JP2015511124A

JP2015511124A - 核酸の増幅のための方法

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Publication number: JP2015511124A
Application number: JP2014555234A
Authority: JP
Inventors: シュテーア，ヨアヒム; ビュルスゲンス，フェデリコ; ウレリッヒ，ラルス
Original assignee: ジーエヌエイ・バイオソリューションズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 2012-02-01
Filing date: 2013-02-01
Publication date: 2015-04-16
Also published as: DE102012201475B4; RU2603253C2; ES2596452T3; US20160281139A1; CN104093860A; WO2013113910A1; EP2809806B1; CN107604052A; EP2809806A1; CA2862912A1; PL2809806T3; US20140377764A1; AU2013214098A1; US9382583B2; AU2013214098B2; EP3101143B1; EP3101143A1; BR112014018737A2; CA2862912C; DK2809806T3

Abstract

反応体積（２）中のナノ粒子（８）が励起を介してその周囲に熱を転移させる、核酸（１）の増幅のための方法。

Description

本発明は、核酸の増幅のための方法に関する。

核酸の増幅のための方法は、当分野において知られている。特許明細書ＵＳ４６８３２０２は、核酸または核酸混合物中に含まれる特異的な核酸配列を増幅するためのプロセスを開示し、このプロセスでは、各核酸は、等しい長さまたは等しくない長さの２つの別々の相補鎖からなる。このプロセスは、（ａ）増幅されている異なる各配列について、各核酸鎖に対して相補的な各プライマーの延長産物が合成されるような条件下で、増幅されている異なる各特異的配列について、２つのオリゴヌクレオチドプライマーによって鎖を処理する工程であって、前記プライマーは、一方のプライマーから合成された延長産物がその相補体から分離された場合に他方のプライマーの延長産物の合成のためのテンプレートとして機能し得るように、各特異的配列の異なる鎖に対して十分に相補的であるように選択される工程；（ｂ）プライマー延長産物が合成されて一本鎖分子を産生するテンプレートから、プライマー延長産物を分離する工程；および（ｃ）工程（ｂ）から生成された一本鎖分子を、テンプレートとして工程（ｂ）で産生された一本鎖の各々を使用してプライマー延長産物が合成される条件下で、工程（ａ）のプライマーで処理する工程、を含む。これらの工程は、連続的にまたは同時に実施され得る。さらに、工程（ｂ）および（ｃ）は、所望の程度の配列増幅が達成されるまで、反復され得る。このプロセスにおいて、工程（ａ）および工程（ｃ）がポリメラーゼを使用して実施される場合、このプロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と一般に呼ばれる。

国際特許出願ＷＯ２００７／１４３０３４Ａ１は、ＰＣＲの実行に適していると思われる方法を開示している。これらの方法は、ＰＣＲにおいて加熱を提供するための光学的な供給源の使用を含み得る。これらの方法は、ＰＣＲ反応のリアルタイムモニタリングを可能にするために、表面プラズモン共鳴または蛍光共鳴エネルギー転移の使用もまた含み得る。これらの方法は、金などの表面または別の表面プラズモン共鳴活性を持つ表面に、テンプレート、プライマーまたはポリメラーゼを固定化する工程を含み得る。

特許出願ＵＳ２００２／００６１５８８Ａ１は、核酸を、外部シグナルに対して局所的かつ直接的に応答性にさせる方法を開示している。このシグナルは、核酸の、１つまたはいくつかの特異的な局在化した部分に対して、排他的に作用する。この発明によれば、このシグナルは、特異的核酸の特性を変化させることにより、その機能を改変し得る。従って、この発明は、サンプルの他の部分に影響を与えることなく、生物学的サンプル中の核酸の構造および機能を制御する方法を提供する。１つの実施形態では、モジュレーターが、核酸または核酸の一部に熱を転移させて、例えば、分子間結合または分子内結合の不安定化を生じさせ、ならびに核酸の構造および安定性の変更を生じさせる。好ましいモジュレーターには、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、磁性ナノ粒子、酸化物ナノ粒子および発色団が含まれる。これらの方法を、ＰＣＲと共に使用することもまた示唆されている。特に、モジュレーターを用いてＰＣＲ反応を制御することが提唱されている。

特許出願ＵＳ２００３／０１４３６０４Ａ１は、増幅反応、特にＰＣＲをモニタリングするための、ナノ粒子検出プローブの使用に関する。特に、この特許出願は、標的ポリヌクレオチドを定量的かつ定性的に検出するために、ウシ血清アルブミンなどの保護剤で処理したナノ粒子オリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を扱っている。この特許出願は、金ナノ粒子プライマーを使用した核酸の増幅および検出を開示している。第１の工程では、核酸標的は、プライマーで官能化した金ナノ粒子の存在下で変性される。第２の工程では、金ナノ粒子および金ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドが、核酸標的とハイブリダイズし、相補的ＤＮＡ配列のコピーが、ナノ粒子に付着されている核酸プライマーから開始して産生される。これらの工程１および工程２は反復され、増幅された相補的ナノ粒子プローブの結合によって作り出される光シグナルが検出される。

本発明の根本的な課題は、核酸の増幅のための改善された方法を提供することである。

この課題は、請求項１の特徴を有する方法によって解決される。この方法は、反応体積中のナノ粒子が、励起を介してその周囲に熱を転移させ、核酸を増幅する機能を果たす。

反応体積は、本発明による方法が実施される体積である。この体積は、反応容器によって囲まれ得る。反応体積はサンプルを含む。サンプルは、液体、好ましくは水を含む。この方法によって増幅され得る核酸は、サンプル中に含まれ得る。

本発明によるナノ粒子は、好ましくは、そのサイズに起因して、特別な光学特性、特に、バルク材料において観察されることがないまたはそれほど明確でない、特徴的な吸収スペクトルまたは散乱スペクトルを示す粒子である。好ましくは、ナノ粒子は、２ｎｍから５００ｎｍの間、より好ましくは３ｎｍから３００ｎｍの間、最も好ましくは５ｎｍから２００ｎｍの間の直径を有する。好ましいナノ粒子は、７ｎｍから１５０ｎｍの間の直径を有する。ナノ粒子は球状であり得るが、非球形形状、例えば、細長いナノ粒子（ナノロッド）もまた可能である。本発明の好ましい実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１種の半導体または１種の金属、好ましくは貴金属、例えば、金もしくは銀を含む。１つの実施形態では、ナノ粒子は、全体的に金属からなり、別の実施形態では、この金属は、ナノ粒子の一部のみ、例えばそのシェルを形成する。好ましいナノ粒子は、シェル−コアナノ粒子であり得る。好ましいナノ粒子は、その表面上に細孔を有し得、これらの細孔は、細孔の特性によって規定されるサイズおよび電荷を有する原子または分子によって占有され得、特に好ましくは、かかる原子または分子は、ナノ粒子が溶液中に位置付けられた場合にだけ、ナノ粒子に吸着される。本発明によれば、ナノ粒子は、その表面に吸着された原子および分子もまた含む。その材料吸収またはプラズモン共鳴に起因して、好ましいナノ粒子は、光エネルギーを吸収するのに適切である。

ナノ粒子の励起を介して、熱がナノ粒子からその周囲に転移される場合、これは、本発明によれば、エネルギーがナノ粒子に転移され、このナノ粒子がエネルギーの転移を介してその周囲を加熱することを意味する。ここでは、優先的に、励起を介して、直近の周囲が、ナノ粒子のより広い周囲よりも強く加熱される。典型的には、ナノ粒子は、励起を介して最初に加熱され、次いでその周囲に熱を転移させる。ナノ粒子の励起を介して、ナノ粒子自体が最初に加熱されることなしに、熱がその周囲に転移されることもまた考えられる。好ましくは、ナノ粒子の周囲は、球状体積であり、この体積は、この体積の中心に位置付けられたナノ粒子の直径の１００倍に等しい直径を有し、より好ましくは、この体積は、その中心のナノ粒子の直径の、１０倍、最も好ましくは４倍、好ましくは２倍未満の直径を有する。

好ましくは、ナノ粒子の励起を介して、ナノ粒子の周囲は、局所的に加熱される。特に速い温度変化は、加熱された体積が体積全体の一部に過ぎない場合に可能である。一方で、高い温度差異は、少量のエネルギーインプットだけで生じ得る。他方、加熱された体積の迅速な冷却は、ナノ粒子の照射後にその周囲が冷却されるように、照射された体積において十分に大きな低温のリザーバーが存在する場合に可能である。これは、ナノ粒子を十分に強く（所望の温度増加を獲得するため）、十分に短い時間（熱が局在化したままになるように）照射することによって達成され得る。

従って、本発明による局所的な加熱は、照射された個々の体積における（例えば、レーザーの焦点における）励起の間隔ｔが、臨界励起間隔ｔ１以下になるように選択される場合に存在する。ここで、ｔ１は、倍率ｓ１で乗算される平均ナノ粒子距離において、熱が１つのナノ粒子から次のナノ粒子に拡散するのに必要な時間である。｜ｘ｜が平均ナノ粒子距離であり、ナノ粒子間の媒体の熱拡散率がＤである場合、ｔ１は、ｔ１＝（ｓ１＊｜ｘ｜）^２／Ｄによって与えられ、この熱拡散率Ｄは典型的には、水溶液中でＤ＝１０^−７ｍ^２／ｓの値を有する。

倍率ｓ１は、励起間隔の間に粒子の温暖前線（ｗａｒｍｆｒｏｎｔ）がどの程度広がるかについての測定である。数個のナノ粒子の直径の距離にある励起されたナノ粒子によって引き起こされる温度増加は、粒子表面における最大温度増加のほんのわずかの一部に過ぎない。本発明の１つの実施形態では、数個のナノ粒子の温暖前線の重なりは、上の方程式に従う臨界励起間隔ｔ１の定義について、１より大きい倍率ｓ１が使用されるという意味では、許容される。本発明の別の実施形態では、温暖前線の重なりは、上の方程式に従う臨界励起間隔ｔ１の定義について、１以下の倍率ｓ１が使用されるという意味では、励起間隔（顕著に局所的な加熱に対応する）の間に、許容されない。本発明による局所的加熱の定義について、好ましくはｓ１＝１００、好ましくはｓ１＝３０、好ましくはｓ１＝１０、好ましくはｓ１＝７、好ましくはｓ１＝３、最も好ましくはｓ１＝１、好ましくは、ｓ１＝０．７、好ましくはｓ１＝０．３である。

照射された体積の表面に比較的多数のナノ粒子が位置付けられ、従ってより少ない加熱されたナノ粒子がその周囲に存在するように、照射された体積が、（例えば、適度に焦点の合ったレーザービームの焦点における）高いアスペクト比を示し、照射された体積からの顕著な熱流出が起こり、その結果、隣接ナノ粒子の加熱寄与がより長い期間の時間にわたりさらに無視できるままである場合に（とりわけ）、ｓ１＞１の値は有利であり得る。

