10b aus der y-Achse der Schwellwert-Zyklus (Ct-Wert) der Realtime-PCR, bei dem die Kopien des Originals 12 zum ersten Mal eine vorbestimmte Konzentration erreicht haben. Je höher die Konzentration der Kopien des Originals 12 zu Beginn der Realtime-PCR, desto kleiner ist der Schwellwert-Zyklus. Dabei bestätigen die Ergebnisse aus 10b die Ergebnisse aus 10a: Je mehr optothermische Zyklen bei einer gegebenen Anfangskonzentration des Originals 12 durchlaufen werden, desto höher ist die Anzahl der Kopien des Originals 12 nach der Vervielfältigungsreaktion.
Durch die optothermische Denaturierung werden bevorzugt nur geringe Teilvolumina der Probe 11 erhitzt, so dass es auch möglich ist, nicht thermostabile DNA-Polymerasen 10 einzusetzen. In einem Ausführungsbeispiel wird als DNA-Polymerase 10 das Klenow-Fragment 29 verwendet, das nicht thermostabil ist. Das Klenow-Fragment 29 weist den Vorteil auf, dass es mehr Salz in der Vervielfältigungsreaktion toleriert. Dadurch können bei Nachweisreaktionen mit ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 22 vorzugsweise bessere Reaktionsbedingungen gewählt werden, die zu besserer Spezifität und Sensitivität der Nachweisreaktionen führen können. Zudem bietet das Klenow-Fragment 29 den Vorteil, dass es mit 76 kDa kleiner als die üblicherweise verwendete Taq DNA-Polymerase mit 95 kDa ist. Dadurch erfährt das Klenow-Fragment 29 in der Nähe von mit Oligonukleotiden 4 funktionalisierten Nanopartikeln 8 weniger sterische Hinderung als die Taq DNA-Polymerase 10. Weiterhin bietet das Klenow-Fragment 29 den Vorteil, dass seine optimale Elongationstemperatur bei 37°C liegt. Die Elongation bei 37°C bietet den Vorteil, dass eine geringere thermische Belastung der Nanopartikel 8 stattfindet und somit geringere Anforderungen an die Stabilität der Nanopartikel 8 erforderlich sind, dabei besteht auch mehr Spielraum bei der Verwendung von potentiell nanopartikeldestabilisierenden Salzen. In diesem Ausführungsbeispiel, in dem das Klenow-Fragment 29 zur Vervielfältigung benutzt wird, werden zunächst erste Nanopartikel 3 aus Gold mit einem Durchmesser von 60 nm funktionalisiert, analog zu dem Verfahren, das in 1 verwendet wird. Dabei wird hier die kürzere Primersequenz 5 ID9 verwendet, da bei der geringeren Annealingtemperatur und den höheren Salzkonzentrationen eine höhere Spezifität in der Hybridisierung mit dem Original 12 erreicht werden kann. Das Verhältnis von Oligonukleotid 4 ID9 zu Oligonukleotid 4 ID2 beträgt 1:9. Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die ersten Nanopartikel 3 mit einer Konzentration von 200 pM in einem PBS-Puffer (20 mM PBS, 10 mM NaCl, 0,01% Tween 20, 0,01% Azid, 1 mM EDTA, pH 7,5) vor. Die Vervielfältigungsreaktion wird in 10 μl PCR-Mix in 100 μl Probenröhrchen durchgeführt (1 μl 10x Reaction Buffer für Klenow Fragment exo- (enthält keine dNTPs und keine Polymerase; Fermentas), 0,2 μl Klenow-Fragment exo- (Fermentas), 1 μl dNTPs, je 2,5 mM (Fermentas), 0,2 μl NaCl 5M, 0,2 μl MgCl2 250 mM, 0,2 μl MgSO4 250 mM, 1 μl erste Nanopartikel 3 in einer Konzentration von 200 pM, 1 μl Rückwärtsprimer ID6 500 nM, 1 μl Oligonukleotid ID3 als Original 12 (dabei liegt das Original 12 im PCR-Mix in einer Konzentration von z. B. 0 pM, 10 pM oder 20 pM vor), 4,2 μl Wasser). Die hier eingesetzten Salzmengen sind wesentlich höher als bei dem Beispiel aus 10. Mit der dort verwendeten DNA-Polymerase 10 wäre bei diesen Salzkonzentrationen keine ausreichende Vervielfältigung möglich. Wie in 7 