これは、例えば、｜ｘ｜＝１．２μｍの平均ナノ粒子距離を生じる１ｎＭのナノ粒子濃度で、励起間隔がｔ１＝１４μｓ（倍率はｓ１＝１として選択される、Ｄ＝１０^−７ｍ^２／ｓ）より短いままである場合に、本発明による局所的加熱が起こることを意味している。ｔがｔ＞ｔ１であるように選択される場合、ナノ粒子から放出された熱は、照射の間に、拡散によって、平均粒子距離よりも大きい距離をカバーし得、これは事実上、多くのナノ粒子の温暖前線の重なりを導き、その結果、ナノ粒子間の体積全体における温度増加が存在すると仮定することができる。照射された体積における温度増加が空間的により均質であるほど、より長い加熱が起こるが、これは、ナノ粒子の周りの温度分布に対する影響が、最も近いナノ粒子によって発揮されるだけではなく、さらに遠い隣接粒子によっても発揮されるからである。

反応体積が、ｔ１より長い時間にわたって、ナノ粒子によって吸収される放射によって照射される場合、加熱は、全体的であると称される。

本発明による全体的加熱は、例えば、ペルチェ素子または抵抗ヒーターを用いて外側から反応体積を加熱することによって実施され得る。全体的加熱は、例えば、ナノ粒子によるよりも強くまたはナノ粒子によるのと等しい強さで水によって吸収される放射によって反応体積を照射することによっても、生じ得る。ここで、温度増加という用語は、励起直後の観察の時点における１つの位置における温度と、励起直前の同じ位置における温度との差異を意味する。

全体的加熱および局所的加熱は同時に起こり得る。

核酸の増幅のための公知の方法は、サンプルの少なくとも一部が加熱されることを必要とする、１つまたはいくつかの工程を含む。

本発明は、核酸の増幅のための方法において、反応体積全体が加熱される必要がないことを達成可能にすることができる。対照的に、ナノ粒子の励起を介して、反応体積の特定の一部のみを加熱することが可能である。有利なことに、かかる方法では、核酸の増幅のために加熱する必要がある反応体積の一部のみを加熱することが可能になる。従って、サンプルの熱感受性部分は保存され得る。より少ないエネルギーを転移させる必要がある場合に、局所的加熱は反応体積全体の全体的加熱よりも速くなり得る。従って、有利なことに、本発明は、より速い、より少ないエネルギーを必要とする、核酸の増幅のための方法を提供することを可能にする。

［本発明による好ましい実施形態］
核酸は、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され得る。ＰＣＲは、反応体積中で実施される。この反応体積は、増幅される１つの核酸を含み、この１つの核酸は、オリジナルと称される。オリジナルは一本鎖である。反応体積中で、オリジナルは、相補体と称されるその相補鎖と一緒になって二本鎖を形成し得る。オリジナルおよび相補体が二本鎖として存在する場合、この二本鎖は、第１の工程で変性されなければならない、即ち、二本鎖は２つの一本鎖に分裂されなければならない。融解は変性の別の用語である。変性は、変性温度と称される温度において生じる。反応体積は、プライマーと称される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドをさらに含む。一方のプライマーはフォワードプライマーと称され、他方はリバースプライマーと称される。フォワードプライマーは、オリジナルの３’末端に対して相補的である。リバースプライマーは、相補体の３’末端に対して相補的である。第２の工程では、フォワードプライマーがオリジナルとハイブリダイズし、リバースプライマーが相補体とハイブリダイズする。オリジナルまたは相補体の相補的部分とのプライマーのハイブリダイゼーションは、それぞれ、アニーリングと称される。第２の工程は、アニーリング温度と称される温度において生じる。反応体積は、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。第３の工程では、ＤＮＡポリメラーゼが、フォワードプライマーから開始して相補体のコピーを合成する。ＤＮＡポリメラーゼは、リバースプライマーから開始して、オリジナルのコピーを合成する。合成を通して、相補体のコピーはオリジナルとハイブリダイズされ、オリジナルのコピーは相補体とハイブリダイズされる。第３の工程は、伸長と称され、伸長温度と称する温度において実施される。その後、第１、第２および第３の工程は、所望の程度の増幅が達成されるまで周期的に反復され、ここで、オリジナルのコピーはオリジナルであり、相補体のコピーは相補体である。オリジナルが、オリジナルより長いＤＮＡ一本鎖上に位置付けられる場合、ＰＣＲは、オリジナルのコピーを産生するだけでなく、このＤＮＡ一本鎖のコピーもまた産生し、このコピーは、３’方向により長く、オリジナルを含む。従って、この場合、ＰＣＲは、相補体のコピーを産生するだけでなく、このＤＮＡ一本鎖に対して相補的なＤＮＡ一本鎖のコピーもまた産生し、このコピーは、３’方向により長く、相補体を含む。

ＰＣＲの別々の工程は、異なる温度で実施され得るため、１つまたはいくつかの加熱工程、および適用可能な場合、ＰＣＲの工程中または工程間に冷却工程を実施する必要があり得、加熱工程および冷却工程では、反応体積またはその一部が、それぞれ加熱または冷却される。好ましくは、加熱工程または加熱工程の少なくとも１つにおける加熱は、ナノ粒子の励起を介して少なくとも部分的に達成され、この加熱は好ましくは局所的加熱である。

ＰＣＲでは、変性温度は、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼを著しく損傷させることなしにＤＮＡの一本鎖が融解するように選択される。変性温度についての典型的な値は、例えば９５℃である。最適なアニーリング温度は通常、プライマーの配列および長さに依存する。典型的には、プライマーは、アニーリング温度が５０℃から６５℃の間になるように設計される。最適な伸長温度は典型的に、使用されるＤＮＡポリメラーゼに依存する。例えばＴａｑポリメラーゼを使用する場合、典型的には、７２℃の伸長温度が選択される。

ハイブリダイゼーションは、本発明の意味では、その各々が核酸および／またはオリゴヌクレオチドからなり得る２つの一本鎖からの二本鎖の形成を意味する。適切な反応条件下で、ハイブリダイゼーションは典型的に、互いに結合する２つの一本鎖によって達成され得る最低のエネルギー状態を導く。これは、言い換えれば、適切な反応条件下で、２つの一本鎖の配列に関して、最大の可能な相補性が生じるような方法で、２つの一本鎖が互いに結合することを意味する。

核酸Ａが核酸Ｂに対して部分的に相補的である場合、これは、核酸Ａの一部が、核酸Ｂの一部に対して相補的であることを意味する。

ナノ粒子の励起は、好ましくは、交流磁界によって、より好ましくは交流電磁場によって、最も好ましくは光学的に、生じる。好ましくは、励起は、遠赤外線光と遠紫外線光との間の範囲内（１００ｎｍ〜３０μｍの波長の範囲内）、より好ましくは近赤外線光から近紫外線光までの範囲内（２００ｎｍ〜３μｍの波長の範囲内）、最も好ましくは可視光の範囲内（４００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲内）で生じる。外側からの反応容器の従来の全体的加熱と比較すると、エネルギーがナノ粒子上に直接転移されるので、これは、反応容器の断熱壁を乗り越える必要がないという利点を提供し得る。この方法では、サンプルの所望の一部のより速い加熱が達成され得る。

本発明の好ましい実施形態では、これらのナノ粒子は、レーザーによって励起される。より好ましくは、レーザー光は、ナノ粒子の表面プラズモン共鳴を励起する周波数を有する。レーザーは、連続的に光を供給し得、またはパルス光として供給し得る。レーザーは、例えば、ガスレーザー、ダイオードレーザーまたはダイオード励起固体レーザーであり得る。照射された体積においてレーザーがナノ粒子を励起する時間間隔は、好ましくは、数ピコ秒から数秒までの領域内、より好ましくは数ナノ秒から数秒の間の領域内、最も好ましくは１０ｎｓから５００μｓの間の領域内である。好ましくは、励起間隔は、ナノ粒子の周囲において生じる熱が、平均ナノ粒子距離にわたって拡散するのに必要な平均時間よりも短く、その結果、平均して、隣接粒子の温暖前線の顕著な重なりは存在しない。より好ましくは、この励起間隔は、各照射されたナノ粒子の周りの温度増加が、平均して、２０ナノ粒子直径の距離、より好ましくは２ナノ粒子直径の距離、最も好ましくは１ナノ粒子直径の距離において、その最大の半分未満まで低下するように選択される。１つの実施形態では、１体積当たり短い照射期間のレーザーが好ましく、その結果、脱ハイブリダイズしたＤＮＡ一本鎖は、変性の間に、１００ｎｍ未満、より好ましくは２０ｎｍ未満、ナノ粒子から離れて拡散できるだけである。それにより、脱ハイブリダイズしたＤＮＡ一本鎖が同じナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに結合する確率が高くなる。これは、本発明による方法の加速を導き得る。好ましい実施形態では、プライマーがコンジュゲートされたナノ粒子の濃度は、１０ｎＭより低く、ここで、励起間隔は、好ましくは１ｎｓから１０μｓの間、より好ましくは１０ｎｓから１μｓの間、最も好ましくは１５ｎｓから３００ｎｓの間である。励起間隔は、１ｎｓよりも顕著に短くならないように選択されることが好ましく、そうでない場合、ＤＮＡ二本鎖の加熱期間は、ＤＮＡ二本鎖に含まれる一本鎖が拡散によって十分に分離するのには十分でなく、その結果これらは互いに即座には再ハイブリダイズしない。

デューティサイクルは、励起間隔対ＰＣＲサイクルの持続時間の比である。デューティサイクルは、好ましくは、局所的加熱によるＤＮＡ二本鎖の十分な変性を導くように、励起のために十分に大きくなるように選択される。同時に、このデューティサイクルは、サンプル全体の平均温度増加が、ハイブリダイゼーション、伸長および変性に対する攪乱を回避するのに十分に小さく維持されるように選択される。好ましくは、照射された体積についてのデューティサイクルは、５０％未満、より好ましくは２０％未満、最も好ましくは１％未満である。照射された体積におけるデューティサイクルは、好ましくは、１０^−１２より大きく、より好ましくは１０^−１０より大きく、より好ましくは１０^−９より大きく、最も好ましくは１０^−８より大きい。ナノ粒子が励起される表面の出力密度は、好ましくは、２０Ｗ／ｍｍ^２から１０００ｋＷ／ｍｍ^２の間、より好ましくは１００Ｗ／ｍｍ^２から１００ｋＷ／ｍｍ^２の間、最も好ましくは２５０Ｗ／ｍｍ^２から１０ｋＷ／ｍｍ^２の間である。

別の好ましい実施形態では、レーザー光のエネルギーは、その材料吸収に起因してナノ粒子に転移される。ナノ粒子の励起に使用される光はまた、例えば、熱ラジエーター、例えば、フラッシュバルブに起源し得る。本発明の別の好ましい実施形態では、これらのナノ粒子は、ナノ粒子において渦電流を誘導する交流電磁場または電磁波を介して励起される。適切に設計されたナノ粒子は、超音波によっても励起され得る。

オリゴヌクレオチドという用語は、本発明と関連して、好ましくは、（デオキシ）オリゴリボヌクレオチドだけでなく、その骨格（例えば、メチルホスホン酸、ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）またはペプチド核酸［ＰＮＡ］）上、特に骨格の糖上に、改変を有する１つまたは複数のヌクレオチドアナログ（例えば、２’−Ｏ−アルキル誘導体、３’−および／または５’−アミノリボース、ロックド核酸［ＬＮＡ］、ヘキシトール核酸、モルホリノ、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）またはトリシクロ−ＤＮＡ。これに関しては、Ｄ．ＲｅｎｎｅｂｅｒｇおよびＣ．Ｊ．Ｌｅｕｍａｎｎによる刊行物、表題「Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＴｒｉｃｙｃｌｏ−ＤＮＡ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００２、１２４巻、５９９３〜６００２頁を参照のこと。その関連の内容は、参照することにより本開示の一部をなすものとする）を含み、あるいは塩基アナログ、例えば、７−デアザプリン、またはニトロインドールなどのユニバーサル塩基、またはＮ４−エチルシトシンなどの改変天然塩基を含むオリゴヌクレオチドもまた含む。本発明の１つの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは、ＰＮＡなどの非ヌクレオシドアナログとのコンジュゲートまたはキメラである。１つの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の位置において、ヘキサエチレングリコールまたはＣ_ｎ−スペーサーなどのスペーサーなどの、非ヌクレオシド単位を含み、ここで、ｎは３から６の間である。オリゴヌクレオチドが改変を含む限りにおいて、これらは、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ分析物とのハイブリダイゼーションもまた改変と共に可能であるような方法で選択される。好ましい改変は、特にそれらのアミノ酸の異なる程度の相補性を有するハイブリッドを識別するために（ミスマッチ識別）、融解挙動、好ましくは融解温度に影響を与える。好ましい改変には、ＬＮＡ、８−アザ−７−デアザ−プリン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシンおよび／またはオリゴヌクレオチド中の脱塩基中断（abasic interruptions）が含まれる。本発明によるさらなる改変は、例えば、ビオチン、チオールならびに蛍光ドナー分子および蛍光アクセプター分子による改変である。

本発明の好ましい実施形態では、これらのナノ粒子は、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされる。この方法では、これらのナノ粒子は、ナノ粒子オリゴヌクレオチドコンジュゲートを形成する。この様式では、本発明による方法の一部を形成するオリゴヌクレオチドが、全体として反応体積を加熱する必要なしに、ナノ粒子の励起を介して特異的に加熱され得ることが達成され得る。特に好ましい実施形態では、これらのナノ粒子は、プライマーとコンジュゲートされる。より好ましくは、これらのナノ粒子は、ＰＣＲのフォワードプライマーおよびリバースプライマーとコンジュゲートされる。本発明の好ましい実施形態では、１つの種類のナノ粒子オリゴヌクレオチドコンジュゲートには、フォワードプライマーが付着されているが、リバースプライマーは付着されていない。別の種類には、リバースプライマーが付着されているが、フォワードプライマーは付着されていない。

本発明の別の好ましい実施形態では、１つの種類のナノ粒子オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとコンジュゲートされる。この実施形態では、オリジナルに対して相補的な新たなＤＮＡ一本鎖は、ナノ粒子上のフォワードプライマーから開始して、ＰＣＲにおいて合成される。新たなＤＮＡ一本鎖はフォワードプライマーを含むので、新たなＤＮＡ一本鎖は、ナノ粒子とコンジュゲートされる。合成直後に、新たなＤＮＡ一本鎖は、オリジナルと共に二本鎖を形成する。引き続く変性工程において、新たなＤＮＡ一本鎖は、オリジナルから分離される。アニーリング温度において、新たなＤＮＡ一本鎖は、ナノ粒子の表面上に位置付けられたリバースプライマーとハイブリダイズし、その結果ループが形成される。同じナノ粒子上のリバースプライマーとのハイブリダイゼーションのために、短い距離だけを横断する必要がある。好ましいナノ粒子濃度において異なるナノ粒子上のリバースプライマーとのハイブリダイゼーションを達成するために、横断すべき距離は、概してより大きい。従って、この実施形態では、アニーリングがより迅速に生じることおよびＰＣＲがより迅速に完了し得ることが、有利に達成可能である。

本発明の好ましい実施形態では、これらのナノ粒子は、プライマーとナノ粒子との間の１つより多いチオールとの共有結合が存在するような方法で、プライマーと連結される。一般に、ＰＣＲ緩衝液は、金ナノ粒子とプライマーとの間のチオール結合を不安定化し、特に熱負荷下で、例えば変性中に、ナノ粒子から脱離するプライマーを導き得るジチオスレイトールを含む。プライマーとナノ粒子との間の１つより多いチオールとの共有結合は、プライマーの脱離を減少させ得、従って、ＰＣＲ効率を改善し得る。

好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドが以前に連結されていたナノ粒子から脱離したかかるオリゴヌクレオチドに結合し得るカウンター配列が使用される。カウンター配列はオリゴヌクレオチドである。この方法では、ナノ粒子とコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドが、ナノ粒子から脱離して遊離することが生じ得る。遊離オリゴヌクレオチドが本発明によるプライマーである場合、遊離プライマーは、オリジナルまたは相補体に結合し得る。遊離プライマーがナノ粒子に結合していない場合、遊離プライマーは、ナノ粒子の励起によっても、それぞれオリジナルまたは相補体から脱ハイブリダイズされ得ない。それにより、この方法の効率および感度は減少する。カウンター配列は、遊離オリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的であり、遊離オリゴヌクレオチドの機能を制限するのに十分な親和性でこれらに結合する。この方法では、この方法の効率および感度は増加され得る。この方法の特に好ましい実施形態では、遊離プライマーを遮断するのに十分な量のカウンター配列が、オリジナルの添加の以前でさえも、サンプルに添加される。同時に、この量は、十分に大きい数の非遮断プライマーをナノ粒子が提示するのに十分に小さい。ナノ粒子上のプライマーの数が、遊離プライマーの数を超える場合に、これが可能である。

好ましい実施形態では、充填用分子がナノ粒子に付着される。この充填用分子は、サンプル中のナノ粒子の望ましくない凝集を防止する。従って、充填用分子は有利なことに、ナノ粒子を安定化する機能を果たす。ナノ粒子の電荷は、充填用分子を使用してモジュレートされ得る。この方法では、ナノ粒子の周囲中に存在する塩濃度は、ＤＮＡポリメラーゼが可能な限り迅速に合成できるように、かつ有利なことに、この方法が迅速に実施され得るように適合され得る。この充填用分子は、プライマーではなく、かつ好ましくはプライマーよりも短いオリゴヌクレオチドからなり得る。この充填用分子はまた、例えば、例えばポリエチレングリコールなどのポリマーからなり得る。好ましい実施形態では、この充填用分子は、ナノ粒子上のプライマーの数を減少させ、その代りに、この方法の効率を顕著な量で減少させることなしにより多くの充填用配列を使用することを可能にする。

この方法のさらに好ましい実施形態では、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、部分配列としてスペーサー配列を示す。スペーサー配列は、ナノ粒子により近いオリゴヌクレオチドの一部中に位置付けられる。この方法では、スペーサー配列は、スペーサーとしてオリゴヌクレオチドの残りの部分を提供する。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、プライマーの機能を有しかつプライマー配列と称される１つの部分配列、ならびにスペーサー配列である部分配列を含む。プライマー配列はスペーサー配列に起因して離れて間隔を置かれるので、増幅される核酸およびＤＮＡポリメラーゼは、有利なことに、プライマー配列へのより良いアクセスを獲得し得る。好ましい実施形態では、オリジナルのコピーおよび相補体のコピーは、スペーサー配列を介してナノ粒子の表面に付着したままである。特に好ましい実施形態では、スペーサー配列は、合成されたコピーがナノ粒子から切り離され得るように、制限エンドヌクレアーゼのための制限部位を含む。これは、好ましくは、方法の終結後に起こるが、この方法が実施されている最中でも起こり得る。こうして、この方法は、サンプル中に遊離して存在する核酸のコピーを産生することを可能にする。この方法の好ましい実施形態では、スペーサー配列は、プライマー配列が充填用分子によって覆い隠されないように、充填用分子と少なくとも同等の長さである。

好ましい実施形態では、ナノ粒子の励起を介してナノ粒子からその周囲に転移される熱は、ナノ粒子の表面上のオリゴヌクレオチドが、このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした核酸から脱ハイブリダイズするために十分である。この実施形態では、これらのナノ粒子は、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされ、このオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、少なくとも部分的に相補的な核酸にハイブリダイズされる。ナノ粒子の励起を介して、好ましくはナノ粒子の周りの水の温度が、オリゴヌクレオチドに結合した核酸からオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイズさせるのに十分であるように、熱エネルギーが周辺の水に転移される。特に好ましい実施形態では、本発明による方法はＰＣＲであり、ナノ粒子はプライマーとコンジュゲートされる。ＰＣＲを実施する場合、好ましくは二本鎖のＰＣＲ産物が形成され、その各々において、二本鎖ＰＣＲ産物の少なくとも１つの一本鎖が、ナノ粒子とコンジュゲートされる。この実施形態では、ナノ粒子の励起を介してナノ粒子の周りに変性温度を発生させ、反応体積全体を加熱することなく二本鎖ＰＣＲ産物の変性を実施することが、有利に達成可能である。この方法では、変性は、ＰＣＲがより迅速に生じ得るように、加速され得る。別の好ましい実施形態では、アニーリング温度および伸長温度もまた、ナノ粒子の励起を介して発生される。この方法では、好ましくは、アニーリング温度および伸長温度までのプローブ全体の加熱と比較した場合、小さい量のエネルギーだけが転移される必要がある。より好ましくは、ＰＣＲの変性、アニーリングおよび伸長は、全体的加熱なしに生じるが、もっぱらナノ粒子の励起による局所的加熱を介して生じる。このように、この方法は、全体的加熱のためのデバイスなしに実施され得、その結果、この方法を実施するために必要とされる装置がより少なくなる。

別の好ましい実施形態では、この方法は全体的加熱工程を含む。ここでは、この方法の少なくとも１つの工程における温度は、全体的加熱によって少なくとも部分的に達成される。本発明のより好ましい実施形態では、この方法はＰＣＲであり、アニーリング温度は、反応体積の全体的加熱によって獲得される。最も好ましくは、この反応体積は、アニーリングが起きる所定の温度範囲内へと、方法全体を通じて全体的に加熱される。ここでは、伸長温度および変性温度は、ナノ粒子の励起を介して達成される。それにより、有利なことに、全体的加熱を発生させるデバイスは、所定の温度を維持する必要があるだけなので、単純な設計で実行され得る。

別の好ましい実施形態では、アニーリング温度および伸長温度は、全体的加熱によって達成され、変性は、もっぱらナノ粒子の励起によって達成される。この方法では、有利なことに、全体的加熱を創出するデバイスは、２つの異なる温度を有する温度サイクルを発生させる必要があるだけであり、従って、単純な設計で実行され得ることが達成され得る。典型的には、伸長およびアニーリングは、狭い温度範囲内で生じる。これと対照的に、変性を達成するためには、特定の温度を上回る必要があるだけである。従って、変性を生じさせるためのナノ粒子の励起における不均一性は、アニーリング温度および伸長温度の調節におけるよりも、問題が小さい。従って、ナノ粒子の励起がもっぱら変性を発生させる機能を果たす好ましい実施形態は、より単純な様式で技術的に実行され得る。これは、全体的加熱が小さい温度増加だけを発生させる必要があるように、アニーリング温度および伸長温度が互いに非常に近接している好ましい場合、例えば、アニーリング温度が６０℃であり伸長温度が７２℃である場合に、特に当てはまる。

特に好ましい実施形態では、アニーリング温度は伸長温度と同じである。この場合、この方法はＰＣＲである。アニーリング温度が伸長温度と等しい場合、２つの異なる温度のみを有する温度サイクルが、ＰＣＲを実施するために必要であり、これは、この方法が単純な設定で実施できることを意味する。