dargestellt, werden die Probenröhrchen 24 in einer Glasküvette 25 in einem Wasserbad 26 auf 37°C temperiert. Die Temperatur von 37°C ist dabei sowohl Annealing- als auch Elongationstemperatur. Der Laser 16 dient zum Anregen der ersten Nanopartikel 3 und ist ein frequenzverdoppelter diodengepumpter Nd:YAg-Laser (Coherent Verdi V10), der bei einer Ausgangsleistung von 1,5 W mit einer F-Theta-Linse (Jenoptik, Brennweite 100 mm) hinter einem Spiegelscanner 18 (Cambridge Technologies, Pro Series 1) in die Probenröhrchen 24 im Wasserbad 26 fokussiert wird. Der Spiegelscanner 18 erlaubt, den Fokus zeilenweise durch die Probenröhrchen 24 zu bewegen, wie auch schon in 3 gezeigt, und somit das gesamte Reaktionsvolumen 2 an der optothermischen Vervielfältigung zu beteiligen. Pro Probenröhrchen 24 werden 1000 Zeilen mit einem Abstand von circa 5 μm bei einer Zeilengeschwindigkeit in dem Probenröhrchen 24 von circa 5 m/s mit dem Fokus abgefahren. Dies entspricht einem Zyklus im ersten Probenröhrchen 24. Anschließend werden nacheinander alle anderen Probenröhrchen 24 abgefahren, so dass jedes Probenröhrchen 24 einen Zyklus erfahren hat. Nach einer Wartedauer von 40 s nach dem Durchfahren des ersten Probenröhrchens 24 wird der nächste Zyklus gestartet und dies sooft wiederholt, bis jedes Probenröhrchen 24 insgesamt 35 Zyklen durchlaufen hat. Von links nach rechts in 11 erhalten die ersten drei Probenröhrchen 24 den genannten PCR-Mix einschließlich Klenow-Fragment 29 und dNTPs. Die Probenröhrchen 24 vier bis sechs enthalten Klenow-Fragment 29, aber keine dNTPs und die Probenröhrchen 24 sieben bis neun enthalten dNTPs, aber kein Klenow-Fragment 29. Die Probenröhrchen 24 eins, vier und sieben erhalten kein Original 12, zwei, fünf und acht erhalten 10 pM Original 12 und drei, sechs und neun erhalten 20 pM Original 12, wie in der Zeile unterhalb des Diagramms in 11 zu sehen ist. Nachdem alle Probenröhrchen 24 35 Zyklen durchlaufen haben, werden sie aus dem Wasserbad 26 entfernt. Zur Auswertung der Vervielfältigungsreaktion dient eine Testsonde 21, die der aus 9 entspricht. Für die Hybridisierung mit der Testsonde 21 wird ein modifizierter Phosphatpuffer eingesetzt (13 mM PBS, 200 mM NaCl, 0,02% Tween 20, 1 mM EDTA, 20 mM Natriumcitrat, 1 μg/ml PVP10, pH 7,5). 10 μl Hybridisierungsansatz enthalten 3,35 μl des modifizierten Phosphatpuffers, 3,3 μl Formamid, 0,6 μl NaCl 5M, 0,25 μl der 200 pM Testsonden-Lösung und 2,5 μl der entsprechenden PCR-Lösung nach der Vervielfältigung. Der Nachweis der Verbindung von ersten Nanopartikeln 3 und Testsonden 21 geschieht mit optothermischer Anregung der Nanopartikel 8. 11 zeigt die Transmissionsänderung, die durch den Laserpuls und die hierdurch dehybridisierende DNA zwischen den Nanopartikeln 8 erzeugt wird und ein Maß für das Vorhandensein von Gold-DNA-Gold-Bindungen in der Lösung ist, die Konzentration des Originals 12 vor der Reaktion wird dabei unterhalb des Diagramms gezeigt. Gezeigt sind auf der linken Seite von 11 im Abschnitt A die Ergebnisse für die Probenröhrchen 24 eins bis drei, die die für die PCR erforderlichen Bestandteile Klenow-Fragment 29 und dNTPs enthalten. Hier ist zu sehen, dass mit steigender Menge an Kopien des Originals 12, die gemessene Transmissionsänderung als Indikator für das Maß an Gold-DNA-Gold-Bindungen sinkt. Das nicht thermostabile Klenow-Fragment 29 kann in diesem Ausführungsbeispiel eine Vervielfältigung des Originals 12 durchführen, obwohl es keine hohen Temperaturen toleriert. Da jedoch