好ましくは、プライマーの融解温度および使用されるＤＮＡポリメラーゼは、その融解温度において、使用されるＤＮＡポリメラーゼが十分な速度でＤＮＡをなおも合成できるように選択される。特に好ましい実施形態では、アニーリング温度と等しい伸長温度は、全体的加熱によって達成され、変性はナノ粒子の励起を介して獲得される。この方法では、全体的加熱を発生させるデバイスは、１つの温度を維持する必要があるだけなので、単純な様式で実行され得る。

好ましい実施形態では、ナノ粒子の一部だけが、この方法の実行の間に、任意の１つの点において励起される。この目的を達成するために、例えば、ナノ粒子の励起のための手段は、反応体積の一部におけるナノ粒子のみを励起するような方法で設計され得る。特に好ましい実施形態では、ナノ粒子は、レーザーを使用して光学的に励起され、反応体積中に光を導くオプティクスは、光が反応体積の一部中にのみ方向付けられるように設計される。励起されるナノ粒子の一部は、好ましくは、この方法の実行の間に変化する。言い換えれば、第１の時点で励起される第１のセットのナノ粒子は、第２の時点で励起される第２のセットのナノ粒子と同一ではない。この場合、第１のセットおよび第２のセットが同一でない限り、任意の数のナノ粒子が第１のセット中に存在し得、任意の数のナノ粒子が第２のセット中に存在し得る。例えば、これらのセットがこれらのセットの共通部分を形成するように、これら２つのセットのうち一方はもう一方と重なり得る。例えば、一方のセットが他方のセットよりも少ないナノ粒子を含むように、一方のセットは、他方のセットのサブセットであり得る。２つのセットはまた、ナノ粒子が第１のセットおよび第２のセット中に存在しないように、共通部分を形成しない方法でモデリングされ得る。例えば、１つの時点でナノ粒子が励起され、別の時点ではナノ粒子が励起されないように、２つのセットのうち１つは空のセットでもあり得る。好ましい実施形態では、第１のセットおよび第２のセットは、同じ数のナノ粒子を本質的に含む。特に好ましくは、異なる時点において、レーザーは、異なる画分のナノ粒子を励起する。それにより、この方法の実行において、ナノ粒子の画分を励起するのにちょうど十分なだけの、より低い出力を有するレーザーが使用され得る。特に好ましい実施形態では、２つ以上のレーザーが、異なる部分のナノ粒子を励起するために使用される。このように、有利なことに、反応体積の異なる部分にレーザーを方向付ける光学要素を必要とすることなしに、ナノ粒子の異なる画分を励起することが可能である。

本発明の別の好ましい実施形態では、異なる時点においてサンプルの異なる部分体積中のナノ粒子が励起されるように、励起場に対して方向付けられたサンプルの移動が生じている。より好ましくは、励起場はレーザーの光である。最も好ましい実施形態では、レーザーの光は、異なる時点において反応体積の異なる部分体積中のナノ粒子を励起するために、光学要素によって方向付けられる。光学要素は移動可能であり得、例えば、光学要素は、移動可能なミラー、空間的モジュレーターまたは音響光学モジュレーターを含み得る。レーザー自体もまた移動可能であり得る。サンプルの移動は、サンプルを含む反応容器を移動させることによって実行され得る。特に好ましい実施形態では、レーザービームおよび反応容器が移動される。さらなる好ましい実施形態では、サンプルは、レーザーの光が、異なる時点においてサンプルの異なる部分体積を捕捉するように、反応体積中で移動される。これは、例えば、磁気スターラーを使用することなどにより、反応体積中のサンプルを撹拌することによって達成され得る。反応体積は、例えば、チャネルまたはチューブなどの細長い形状を取り得る。サンプルは、例えば、１つのチャネルを通って移動され得、サンプルは、１つまたは複数の場所においてレーザービームを通過する。好ましくは、サンプルは、チャネルを通って流れ、ｎ個の位置を通過し、各位置において、１つのレーザービームがチャネル中のサンプルに方向付けられる。ｎ個のレーザービームを横切るサンプルの線状の流れに起因して、ｎサイクルのＰＣＲが実施される。このやり方では、この方法は、小量の移動可能な部分を用いて実施され得る。チャネルを使用することによって、例えばラボオンチップの意味において、小型化が可能である。好ましくは、レーザービームは変性を引き起こし、一方で伸長温度およびアニーリング温度は、全体的加熱により発生される。全体的加熱を通じて１つの温度だけを維持する必要があるように、伸長温度はアニーリング温度と等しいことが特に好ましい。この方法では、本発明による方法は、最小の努力で実施され得る。

好ましい実施形態では、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼがこの方法において使用される。ナノ粒子の励起が変性に使用される場合について、高温への反応体積全体の曝露は、回避され得る。むしろ、ナノ粒子の直近の周囲を変性温度までもっぱら加熱することが可能である。この方法では、直近の周囲中に位置していないＤＮＡポリメラーゼは、高温に曝露されない。それにより、熱安定性ではなく熱不安定性であるＤＮＡポリメラーゼを使用することが可能である。熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼを含めることによって、ポリメラーゼのより大きい選択肢が、本発明による方法について利用可能である。ＤＮＡポリメラーゼのより大きい選択肢に起因して、反応条件は、使用されるＤＮＡポリメラーゼの十分な動作を同時に維持しつつ、より大きい程度まで変動され得る。増幅される核酸がナノ粒子上の負に荷電したオリゴヌクレオチドに結合することができるようにするために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの動作に対して有害な影響を有し得る濃度で、サンプル中で、この方法の効率を減少させる物質、特に塩を使用することが必要であり得る。ＤＮＡポリメラーゼのより大きい選択肢、特に高い耐塩性を有するものは、この方法の効率の増加を導き得る。ＤＮＡポリメラーゼのより大きい選択肢の一部は、例えば、ＫｌｅｎｏｗフラグメントおよびＰｈｉ２９などの小さいＤＮＡポリメラーゼである。ナノ粒子の極めて近くで、大きい熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、付着し場合により既に伸長されたプライマーに起因して、立体障害を受け得る。結果として、ＤＮＡポリメラーゼがコピーされる核酸に到着しないか、またはＤＮＡポリメラーゼが、完全なコピーのオリジナルまたは相補体を合成する前に妨害され、このことがこの方法の効率の減少を引き起こす可能性がある。従って、ＤＮＡポリメラーゼのより大きい選択肢は、この方法の効率の増加を可能にする。ＤＮＡポリメラーゼにおけるより大きい選択肢に起因して、有利なことに、より低い産生コストを有する酵素もまた利用可能である。ナノ粒子の直近の周囲中に位置付けられていないＤＮＡポリメラーゼは、より小さい程度の熱誘導された非活性化を受ける。それにより、有利なことに、より少量のＤＮＡポリメラーゼが、この方法において使用され得る。

本発明の好ましい実施形態では、可溶性プライマーおよびナノ粒子上のプライマーが、反応体積中に存在する。可溶性プライマーは、ナノ粒子にコンジュゲートされておらず、サンプル中に溶解されている。好ましくは、可溶性プライマーは、ナノ粒子プライマーコンジュゲートよりも小さく、従って、ナノ粒子プライマーコンジュゲートよりも高い濃度で存在し得る。これに起因して、可溶性プライマーは、例えばゲノムＤＮＡなどの長い二本鎖核酸への、より良くより速いアクセスを有し得る。特に好ましい実施形態では、この方法の第１の工程では、長い二本鎖核酸は、反応体積全体の全体的加熱によって変性され、その後、可溶性プライマーがこの核酸にハイブリダイズする。最初に、ＰＣＲは、全体的加熱を用いて１つまたはいくつかのサイクルを介して実行され、その間に、ＤＮＡポリメラーゼが、長い二本鎖核酸の所望の短いコピーを合成する。引き続き、ＰＣＲが、ナノ粒子の励起を介した局所的加熱もまた使用して、継続される。

本発明の好ましい実施形態では、ナノ粒子プライマーコンジュゲートの粒子拡散は、光場を使用することによって増幅され得る。ナノ粒子が励起される光渦場（ＳｉｌｖｉａＡｌｂａｌａｄｅｊｏら、ＮａｎｏＬｅｔｔｅｒｓ、２００９、９巻、１０号、３５２７〜３５３１頁に従う。その関連の内容は、参照することにより本開示の一部をなすものとする）を介して、またはナノ粒子に対して発揮される光学力（ＡｒｔｈｕｒＡｓｈｋｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９７、９４巻、１０号、４８５３〜４８６０頁に従う。その関連の内容は、参照することにより本開示の一部をなすものとする）に起因して、ナノ粒子拡散は増加され得る。それにより、有利なことに、増幅される核酸の、ナノ粒子上のプライマーとのより速いハイブリダイゼーションが、所与のナノ粒子濃度において生じ得る。これは、本発明による方法の加速を達成するために利用され得る。

本発明の１つの実施形態では、増幅反応の産物の濃度は、試験プローブを用いて検出され得る。試験プローブは、その表面上に試験配列を有するオリゴヌクレオチドを含むナノ粒子である。この方法の好ましい実施形態では、試験プローブのオリゴヌクレオチドは、部分配列としてスペーサー配列を有する。スペーサー配列は、オリゴヌクレオチド上の、ナノ粒子により近い側に位置付けられる。従って、スペーサー配列は、スペーサーとしてオリゴヌクレオチドの残りの部分を提供する。好ましい実施形態では、試験プローブのオリゴヌクレオチドは、試験配列と称される部分配列と、スペーサー配列である部分配列との両方を含む。好ましい実施形態では、試験プローブは、それに付着した充填用分子を有する。試験配列は、増幅反応の産物とハイブリダイズし得る。ここでは、試験配列は、増幅反応の産物に対して好ましくは少なくとも部分的に相補的である。好ましい実施形態では、第１のナノ粒子は、フォワードプライマーとコンジュゲートされる。オリジナルおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、フォワードプライマーは、フォワードプライマーを介して第１のナノ粒子に結合した相補体が創出されるように、延長される。ここでは、相補体は、フォワードプライマーと、フォワードプライマーの延長によって創出される延長配列とからなる。特に好ましくは、ＰＣＲは、指数関数的増幅で、好ましくは多数のコピーのオリジナルおよび多数のコピーのナノ粒子にコンジュゲートされた相補体が産生されるように、可溶性および／またはナノ粒子にコンジュゲートされたリバースプライマーを使用して実施される。最も好ましくは、第１のナノ粒子は、その表面上に、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方を含む。任意選択的な中間工程では、オリジナルおよび場合によりそのコピーは、局所的加熱または全体的加熱を介して、相補体から変性される。次いで、第１のナノ粒子が以前に試験プローブと一緒にされていない場合、第１のナノ粒子は試験プローブと一緒にされる。試験プローブの試験配列は、延長配列に対して相補的であり、その結果、試験プローブは、試験配列を介して、第１のナノ粒子上の延長されたフォワードプライマーに結合できる。適切な反応条件では、第１のナノ粒子と試験プローブとの連結は、ナノ粒子に結合した相補体が存在する程度まで、生じる。これは、延長配列が形成されない場合、試験プローブとナノ粒子との間の連結が作成されないことを意味する。より好ましくは、試験プローブを使用する本発明による増幅および検出の反応条件は、第１のナノ粒子と試験プローブとの連結の程度が、どの濃度のオリジナルが増幅前のサンプル中に存在したかについての結論を引き出すのを可能にするように選択される。第１のナノ粒子と試験プローブとの連結を介して、測定可能な変化、例えば、吸収スペクトルにおけるプラズモン共鳴のレッドシフトまたは広幅化が生じ得る。特に好ましい実施形態では、試験プローブとナノ粒子との連結を介して生じる測定可能な変化は、増幅前のサンプル中のオリジナルの濃度と比例する。この方法では、有利なことに、単純なツールが、濃度を検証するために使用され得る。