in der hier vorliegenden optothermischen Vervielfältigungsreaktion die Probe 11 nur lokal erhitzt wird, erfährt das Klenow-Fragment 29 nur eine geringe thermische Belastung und kann somit über viele Zyklen hinweg das Original 12 vervielfältigen, ohne dabei zerstört zu werden. In 11 in der Mitte im Abschnitt B zeigt die Ergebnisse der Probenröhrchen 24 vier bis sechs, die keine dNTPs enthalten. Hier ist bei keiner der eingesetzten Konzentrationen des Originals 12 eine wesentliche Transmissionsänderung erkennbar. Dies bedeutet, dass keine Vervielfältigung stattgefunden hat. Im Abschnitt C in 11 rechts sind die Ergebnisse der Probenröhrchen 24 sieben bis neun dargestellt, die kein Klenow-Fragment 29 enthalten. Auch hier ist es zu keiner Vervielfältigung gekommen. Dieses Beispiel zeigt, dass das nicht thermostabile Klenow-Fragment 29 ebenfalls zur Durchführung einer Vervielfältigungsreaktion eingesetzt werden kann.
In dem in 12 dargestellten Ausführungsbeispiel wird die optothermische Vervielfältigung in Abhängigkeit von Bewegung des Laserstrahls durch das Reaktionsvolumen 2 gezeigt. Dabei wurden in 100 μl Probenröhrchen 24 Konzentrationen des Originals von 0, 1, 5, 20 und 50 pM gewählt, wie in der Zeile unterhalb des Diagramms in 12 zu sehen ist. Die Probenröhrchen 24 wurden wie in 7 dargestellt in einer Glasküvette 25 in einem Wasserbad 26 auf 60°C temperiert, wobei 60°C sowohl Annealing- als auch Elongationstemperatur darstellt. Die Durchführung der optothermischen Erhitzung erfolgt durch den Laser 16, der aus einem frequenzverdoppelten diodengepumpten Nd:YAg-Laser (Coherent Verdi V10) besteht, der bei einer Ausgangsleistung von 3 W mit einer F-Theta-Linse (Jenoptik, Brennweite 100 mm) hinter einem Spiegelscanner 18 (Cambridge Technologies, Pro Series 1) in die Probenröhrchen 24 im Wasserbad 26 fokussiert wird. Die 12 zeigt auf der linken Seite im Abschnitt A fünf Probenröhrchen 24 mit ansteigender Konzentration des Originals 12, die je für eine Sekunde optothermisch angeregt wurden, wobei der Laserfokus ohne Bewegung in der Mitte des Reaktionsvolumens 2 verharrte. Nachdem das erste Probenröhrchen 24 auf diese Weise für 1 s bestrahlt wurde, wird es für 40 s nicht bestrahlt. Dies entspricht einem Zyklus im ersten Probenröhrchen 24. Während der 40 s Wartezeit durchlaufen die übrigen Probenröhrchen 24 ihren ersten Zyklus. Die Zyklen werden insgesamt 35 Mal wiederholt. Der Nachweis der Hybridisierung zwischen den Nanopartikeln 8, die Primersequenzen 5 aufweisen und den Testsonden 21 erfolgt mittels optothermischer Anregung der Nanopartikel 8 wie schon in 10 gezeigt. Wie in 12 auf der linken Seite im Abschnitt A dargestellt, ist ohne Bewegung des Laserfokus kein Einfluss der Konzentration des Originals 12 auf die Transmissionsänderung zu sehen. Dies zeigt, dass keine wesentliche Vervielfältigung des Originals 12 stattgefunden hat. Die Ursache dafür ist, dass sich nur ein kleiner Bruchteil des gesamten Reaktionsvolumens 2 im Fokus befindet und nur die Nanopartikel 8 in diesem Teilvolumen an der Reaktion teilnehmen. Auf der rechten Seite der 12 im Abschnitt B sind fünf Probenröhrchen 24 mit von links nach rechts aufsteigender Konzentration des Originals 12 gezeigt, die ebenfalls jeweils für 1 s angeregt wurden, wobei jedoch zusätzlich der Laserfokus durch das Reaktionsvolumen 2 bewegt wurde. Auf diese Weise wird, wie schon in 3 dargestellt, das gesamte Reaktionsvolumen 2 zeilenweise durchfahren und somit an der optothermischen Reaktion beteiligt. In