別の好ましい実施形態では、この方法は、第１のナノ粒子とコンジュゲートされたフォワードプライマーと、遊離および／またはナノ粒子結合リバースプライマーとを含む。ナノ粒子がその表面上にフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むことが特に好ましい。第１の工程では、ＤＮＡポリメラーゼは、オリジナルの存在下で、フォワードプライマーを、ナノ粒子結合相補体へと延長させる。第２の工程では、ナノ粒子結合相補体に結合するリバースプライマーから開始して、オリジナルのコピーが合成される。その後、第１のナノ粒子がまだ試験プローブと一緒にされていない場合、第１のナノ粒子は、試験プローブと一緒にされる。この実施形態では、試験配列は、フォワードプライマーに対して相補的である。フォワードプライマーが延長されなかった場合、試験プローブは、第１のナノ粒子に良好に結合し得る。フォワードプライマーが延長された場合、フォワードプライマーへの試験配列の結合は、立体障害に起因して阻害される。オリジナルの新たに合成されたコピーが、延長されたフォワードプライマーとハイブリダイズする場合、延長されたフォワードプライマーに対する試験配列の結合は防止される。この方法では、第１のナノ粒子と試験プローブとの間の連結の程度は、増幅反応の産物、即ち相補体およびオリジナルのコピーが合成される程度まで、減少する。反応条件を適切に選択する場合、オリジナルの濃度が検出され得、その結果、測定可能な変化が小さいほど、増幅前にサンプル中に存在したオリジナルが多くなる。この測定可能な変化は、例えば、吸収スペクトルにおけるプラズモン共鳴のレッドシフトまたは広幅化であり得る。この方法では、有利なことに、特異的核酸の濃度の決定を可能にする単純な試験が設計され得る。

本発明は、核酸の増幅のための改善された方法を提供することを可能にする。

充填用分子、スペーサー配列およびプライマー配列とコンジュゲートされた本発明によるナノ粒子を概略図で示す図である。充填用分子スペーサー配列およびプライマー配列とコンジュゲートされた本発明によるナノ粒子を別の概略図で示す図である。レーザー、２次元ミラースキャナおよびサンプルを有する、本発明による方法を実施するための設定を概略図で示す図である。レーザー、ミラーおよびレーザービームに対して相対的に移動されるサンプルを有する、本発明による方法を実施するためのさらなる設定を概略図で示す図である。レーザー、１次元ミラースキャナおよび１次元において移動されるサンプルを有する、本発明による方法を実施するための別の設定を概略図で示す図である。ＤＮＡの陽性検出のための本発明によるナノ粒子および本発明による試験プローブを概略図で示す図である。レーザー、２次元ミラースキャナおよびウォーターバス中のサンプルチューブを有する、本発明による方法を実施するための別の設定を概略図で示す図である。ＤＮＡの陽性検出のための試験プローブを用いた、全体的加熱および局所的加熱による増幅反応の結果を２つの略図で示す図である。ＤＮＡの陰性検出のための本発明によるナノ粒子および本発明による試験プローブを概略図で示す図である。ＤＮＡの陰性検出のための試験プローブを用いた、全体的加熱および局所的加熱による増幅反応の結果を２つの略図で示す図である。非熱安定性Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを用いた増幅反応の結果を略図で示す図である。固定されたレーザービームおよび移動するレーザービームを用いた増幅反応の結果を略図で示す図である。光源、屈折要素および移動可能なサンプルチューブを有する、本発明による方法を実施するための設定を概略図で示す図である。充填用分子、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼを有する、本発明によるナノ粒子の一区画を概略図で示す図である。ＤＮＡの陰性検出のための試験プローブを用いた増幅反応の結果を４つの概略図で示す図である。サンプルチューブ中のナノ粒子の励起のための第１のレーザー、ならびにサンプルの透過を測定するための第２のレーザーおよび光ダイオードを概略図で示す図である。

図１は、ＰＣＲとして実行される、核酸１の増幅のための本発明による方法の１つの実施形態を示す。反応体積２は第１のナノ粒子３を含む。第１のナノ粒子３は、図１ａに示されるように、その表面上にオリゴヌクレオチド４を示す。１つの種類のオリゴヌクレオチド４は、それぞれ、部分配列として配列Ａを有するプライマー配列５を含み、さらなる任意選択的な部分配列としてスペーサー配列６Ｓを含む。プライマー配列５は、プライマー７の配列として規定される。スペーサー配列６Ｓは、増幅される核酸１がより良い効率でプライマー配列５に結合するように、およびＤＮＡポリメラーゼ１０がプライマー配列５へのより良いアクセスを見出すように、ナノ粒子８の表面から十分遠く離してプライマー配列５を維持する機能を果たす。プライマー配列５Ａを有するオリゴヌクレオチド４は、その３’末端が第１のナノ粒子３の反対側を向くように、例えば、チオール結合を介して第１のナノ粒子の表面に付着される。任意選択的に、別の種類のオリゴヌクレオチド４が、第１のナノ粒子３の表面上に存在し得、これらは充填用分子９Ｆである。充填用分子９を使用して、ナノ粒子８の電荷は、ナノ粒子８の望ましくない凝集が回避されるように、モジュレートされ得る。さらに、充填用分子９は、増幅される核酸１およびＤＮＡポリメラーゼ１０が、プライマー配列５へのより良いアクセスを見出すことができるように、ナノ粒子８の表面上の互いに対するプライマー配列５の距離を増加させ得る。これは、この方法の効率を増加させ得る。スペーサー配列６は、好ましくは充填用分子９と少なくとも同等の長さであり、その結果、有利なことに、プライマー配列５は、充填用分子９から突出する。

サンプル１１は、反応体積２中に存在し、このサンプル１１は、プライマー配列５、スペーサー配列６および充填用分子９を有する図１ａからの第１のナノ粒子３、ならびにこれに加えてｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼ１０を含む。検出される核酸１は、サンプル１１中に存在し得る。この実施形態では、検出される核酸１は、オリジナル１２とも呼ばれるＤＮＡ一本鎖であり、部分配列Ａ’および部分配列Ｂ’を含む。オリジナル１２は、例えば、５’末端もしくは３’末端上のオーバーハングとして、または２つの部分配列Ａ’とＢ’との間に、さらなる部分配列を含み得る。図１ｂでは、オリジナル１２は、第１のナノ粒子３の表面上のプライマー配列５Ａに、その部分配列Ａ’を用いて結合する。図１ｃでは、ＤＮＡポリメラーゼ１０が、オリジナル１２およびオリジナル１２にハイブリダイズしたプライマー配列５Ａに結合することが示されている。引き続き、ＤＮＡポリメラーゼ１０は、図１ｄに示される伸長工程において、プライマー配列５Ａの３’末端から開始して、オリジナル１２に対して相補的な核酸１を合成し、この核酸は、相補体１３と呼ばれ、第１のナノ粒子３の表面上のスペーサー配列６に連結される。図１ｅでは、第１のナノ粒子３に次いで、光が照射され、この光は、そのプラズモン特性または材料特性を理由として、第１のナノ粒子３によって吸収され、熱へと変換される。この熱は、第１のナノ粒子３の周囲に転移され、オリジナル１２およびオリジナル１２にハイブリダイズした新たに合成された相補体１３の領域内で、オリジナル１２が相補体１３から変性されるのに十分である。図１ｆに示されるように、オリジナル１２はここで再度遊離され、その結果、オリジナル１２は別のプライマー配列５に結合でき、さらなるナノ粒子結合相補体１３が、この方法のさらなるサイクルにおいて合成され得る。この方法では、相補体１３の濃度の直線的増加が、サイクルの数の増加と共に創出される。図１ｇおよび図１ｈに記載される方法の工程は、本文献において以下でさらに明確にされる。

図２は、ナノ粒子８がサンプル１１中に位置付けられた、本発明による方法の１つの実施形態を示す。ナノ粒子８は、その表面上に充填用分子９Ｆを示す。さらに、ナノ粒子８は、オリゴヌクレオチド４とコンジュゲートされている。第１の種類のオリゴヌクレオチド４は、スペーサー配列６Ｓおよびプライマー配列５Ａからなる。第２の種類のオリゴヌクレオチド４は、スペーサー配列６Ｓおよびプライマー配列５Ｂ’からなる。この実施形態では、増幅されるオリジナル１２は、部分配列Ａ、Ｃ、Ｂを有する一本鎖ＤＮＡ分子である（示さず）。ナノ粒子８の表面上のプライマー配列Ｂ’から出発して、ＤＮＡポリメラーゼ１０は、オリジナル１２に対して相補的な鎖を合成し、その結果、図２ａに示すように、配列Ｓ、Ｂ’、Ｃ’およびＡ’を有するＤＮＡ一本鎖が、ナノ粒子８上に位置付けられる。同時に、ＤＮＡポリメラーゼが、ナノ粒子８の表面上のスペーサー配列６Ｓと連結されたプライマー配列５Ａから開始して、オリジナル１２のコピーを合成したことを、図２ａにおいて見ることができる。図２ａ中の矢印によって示されるように、ナノ粒子８に付着したオリジナル１２のコピーは、同じナノ粒子８の表面上のプライマー配列５Ｂ’に、その部分配列Ｂによってハイブリダイズする。図２ａ中の第２の矢印は、ナノ粒子８の表面上で合成された相補体１３が、同じナノ粒子８の表面上のプライマー配列５Ａに、その部分配列Ａ’によってハイブリダイズすることを示す。これら２つのハイブリダイゼーションの結果は、図２ｂに示される。ここでは、オリジナル１２および相補体１３は、ナノ粒子８の表面上にループを形成する。図２ｃは、オリジナル１２に対して相補的な鎖がプライマー７Ｂ’から開始して合成され、この鎖はスペーサー配列６Ｓを介してナノ粒子８の表面に連結されることを示す。別のＤＮＡポリメラーゼ１０が、プライマー配列５Ａから開始してオリジナル１２のコピーを合成し、このコピーもまたスペーサー配列６を介してナノ粒子８の表面に連結される。２つの合成の結果を図２ｄに示す。この実施形態では、フォワードプライマー１４およびリバースプライマー１５は、同じナノ粒子８上に位置付けられる。この方法では、新たに合成されたＤＮＡ鎖は、同じナノ粒子８上のプライマー７に戻りハイブリダイズし得る。新たに合成されたＤＮＡ鎖は、相補的プライマー７に遭遇するために遠くまで移動する必要がないので、これは、本発明による方法の加速を導き得る。むしろ、新たに合成されたＤＮＡ鎖は、同じナノ粒子８の表面上の相補的プライマー７に特に迅速に結合でき、これは、ナノ粒子８上のプライマー７の高い局所濃度によって特に促進される。図２ｄにおける、例えばレーザー１６によるナノ粒子８の励起後、スペーサー配列６を介してナノ粒子８の表面に各々付着したオリジナル１２のコピーおよび相補体のコピーは、脱ハイブリダイズする。その後、ナノ粒子８に付着したオリジナル１２のコピーは、別の同一のナノ粒子８の表面に付着した相補体１３とハイブリダイズし得る。ハイブリダイゼーションを介してナノ粒子８が連結され、その結果測定可能な変化が生じる。この測定可能な変化は、例えば、サンプル１１の色変化であり得る。図２ａ〜２ｅに示される本発明による方法の実施形態は、オリジナル１２を検出する機能を果たす単純な試験を提供することを可能にする。

図３は、本発明による方法を実施するのに適した設定を示す。この設定は、この場合レーザー１６として実行される光源１７と、レーザー１６からの光をサンプル１１に方向付けることができる２次元ミラースキャナ１８とを含む。２次元ミラースキャナ１８は、レーザーを２次元で屈折させ得る。この設定では、サンプル１１における変性は、サンプル１１の一部上にレーザービームの焦点を合わせることによって生じる。この方法の間、レーザービームは、サンプル１１の異なる部分に当たるように、屈折される。図３に示す実施例では、レーザービームが、サンプル１１が位置付けられた反応体積２を行毎に通過して移動するように、レーザービームはミラースキャナ１８によって屈折される。図３では、サンプル１１中のレーザービームによって追跡される路は、破線で示される。この方法の間の任意の１つの時点において、サンプル１１の一部のみが励起されるという事実に起因して、より小さい出力アウトプットを有するレーザー１６が使用され得る。１マイクロ秒を下回る励起は、光熱加熱されたナノ粒子８の助けにより、ＤＮＡを変性させるのに十分であるので、およそ１０〜１００μｍのレーザー１６の典型的な焦点直径は、レーザーが通り抜ける各点におけるＤＮＡの変性を導きつつ、およそ１０〜１００ｍ／ｓの速度でレーザービームがサンプル１１をスキャンするのを可能にする。これは、大きいサンプル体積の非常に迅速なスキャンを可能にする。１ｃｍ^２の面積の完全なスキャンは、例えば、７８μｍの焦点直径、７８μｍの行間距離および１センチメートルの行長さにおいて１２８行で、１０ｍ／ｓのスキャニングレーザービームの速度で１２８ｍｓしかかからない。有利なことに、これは、全体的加熱を使用する変性工程が一般に必要とする時間よりも顕著に短い。例えば図３に示されるミラースキャナ１８およびいわゆるＦシータレンズなどの光学要素は、スキャンされるサンプル１１全体にわたる焦点品質およびサイズの良好な均質性を達成できる。継続的に発光するレーザー１６の代替法として、パルスレーザー１６または熱ラジエーターが使用され得る。

図４は、レーザー１６およびミラー１９が固定され、レーザー１６のレーザービームがミラー１９を使用してサンプル１１に対して方向付けられる、本発明による方法を実施するための設定を示す。ここでは、サンプル１１は、サンプル１１を移動させることによってサンプル１１全体またはサンプル１１の大部分にレーザー１６の焦点が到達し得るように、２次元で移動可能であるように配置される。

図５は、レーザー１６が固定され、ミラースキャナ１８が１次元においてレーザー１６のレーザービームを屈折させ得る、本発明による方法を実施するための設定を示す。ミラースキャナ１８およびサンプル１１を移動させることによってサンプル１１全体またはサンプル１１の大部分にレーザービームが到達し得るように、サンプル１１は、１次元で移動可能であるように配置される。本発明によるＰＣＲによって核酸１を検出するための１つの可能性を図６に示す。ここでは、その表面上に充填用分子９Ｆおよび第１のオリゴヌクレオチド２０を示す第１のナノ粒子３が、サンプル中に位置付けられている。第１のオリゴヌクレオチド２０は、図６ａに示すように、スペーサー配列６Ｓおよびプライマー配列５Ａからなる。部分配列Ａ’および部分配列Ｂ’を有するオリジナル１２がサンプル１１中に存在する場合、オリジナル１２は、第１のナノ粒子３の１つの上の相補的プライマー配列５Ａにハイブリダイズする。図６ｃに示すように、相補体１３がスペーサー配列６Ｓを介して第１のナノ粒子３の表面に連結されるように、ＤＮＡポリメラーゼ１０は、プライマー配列５Ａから開始して、部分配列Ａおよび部分配列Ｂを有する相補体１３を合成する。次の工程では、図６ｄに示される試験プローブ２１が、サンプルに添加される。試験プローブ２１は、その表面上に充填用分子９および第２のオリゴヌクレオチド２３を示す第２のナノ粒子２２である。第２のオリゴヌクレオチド２３は、スペーサー配列６Ｓおよび試験配列５Ｂ’を含む。試験配列５Ｂ’は、図６ｆに示すように、第１のナノ粒子３の表面上の相補体１３の相補的部分配列Ｂとハイブリダイズし得る。それにより、第１のナノ粒子３および第２のナノ粒子２２が連結され、その結果測定可能な変化が生じ得る。オリジナル１２がサンプル１１中に存在しない場合、図６ｂに見られるように、第１のナノ粒子３の表面上に相補体１３が創出されない。第１のナノ粒子３上に相補体１３が存在しない場合、第１のナノ粒子３および第２のナノ粒子２２は互いに連結できず、測定可能な変化は生じない。この実施形態では、配列Ｂ’は配列Ｂに対して相補的である。配列Ｂ’は、配列Ａの一部に対しても相補的であり得る。第１のナノ粒子３上のスペーサー配列６Ｓは、第２のナノ粒子２２上のスペーサー配列６Ｓと同一である。しかしさらなる実施形態では、異なるスペーサー配列６が、第１のナノ粒子３および第２のナノ粒子２２上で使用され得る。また、いくつかの異なるスペーサー配列６が、同じ種類のナノ粒子８上で使用され得る。緩衝液およびハイブリダイゼーション条件、例えば、温度、塩濃度、ナノ粒子濃度、さらなる緩衝液添加剤の濃度、ｐＨは、好ましくは、第１のナノ粒子３を第２のナノ粒子２３に連結させるハイブリダイゼーションが、第１のナノ粒子３上のプライマー配列５Ａの延長の完了後にのみ生じ得るように、選択される。第１のナノ粒子３と第２のナノ粒子２２との連結は、例えば、吸収スペクトルにおけるプラズモン共鳴のレッドシフトおよび広幅化として検出され得る。この連結は、ナノ粒子８の光熱励起およびその結果として起こる第１のナノ粒子３と第２のナノ粒子２２とを連結させる核酸１の変性後の、１つまたはいくつかの波長における透過の変化を測定することなどによっても、検出され得る。試験プローブ２１は、相補体１３の合成が可能になるこの方法の工程の後に第１のナノ粒子３を含むサンプル１１の少なくとも一部が添加される特別なハイブリダイゼーション緩衝液中に、供給され得る。試験プローブ２１は、第１のナノ粒子３と一緒に、この方法の開始前に既にサンプル中に存在し得る。この場合、試験プローブ２１は、プライマー７として作用しないように不動態化され得る。試験プローブ２１の不動態化は、プライマー配列５のオリジナル１２とのハイブリダイゼーションがＰＣＲの間のアニーリング温度においては生じないが、温度の引き続く低下後にのみ生じるような方法で、試験プローブ２１上のプライマー配列５を選択することであり得る。試験プローブ２１の不動態化は、ＤＮＡポリメラーゼ１０が第２のオリゴヌクレオチド２３を延長させることができないように、第２のナノ粒子２２の３’末端に、オリジナル１２の部分配列を含む第２のオリゴヌクレオチド２３を付着させることによって、創出され得る。この場合、第２のオリゴヌクレオチド２３は、その５’末端で遊離であり得るか、または第２のナノ粒子２２に連結され得る。試験プローブ２１は、伸長を防止する塩基改変、例えば、第２のオリゴヌクレオチド２３の遊離プライム末端におけるジデオキシシトシン（ｄｄＣ）によっても、不動態化され得る。