jedem Probenröhrchen 24 wurden 1000 Zeilen in einem Abstand von circa 5 μm bei einer Zeilengeschwindigkeit im Probenröhrchen 24 von circa 5 m/s mit dem Fokus abgefahren. Dies entspricht einem Zyklus im ersten Probenröhrchen 24. Anschließend werden nacheinander die nächsten Probenröhrchen 24 entsprechend abgefahren, bis alle fünf Probenröhrchen 24 abgefahren sind. Nach einer Wartezeit von 40 s gemessen ab dem Durchfahren des ersten Probenröhrchens 24 wird der nächste Zyklus gestartet und dies wird 35 Mal wiederholt. Dabei ist in 12 rechts im Abschnitt B eindeutig zu sehen, dass mit steigender Konzentration des Originals 12 die gemessene Transmissionsänderung sinkt. Dies ist ein Zeichen von einem sinkenden Maß an Gold-DNA-Gold-Bindungen. Allein durch die Bewegung des Fokus und bei unveränderter Laserleistung und Bestrahlungsdauer findet Vervielfältigung statt, da durch Bewegung des Fokus ein Großteil der Nanopartikel 8 in der Probe 11 an der Vervielfältigungsreaktion teilnehmen kann.
In 13 wird eine Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt, wobei eine Lichtquelle 17 einen Lichtstrahl über ein optionales erstes Objektiv 30 auf ein ablenkendes Element 32, z. B. einen Spiegel, und über ein optionales zweites Objektiv 31 auf ein Probenröhrchen 24 richtet. Dabei ist das Probenröhrchen 24 zusammen mit weiteren Probenröhrchen 24 auf einer drehbaren Einrichtung 33 gelagert, so dass durch Drehen der Einrichtung 33 verschiedene Probenröhrchen 24 zu verschiedenen Zeiten beleuchtet werden können. Damit ist es vorteilhafterweise erreichbar, dass auch durch eine Lichtquelle 17 mit einer geringen Leistung eine möglichst große Zahl von in Probenröhrchen 24 enthaltenen Nanopartikeln 8 angeregt werden können.
In 14 ist ein Ausschnitt eines erfindungsgemäßen Nanopartikels 8 dargestellt, der auf seiner Oberfläche Füllmoleküle 9 und Oligonukleotide 4 aufweist. Herkömmliche DNA-Polymerasen 10 synthetisieren entlang der Oligonukleotide 4 einen komplementären Strang (gestrichelt gezeichnet). Dabei erfahren die großen, herkömmlichen DNA-Polymerasen 10 in 14a durch die Füllmoleküle sterische Hinderung. In 14b erfahren die DNA-Polymerasen 10 sterische Hinderung durch die benachbarten Oligonukleotide 4. Die sterische Hinderung in 14a und 14b kann jeweils zu einem vorzeitigen Strangabbruch des neu synthetisierten Stranges führen. Das Klenow-Fragment 29 in 14c kann, da es kleiner ist als die herkömmlichen DNA-Polymerasen 10, zwischen den Füllmolekülen 9 und den Oligonukleotiden 4 hindurchreichen und kann den neuen Strang zu Ende synthetisieren. Selbst wenn das Klenow-Fragment 29 nicht zwischen den Füllmolekülen hindurchreichen kann, so kann doch das Klenow-Fragments 29 mit seinem aktiven Zentrum näher an die sterisch hindernden Füllmoleküle 9 heranreichen, dadurch erfolgt ein möglicher Strangabbruch des neu synthetisierten Stranges erst später. Kleinere Polymerasen ermöglichen somit die effektivere Nutzung von Partikeloberflächen-nahen Primersequenzen. Zudem kann in der Nähe der Nanopartikeloberfläche die lokal erzeugte Wärme besonders effektiv für den Denaturierungsschritt ausgenutzt werden. Zusätzlich ist eine Gegensequenz 34 mit der Sequenz A' gezeigt. Die Gegensequenz 34 ist komplementär zu einem Oligonukleotid 4 mit der Sequenz A auf dem Nanopartikel 8 und dient dazu, Oligonukleotide 4 mit der Sequenz A, die sich von den Nanopartikeln 8 unbeabsichtigt lösen, zu neutralisieren, so dass die Oligonukleotide 4 nicht als freie Primer 7 agieren können.
In dem in 15 dargestellten Ausführungsbeispiel wird die optothermische Vervielfältigung unter Verwendung von Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten gezeigt, wobei die kovalente Bindung zwischen ersten Nanopartikeln 3 und Primersequenzen 5 mit zwei Thiolen ausgeführt ist. Hierfür werden erste Nanopartikel 3 aus Gold mit einem Durchmesser von 60 nm mit Oligonukleotiden 4 funktionalisiert (nach J. Hurst, supra). Dabei werden Oligonukleotide 4 ID10 (bezogen von IDT Technologies, Inc.) eingesetzt, die im Vergleich zu Oligonukleotid ID1 am 5'-Ende anstatt eines Thiols ein Dithiol tragen. Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die ersten Nanopartikel 3 in einer Konzentration von 200 pM in einem PBS Puffer (20 mM PBS, 10 mM NaCl, 0,01% Tween 20, 0,01% Azid, 1 mM EDTA, pH 7,5) vor. Die Vervielfältigungsreaktion wird in einem Gesamtvolumen von 10 μl in 200 μl Probenröhrchen 24 durchgeführt (5 μl DreamTaq PCR Mastermix 2x (bezogen von Fermentas), 0,1 μl NaCl 5 M, 0,1 μl MgCl₂ 250 mM, 0,1 μl MgSO₄ 250 mM, 1 μl der funktionalisierten ersten Nanopartikel 200 pM, 1 μl Rückwärtsprimer ID6 500 nM, 1 μl Oligonukleotid 4 ID3 (als zu vervielfältigendes Original 12) gelöst in 0 bzw. 200 pM Konzentration in Wasser mit 100 nM Oligonukleotid 4 ID4 (Oligonukleotid 4 ID4 dient hierbei zur Absättigung von Oberflächen, z. B. während der Aufbewahrung des Original 12 vor der Reaktion), 1,7 μl Wasser). Wie in 7 dargestellt, werden die Probenröhrchen 24 in einer Glasküvette 25 in einem Wasserbad 26 auf eine Temperatur von 60°C, was sowohl die Annealing- als auch die Elongationstemperatur darstellt, gebracht. Die ersten beiden Probenröhrchen 24 werden als Negativkontrollen ins Wasserbad eingesetzt, aber nicht vom Laserstrahl getroffen. Als Ausgangskonzentration des Originals 12 wird im ersten Probenröhrchen 24 0 pM, im zweiten Probenröhrchen 24 20 pM gewählt. Das dritte und vierte Probenröhrchen werden optothermisch behandelt. Die Durchführung der optothermischen Erhitzung erfolgt durch den Laser 16, der aus einem frequenzverdoppelten diodengepumpten Nd:YAg-Laser (Coherent Verdi V10) besteht, der bei einer Ausgangsleistung von 3 W mit einer F-Theta-Linse (Jenoptik, Brennweite 100 mm) hinter einem Spiegelscanner 18 (Cambridge Technologies, Pro Series 1) in die Probenröhrchen 24 im Wasserbad 26 fokussiert wird. Pro Probenröhrchen 24 werden 500 Zeilen mit einem Abstand von circa 10 μm bei einer Zeilengeschwindigkeit in dem Probenröhrchen 24 von circa 5 m/s mit dem Fokus abgefahren. Dies entspricht einem Zyklus im dritten Probenröhrchen 24. Anschließend wird auch das vierte Probenröhrchen 24 abgefahren, so dass drittes und viertes Probenröhrchen 24 einen Zyklus erfahren haben. Nach einer Wartedauer von 40 s nach dem Durchfahren des dritten Probenröhrchens 24 wird der nächste Zyklus gestartet und dies sooft wiederholt, bis drittes und viertes Probenröhrchen 24 jeweils 35 Zyklen durchlaufen haben. Als Ausgangskonzentration des Originals 12 wird im dritten Probenröhrchen 24 0 pM, im vierten Probenröhrchen 24 20 pM gewählt. Nachdem das dritte und vierte Probenröhrchen 24 35 Zyklen durchlaufen haben, werden alle vier Probenröhrchen 24 aus dem Wasserbad 26 entfernt. Zur Untersuchung des Effektes der Laserzyklen und der Konzentration des Originals 12 dient die Testsonde 21, die unter den gewählten Primer- und Hybridisierungsbedingungen vorzugsweise auf mit Primersequenzen 5 funktionalisierten ersten Nanopartikeln 3 hybridisieren