図６に示される方法の実施形態では、金製で６０ｎｍの直径を有する第１のナノ粒子３が、オリゴヌクレオチド４で官能化される（Ｊ．Ｈｕｒｓｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７８（２４）、８３１３〜８３１８、２００６に従う。その関連の内容は、参照することにより本開示の一部をなすものとする）。ここでは、１部のオリゴヌクレオチド４ＩＤ１、および充填用分子９として４部のオリゴヌクレオチド４ＩＤ２が使用される。官能化および６回の洗浄工程後、第１のナノ粒子３は、ＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＰＢＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、０．０１％アジド、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に２００μｌの濃度で存在する。増幅反応は、２００μｌサンプルチューブ２４中で１０μｌの総体積（５μｌのＤｒｅａｍＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒｍｉｘ２×（ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、０．１μｌの５ＭのＮａＣｌ、０．１μｌのＭｇＣｌ_２２５０ｍＭ、０．１μｌのＭｇＳＯ_４２５０ｍＭ、１μｌの官能化された第１の粒子２００ｐＭ、１００ｎＭオリゴヌクレオチド４ＩＤ４（例えば反応前のオリジナル１２の貯蔵の間などに、オリゴヌクレオチド４ＩＤ４は表面を飽和させる働きをする）を含む水中に溶解された１μｌオリゴヌクレオチド４ＩＤ３（増幅されるオリジナル１２として。ここで、１０μｌの総体積中で決定されるオリジナル１２の濃度は、例えば、０ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭまたは５０ｐＭである）、２．７μｌ水）中で実施される。図７に示すように、サンプルチューブ２４は、ウォーターバス２６中でガラスキュベット２５において６５℃の温度にされ、この温度は、アニーリング温度および伸長温度である。ウォーターバス２６は、正確な温度を維持することに加えて、サンプルチューブ２４の非平面表面中へのレーザー１６のより良いカップリングもまた提供する。ウォーターバス２６中の水は、ＰＣＲ反応混合物で満たされたサンプルチューブ２４の外側とその内側との間の屈折率における差異の低減を可能にする。従って、レーザービームの屈折ならびに焦点品質および鋭さに対する生じる負の影響が抑制される。それにより、有利なことに、レーザー１６のカップリングが改善される。ナノ粒子を励起する機能を果たすレーザー１６は、ミラースキャナ１８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰｒｏＳｅｒｉｅｓ１）の背後のＦシータレンズ（Ｊｅｎｏｐｔｉｋ、焦点距離１００ｍｍ）と共に、１．５Ｗのアウトプット出力の、ウォーターバス２６中のサンプルチューブ２４中に焦点を合わせた（焦点直径およそ２０μｍ）周波数倍増ダイオード励起：Ｎｄ：ＹＡｇレーザー（ＣｏｈｅｒｅｎｔＶｅｒｄｉＶ１０）である。ミラースキャナ１８は、図３に既に示したように、サンプルチューブ２４を通じて行毎に焦点を移動させること、および従って、光熱増幅においてＰＣＲ反応体積全体を含めることが可能である。１つのサンプルチューブ２４当たり、４００行が、サンプルチューブ２４におけるおよそ２ｍ／ｓの行速度で、およそ１２μｍの距離における焦点を用いてスキャンされる。これは、第１のサンプルチューブ２４における１サイクルに対応する。引き続き、全ての他のサンプルチューブ２４が、次々にスキャンされ、その結果各サンプルチューブ２４は１つのサイクルを経た。第１のサンプルチューブ２４のスキャン後の４０ｓの待機時間後、次のサイクルが開始され、これは、各サンプルチューブ２４が２５サイクルを完了するまで、反復される。オリジナル１２の出発濃度として、第１のサンプルチューブ２４において０ｐＭ、第２のサンプルチューブ２４において２０ｐＭ、第３のサンプルチューブ２４において５０ｐＭが選択される。陰性コントロールとして、これもまた５０ｐＭの濃度でオリジナル１２を含むがレーザービームが当たらない第４のサンプルチューブ２４が、ウォーターバス２６中に挿入される。第１、第２および第３のサンプルチューブ２４が２５サイクルを完了した後に、４つ全てのサンプルチューブ２４がウォーターバス２６から取り出される。レーザーサイクルおよびオリジナル１２の濃度の影響を試験するために、選択された緩衝液およびハイブリダイゼーション条件の下で、ナノ粒子結合プライマーの延長を介して産生された試験配列のみにハイブリダイズすることが可能な試験プローブ２１が使用される。ここでは、プライマー７の延長は、図６ｃに示すように、オリジナル１２に対して相補的である。試験プローブ２１を産生するために、金製で１６ｎｍの直径を有する第２のナノ粒子２２が、オリゴヌクレオチド４で官能化される（Ｊ．Ｈｕｒｓｔ、上記に従う）。ここで、１部のオリゴヌクレオチド４ＩＤ５、および充填用分子９として４部のオリゴヌクレオチド４ＩＤ２が使用される。官能化および６回の洗浄工程後、第２のナノ粒子２２は、２００ｐＭの濃度でＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＰＢＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、０．０１％アジド、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に存在する。第１のナノ粒子３上のオリゴヌクレオチド４と第２のナノ粒子２２上のオリゴヌクレオチド４とのハイブリダイゼーションのために、改変リン酸塩緩衝液が使用される（１３ｍＭのＰＢＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１μｇ／ｍｌのＰＶＰ１０、ｐＨ７．５）。１０μｌハイブリダイゼーション溶液は、２．２５μｌの改変リン酸塩緩衝液、３μｌホルムアミド、２μｌＮａＣｌ５Ｍ、０．２５μｌの２００ｐＭ試験プローブ溶液、および第１のナノ粒子３を含む光熱増幅からの２．５μｌの対応するＰＣＲ溶液を含む。配列ＩＤ３を有するオリジナル１２の十分な量がサンプルチューブ中に存在した場合、図６ｆに示すように、第１のナノ粒子３の表面上の配列ＩＤ１を有するオリゴヌクレオチド４は、延長され、試験プローブの表面上の配列ＩＤ５を有するオリゴヌクレオチド４とハイブリダイズできる。ハイブリダイゼーションは、ナノ粒子８の光熱励起を使用して検証される（ＥＰ２１６２５４９に従う。その関連の内容は、参照することにより本開示の一部をなすものとする）。この目的を達成するために、図１６に示すように、サンプルチューブ２４には、第１のレーザー２７からのパルス（５０μｓのパルス持続時間、５３２ｎｍの波長、およそ７００ｍＷのピーク出力、焦点直径およそ３０μｍ）が当てられる。それにより、ナノ粒子８は、光熱加熱され、その周囲に熱を転移させる。図６ｆに示されるように、オリゴヌクレオチド４のハイブリダイゼーションに起因して第１のナノ粒子３および第２のナノ粒子２２が連結される場合、これらは、レーザーパルスによって分離される。これは、図１６に示すように、第２のレーザー２８（波長６３０ｎｍ、出力５ｍＷ連続的）を使用して検出され得る。第２のレーザーの焦点（３０μＭ直径）は、脱ハイブリダイゼーションのみに使用されることが好ましい第１のレーザー２７の焦点と重ねられ、第２のレーザーの焦点が、第１のレーザー２７のレーザーパルスの前および後の吸収を検出する。吸収における変化が光熱によって誘導され測定される光路は、およそ２ｍｍに達する。この層を通って透過される第２のレーザー２８の光の強度は、光ダイオード３５を用いて測定される。光熱によって誘導された透過の変化は、パルスの前および後に光ダイオードにおける電流の差異から決定され、この透過の変化は、ナノ粒子８間の延長された第１のオリゴヌクレオチド２０および第２のオリゴヌクレオチド２３の脱ハイブリダイゼーションと、ナノ粒子のその後の互いに離れる拡散とによって発生する。

図８ａは、第１のレーザー２７のレーザーパルスおよび第１のナノ粒子３と第２のナノ粒子２２との間でのオリゴヌクレオチド４の生じた脱ハイブリダイゼーションによって発生される、相対的透過変化を示す。相対的透過変化は、サンプルチューブ２４中の金−ＤＮＡ−金結合の存在の測定である。図８ａ中の略図の下に、完了したサイクルの数が、第１行に示される。第１行の下に位置付けられた第２行に、増幅を実施する前のサンプルチューブ２４中のオリジナル１２の濃度が、ｐＭで示される。図８ａの右側のセクションＢ中の略図に、第１、第２および第３のサンプルチューブ２４が左から右へと示され、その各々は、２５回の光熱サイクルを完了している。これに加えて、光熱処理を全く受けていない第４のサンプルチューブ２４が示される。金−ＤＮＡ−金結合の指標として測定された透過変化は、２５サイクルが完了した時点で、増幅前のオリジナル１２の濃度の増加と共に増加することを、明らかに見ることができる。オリジナル１２を含まない第１のサンプルチューブ２４および光熱処理なしの第４のサンプルチューブ２４については、小さい透過変化のみが観察される。このことは、本明細書で、第１のナノ粒子３上のプライマー配列５の延長が起こらなかったこと、および従って、試験プローブに対する結合が不可能であることを示している。オリジナルの存在下で光熱サイクルを完了した後にのみ、第１のナノ粒子３上のプライマー配列５の延長が、ＤＮＡポリメラーゼ１０によって創出され得、これが、第１のナノ粒子３と第２のナノ粒子２２との連結、および最終的にはナノ粒子８の光熱的に誘導された分離の結果としての透過変化を導く。

比較として、図８ａは、左側のセクションＡに、ナノ粒子８の光熱励起を介して局所的にＤＮＡを加熱しなかったが、従来のサーマルサイクラー（ＬａｂｎｅｔＭｕｌｔｉＧｅｎｅＩＩ）において反応体積２全体を全体的に加熱した、対応する実験の結果を示す。左から右へと、第１から第４までのサンプルチューブ２４が示され、それらの内容物は、前の段落において記載した実験における内容物と同一である。第１、第２および第３のサンプルチューブ２４を、古典的ＰＣＲプロトコール（９３℃で１ｓ、５３℃で２０ｓ、３５サイクル）に供した。光熱加熱の場合と同様、より多くのオリジナル１２が増幅前に各サンプルチューブ２４中に存在するほど、レーザーパルスおよび第１のナノ粒子３と第２のナノ粒子２２との間のＤＮＡの生じた脱ハイブリダイゼーションによって創出される測定される透過変化はより大きくなることが観察され得、この透過変化は、溶液中の金−ＤＮＡ−金結合の存在の測定である。第４のサンプルチューブ２４は、５０ｐＭのオリジナル１２を含むものの、周期的に加熱されておらず、透過変化をほとんど示さない。この場合、第１のナノ粒子３上のプライマー配列５は、十分な程度まで延長されなかった。

図８ｂは、反応体積２全体の全体的加熱を伴う類似の実験を示すが、サンプルチューブ２４中のオリジナル１２の濃度は、増幅前に１０ｐＭで一定であり（略図の下の第２行）、一方でサイクルの数は増加していく（略図の下の第１行）。ここで、サイクルの数の増加と共に、測定される透過変化がより大きくなることを明らかに見て取ることができ、これは、第１のナノ粒子３上のより多くのプライマー７が延長されるほど、より多くのサイクルが完了されることの明確なサインであり、従って、測定されるシグナルの起源が実際に、ＤＮＡポリメラーゼ１０による第１のナノ粒子３上のオリゴヌクレオチド４の完了した伸長であることの明確なサインである。

この方法の１つの実施形態では、相補体の３’末端に結合する遊離リバースプライマー１５が、第１のナノ粒子３の表面４上のプライマー配列５の伸長後に使用され、その延長の間に、ナノ粒子結合相補体１３が産生される。図１ｇは、スペーサー配列６を介して第１のナノ粒子３の表面に連結された、既に合成された部分配列ＡおよびＢを有する相補体１３が、サンプル１１中に以前から遊離して存在していたプライマー７Ｂ’にハイブリダイズすることを示す。ここでは、プライマー７は、配列Ｂ’を有し、相補体１３の部分配列Ｂと連結されている。配列Ｂ’を有するプライマー７から開始して、ＤＮＡポリメラーゼは、オリジナル１２のコピーを合成する。図１ｇでは、オリジナル１２が第１のナノ粒子３の表面上の別のプライマー配列５Ａに結合しており、ＤＮＡポリメラーゼ１０が、プライマー配列５Ａから開始して別の相補体を合成することもまた示されている。第１のナノ粒子と連結された、オリジナル１２、オリジナル１２のコピーおよび２つの相補体１３が、図１ｈに示される。第１のナノ粒子３の励起を介した引き続く変性は、オリジナル１２を生じ、そのコピーは遊離する。ここでは、オリジナル１２およびそのコピーは、この方法の引き続く工程において増幅のためのテンプレートとして機能し得る。オリジナル１２およびオリジナル１２のコピーと、第１のナノ粒子３上のプライマー配列５Ａとのハイブリダイゼーション、ならびに遊離プライマーＢ’と、第１のナノ粒子３上の既に伸長されたプライマー配列５とのハイブリダイゼーションのために必要とされ得る待機時間後、この方法の次のサイクルが、第１のナノ粒子３の別の励起によって実施され得る。好ましくは、このサイクルは、もたらされる増幅またはそれぞれ、サンプル１１中のオリジナル１２の存在の検証を可能にするために、十分な量の延長されたプライマー配列５が第１のナノ粒子３上に存在するまで、および／または十分な量のオリジナル１２のコピーがサンプル１１中に存在するまで反復される。遊離プライマー７Ｂ’を使用することによって、図１ｇおよび図１ｈに示すように、オリジナル１２の指数関数的増幅が可能である。図１ａ〜１ｆでは、ナノ粒子結合相補体１３の直線的増幅だけが、この遊離プライマー７なしに達成可能である。ＤＮＡの変性は、１つの実施形態では、１ミリ秒未満で起こり得る。４０サイクルにおいてさえ、ＤＮＡの変性および引き続く伸長温度までの冷却は、この実験において全体で数ミリ秒しか必要としない。これは、本発明による方法の持続時間が、従来のサーモサイクラーの加熱速度および冷却速度などの技術的制限によって決定されないことを意味している。また、熱はナノ粒子８の周囲において通常発生され、平衡温度分布は数ナノ秒以内にもたらされるので、反応体積２における熱化時間は回避され得る。それにより、ＰＣＲは顕著に加速され得る。