kann, die nicht durch komplementäre Kopien des Originals 12 blockiert sind, die in der Vervielfältigungsreaktion erzeugt wurden. Dies entspricht der Testsonde 21, wie sie in 9 gezeigt ist. Die Herstellung der Testsonde 21 und die Hybridisierungsbedingungen wurden bereits in 10 beschrieben. Die Diagramme in 15 zeigen Extinktionsspektren der Hybridisierungslösung, die sowohl Testsonde 21 als auch die entsprechende PCR-Lösung aus der optothermischen Vervielfältigungsreaktion enthält, die die ersten Nanopartikel 3 enthält. Aufgenommen wurden die Extinktionsspektren in einer Quarzküvette mit 3 mm optischem Pfad in einem Varian Cary 50 Spektrometer. Gezeigt sind in den Diagrammen je als durchgezogene Linie das Extinktionsspektrum direkt nach Zusammenbringen von PCR-Lösung aus der optothermischen Vervielfältigungsreaktion, die die ersten Nanopartikel 3 enthält mit der Testsonde 21, als gestrichelte Linie nach 6 Minuten Hybridisierung und als gepunktete Linie nach insgesamt 12 Minuten Hybridisierung. In 15a) sind die Spektren während der Hybridisierung der Testsonde 21 mit Nanopartikeln 8 des PCR-Produktes aus dem ersten Probenröhrchen, das vor der Vervielfältigungsreaktion kein Original 12 enthielt und keine optothermische Behandlung erfuhr, zu sehen. Hier ist eine deutliche Rotverschiebung und Verbreiterung der Plasmonenresonanz der Nanopartikel 3 mit zunehmender Hybridisierungszeit zu sehen, da Hybridisierung zwischen Testsonden 21 und Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 stattfindet. Eine Vergleichbare Hybridisierung ist auch in 15b) zu sehen, die die Hybridisierung der Testsonde 21 mit Nanopartikeln 8 des PCR-Produktes aus dem zweiten Probenröhrchen zeigt, das vor der Vervielfältigungsreaktion 20 pM Original 12 enthielt und keine optothermische Behandlung erfuhr. Auch in 15c), die die Hybridisierung der Testsonde 21 mit Nanopartikeln 8 des PCR-Produktes aus dem dritten Probenröhrchen zeigt, das vor der Vervielfältigungsreaktion kein Original 12 enthielt aber eine optothermische Behandlung erfuhr, ist eine vergleichbare Hybridisierung zu sehen. Die Hybridisierung in 15c) zeigt, dass auch nach optothermischer Behandlung noch Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 gebunden sind. Lediglich in 15d), die die Hybridisierung der Testsonde 21 mit Nanopartikeln 8 des PCR-Produktes aus dem vierten Probenröhrchen zeigt, das vor der Vervielfältigungsreaktion 20 pM Original 12 enthielt und eine optothermische Behandlung erfuhr, ist fast keine Veränderung der Extinktionsspektren mit zunehmender Hybridisierungszeit zu sehen. Allein im letzten Fall wurden während der optothermischen Vervielfältigungsreaktion ausreichend viele Kopien des Originals 12 erzeugt, die nun Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 blockieren, und somit eine Hybridisierung mit den Testsonden 21 verhindern. Dieses Beispiel zeigt, dass die optothermische Vervielfältigungsreaktion auch funktioniert, wenn Primersequenzen 5 mit Dithiolen an der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 kovalent gebunden werden und dass Extinktionsspektren zum Nachweis der Konzentration der Kopien des Originals 12 nach der Vervielfältigungsreaktion verwendet werden können.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
Bezugszeichenliste

1: Nukleinsäure
2: Reaktionsvolumen
3: erste Nanopartikel
4: Oligonukleotid
5: Primersequenz
6: Spacersequenz
7: Primer
8: Nanopartikel
9: Füllmolekül
10: DNA-Polymerase
11: Probe
12: Original
13: Komplement
14: Vorwärtsprimer
15: Rückwärtsprimer
16: Laser
17: Lichtquelle
18: Spiegelscanner
19: Spiegel
20: erstes Oligonukleotid
21: Testsonde
22: zweite Nanopartikel
23: zweites Oligonukleotid
24: Probenröhrchen
25: Glasküvette
26: Wasserbad
27: erster Laser
28: zweiter Laser
29: Klenow-Fragment
30: erstes Objektiv
31: zweites Objektiv
32: ablenkendes Element
33: drehbare Einrichtung
34: Gegensequenz
35: Photodiode

Sequenzen
SEQUENCE LISTING
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 4683202 [0002]
WO 2007/143034 A1 [0003]
EP 2162549 [0074]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

D. Renneberg und C. J. Leumann, ”Watson-Crick base-pairing properties of Tricyclo-DNA”, J. Am. Chem. Soc., 2002, Bd. 124, Seiten 5993–6002 [0030]
Silvia Albaladejo et al., Nano Letters, 2009, Band 9, Ausgabe 10, Seiten 3527 bis 3531 [0046]
Arthur Ashkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, Band 94, Ausgabe 10, Seiten 4853 bis 4860 [0046]
J. Hurst et al., Anal. Chem., 78(24), 8313–8318, 2006 [0074]

Claims

Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren (1), dadurch gekennzeichnet, dass Nanopartikel (8) in einem Reaktionsvolumen (2) durch Anregung Wärme an ihre Umgebung übertragen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Anregung der Nanopartikel (8) die Umgebung der Nanopartikel (8) lokal erhitzt wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren (1) durch eine Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel (8) durch einen Laser (16) angeregt werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel (8) mit Oligonukleotiden (4) konjugiert sind.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sorte von Konjugaten aus Nanopartikeln (8) und Oligonukleotiden (4) sowohl mit Vorwärtsprimern (14) als auch Rückwärtsprimern (15) konjugiert ist.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Verfahren Gegensequenzen (34) eingesetzt werden, die sich mit solchen Oligonukleotiden (4) verbinden können, die sich von den Nanopartikeln (8), mit denen sie zuvor verbunden waren, gelöst haben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass auf den Nanopartikeln (8) Füllmoleküle (9) aufgebracht sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide (4) auf den Nanopartikeln (8) als Teilsequenz eine Spacersequenz (6) aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wärme, die durch die Anregung der Nanopartikel (8) auf deren Umgebung übertragen wird, ausreicht, um die Oligonukleotide (4) auf der Oberfläche der Nanopartikel (8) von mit den Oligonukleotiden (4) hybridisierten Nukleinsäuren (1) zu dehybridisieren.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren einen globalen Erhitzungsschritt umfasst.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Annealingtemperatur gleich der Elongationstemperatur ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zu jedem Zeitpunkt des Verfahrens nur ein Anteil der Nanopartikel (8) durch Anregung geheizt wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine gerichtete Bewegung der Probe (11) relativ zu einem anregenden Feld stattfindet, so dass zu verschiedenen Zeiten Nanopartikel (8) in verschiedenen Teilvolumina der Probe (11) angeregt werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Verfahren eine DNA-Polymerase (11) verwendet wird, die thermolabil ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Produkte der Vervielfältigungsreaktion durch Testsonden (21) bestimmt wird.