達成された増幅を検証するための１つの可能性を図９に示す。図９ａおよび図９ｃは、図１ａ〜１ｈに既に示したような、溶解したリバースプライマー７Ｂ’を使用した指数関数的増幅を概説する。その後、試験プローブ２１がサンプル１１に添加される。この実施形態では、試験プローブ２１は、図９ｄに示されるように、その表面上で任意選択的な充填用分子９および試験配列Ａ’によって官能化された第２のナノ粒子２２からなる。任意選択的に、図１または図９ａからの第１のナノ粒子３上のスペーサー配列６Ｓと必ずしも同一でなくてよいスペーサー配列６Ｓが、試験配列Ａ’と第２のナノ粒子２２の表面との間に配置され得る。試験配列Ａ’は、第１のナノ粒子３上のプライマー配列５Ａの少なくとも一部に対して相補的である。試験配列Ａ’は、プライマー配列５Ａについて、図１ａ〜１ｈの方法において産生された部分配列Ａ’を含むオリジナル１２のコピーと競合する。これは、多数のコピーのオリジナル１２が存在する場合、第１のナノ粒子３の表面上のプライマー配列５Ａが、オリジナル１２のコピーの部分配列Ａ’によって既に占められていることを意味する。この場合、プライマー配列５Ａは、第２のナノ粒子２２上の試験プローブＡ’に対し、ハイブリダイズできないか、または限定された程度までしかハイブリダイズできない。従って、第１のナノ粒子３は、第２のナノ粒子２２に対し、連結されないか、または限定された程度までしか連結されない。図９ｃに示すように、第１のナノ粒子３上の伸長されたプライマー配列５Ａは、オリジナル１２およびそのコピーとハイブリダイズし、従って、立体障害をもたらし得る堅固な二本鎖ＤＮＡを形成する。また、これに起因して、第１のナノ粒子３と第２のナノ粒子２２との連結は、多数のオリジナル１２のコピーが存在する場合に、防止され得る。少数のオリジナル１２およびオリジナル１２のコピーの非存在下または存在下で、第１のナノ粒子３は、図９ｂに示すように、占有されていないプライマー配列５Ａを伴って主に存在する。試験プローブ２１が添加されると、第２のヌクレオチド２３Ａ’は、第１のナノ粒子３上の占有されていないプライマー配列５Ａにハイブリダイズする。これに起因して、第１のナノ粒子は、図９ｅに示されるように、第２のナノ粒子２２に連結される。この実施形態では、第１のナノ粒子３と第２のナノ粒子２２との連結の程度が弱いほど、より多くのオリジナル１２のコピーが増幅反応によって産生されており、これは、増幅反応の開始時のオリジナル１２の濃度に依存する。緩衝液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、塩濃度、ナノ粒子濃度、さらなる緩衝液添加剤の濃度、ｐＨ）は、プライマー配列５Ａの特異的延長の完了およびオリジナル１２のコピーの合成の完了後に、プライマー配列５Ａと第２のオリゴヌクレオチド２３Ａ’とのハイブリダイゼーションの抑制が可能な限り効率的であるように、選択される。同時に、これらの条件は、増幅が起こらなかった場合に、プライマー配列５Ａと第２のオリゴヌクレオチド２３Ａ’との効率的なハイブリダイゼーションが創出されるように、選択される。ハイブリダイゼーションから生じる第１のナノ粒子３と第２のナノ粒子２２との連結は、例えば、吸収スペクトルにおけるプラズモン共鳴のレッドシフトおよび広幅化によって、あるいは、ナノ粒子８の光熱励起およびナノ粒子連結ＤＮＡの生じた変性後の１つまたはいくつかの波長における透過変化を測定することによって、検証され得る。あるいは、この方法で産生されたオリジナル１２のコピーの検証または定量は、例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量リアルタイムＰＣＲ、ゲル電気泳動によって、または色素標識プローブを使用することによって、実施され得る。

図９に示される方法の実施形態では、金製で６０ｎｍの直径を有する第１のナノ粒子３が、図６における実施形態で既に示したように、オリゴヌクレオチド４で官能化されるが、図９におけるオリゴヌクレオチド４ＩＤ１対オリゴヌクレオチド４ＩＤ２の比は、１：９である。官能化および６回の洗浄工程後、第１のナノ粒子３は、ＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＰＢＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、０．０１％アジド、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に２００ｐＭの濃度で存在する。増幅反応は、２００μｌサンプルチューブ２４中で１０μｌの総体積（５μｌのＤｒｅａｍＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒｍｉｘ２×（ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、０．１μｌのＮａＣｌ５Ｍ、０．１μｌのＭｇＣｌ_２２５０ｍＭ、０．１μｌのＭｇＳＯ_４２５０ｍＭ、１μｌの官能化された第１のナノ粒子３２００ｐＭ、１μｌリバースプライマーＩＤ６５００ｎＭ、１００ｎＭオリゴヌクレオチド４ＩＤ４（ここで、オリゴヌクレオチド４ＩＤ４は、例えば反応前のオリジナル１２の貯蔵の間に、表面の飽和を提供する）を含む水中に溶解された１μｌオリゴヌクレオチド４ＩＤ３（増幅されるオリジナル１２として。ここで、１０μｌの総体積中で決定されるオリジナル１２の濃度は、例えば、０ｐＭまたは１０ｐＭである）、１．７μｌ水）中で実施される。図７に示すように、サンプルチューブ２４は、ウォーターバス２６中でガラスキュベット２５において５４℃の温度に維持される。

ここでは、５４℃は、アニーリング温度および伸長温度を構成する。ウォーターバス２６は、温度制御に加えて、サンプルチューブ２４の非平面表面中へとレーザー１６をより良くカップリングさせる機能も果たす。ウォーターバス２６中の水は、ＰＣＲ反応混合物で満たされたサンプルチューブ２４の外側と内側との間の屈折率における差異の低減を可能にし、従って、レーザービームの屈折ならびに焦点品質および鋭さに対する生じた負の影響の抑制を可能にする。それにより、有利なことに、レーザー１６のカップリングが改善される。ナノ粒子８を励起する機能を果たすレーザー１６は、ミラースキャナ１８の背後のＦシータレンズ（Ｊｅｎｏｐｔｉｋ、焦点距離１００ｍｍ）と共に、３Ｗのアウトプット出力でウォーターバス２６中のサンプルチューブ２４中に焦点を合わせた周波数倍増ダイオード励起Ｎｄ：ＹＡｇレーザー（ＣｏｈｅｒｅｎｔＶｅｒｄｉＶ１０）である。ミラースキャナ１８は、図３に示したように、サンプルチューブ２４を通じて行毎に焦点を移動させること、および従って、光熱増幅において反応体積２全体を含めることが可能である。１つのサンプルチューブ２４当たり、およそ１２μｍの距離を有する４００行が、サンプルチューブ２４におけるおよそ２ｍ／ｓの行速度で焦点を用いてスキャンされる。これは、第１のサンプルチューブ２４における１サイクルに対応する。引き続き、全ての他のサンプルチューブ２４が、次々にスキャンされ、その結果各サンプルチューブ２４は１つのサイクルを経た。第１のサンプルチューブ２４のスキャン後の４０ｓの待機時間後、次のサイクルが開始され、これは、所定の数のサイクルに従って反復される。図１０ａにおいて左から右へと示される７つのサンプルチューブ２４が試験される。第１および第２のサンプルチューブ２４は、オリジナル１２を全く含まない。第３から第７までのサンプルチューブ２４中には、１０ｐＭのオリジナル１２が、初期濃度として存在する。コントロールとして、第１および第３のサンプルチューブ２４は、光熱処理されない。第４のサンプルチューブ２４は５サイクルで光熱処理し、第５のサンプルチューブ２４は１５サイクルで光熱処理し、第６のサンプルチューブ２４は２５サイクルで光熱処理した。第２および第７のサンプルチューブ２４を、３５サイクルの最大数で光熱処理した。全てのサンプルチューブ２４は、同じ量の時間にわたりウォーターバス２６の内側にあり、光熱励起のみが異なっている。第２および第７のサンプルチューブ２４が全３５サイクルを完了した後、７つ全てのサンプルチューブ２４がウォーターバス２６から取り出される。この方法の１つの利点は、多大な努力なしに、異なるサンプル１１が異なる数のサイクルで処理され得、これが、例えば平行定量ＰＣＲにおいて適用され得ることである。

試験プローブ２１は、レーザーサイクルおよびオリジナル１２の濃度の影響を決定する機能を果たし、この試験プローブ２１は、選択されたプライマーおよびハイブリダイゼーション条件下で、好ましくは、プライマー配列５で官能化された第１のナノ粒子３にハイブリダイズし、これらのナノ粒子は、増幅反応において産生されたオリジナル１２の相補的コピーによって遮断されない。これは、図９に示されるような試験プローブ２１に対応する。試験プローブ２１を産生するために、金製で６０ｎｍの直径を有する第２のナノ粒子２２を、オリゴヌクレオチド４で官能化した（Ｊ．Ｈｕｒｓｔ、上記に従う）。ここでは、４部のオリゴヌクレオチド４ＩＤ２および１部のオリゴヌクレオチド４ＩＤ７が使用される。官能化および６回の洗浄工程後、第２のナノ粒子２２は、ＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＰＢＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、０．０１％アジド、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７、５）中に２００ｐＭの濃度で存在した。ハイブリダイゼーションのために、改変リン酸塩緩衝液を使用した（１３ｍＭのＰＢＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１μｇ／ｍｌのＰＶＰ１０、ｐＨ７．５）。１０μｌハイブリダイゼーション溶液は、５．７５μｌの改変リン酸塩緩衝液、１．５μｌホルムアミド、０．２５μｌの２００ｐＭ試験プローブ溶液、および第１のナノ粒子３を含む光熱増幅反応の２．５μｌの対応するＰＣＲ溶液を含む。第１のナノ粒子３と第２のナノ粒子２２との間の連結の検出は、図８ａに記載したように、ナノ粒子８の光熱励起によって生じる。図１０ａは、レーザーパルスおよび第１のナノ粒子と第２のナノ粒子２２との間のＤＮＡの生じた脱ハイブリダイゼーションによって引き起こされる透過の変化を示し、この透過変化は、サンプル１１中の金−ＤＮＡ−金結合の存在の測定である。図１０ａの左側のセクションＡには、第１および第２のサンプルチューブ２４が示され、これらは各々オリジナルを含まず、第１の単純なチューブ２４は光熱サイクルを１回も完了しておらず、第２の単純なチューブ２４は３５の光熱サイクルを完了した。両方のサンプルチューブ２４は、金−ＤＮＡ−金結合の高い測定の指標として、高い測定された透過変化を示す。オリジナル１２が存在しない場合、異なる数の完了したサイクルは従って、この場合、測定された透過変化に対しても金−ＤＮＡ−金結合の測定に対しても影響を有さない。これは、増幅に利用可能なオリジナル１２が存在せず、従って、オリジナル１２のコピーによるプライマー配列５の遮断が起こり得ないからである。

図１０ａは、右側のセクションＢに、１０ｐＭのオリジナル１２の初期濃度で、増幅反応において漸増する数の光熱サイクルを用いる、第３から第７までのサンプルチューブ２４を示す。ここで、金−ＤＮＡ−金結合の指標として測定された透過変化は、完了した光熱サイクルの数の増加と共に、本質的に減少することが明らかである。これは、より多くのオリジナル１２のコピーが産生されるほど、より多くのサイクルが完了されることを示す。ここでは、１０ｐＭのオリジナル１２の初期濃度において、オリジナル１２の２倍の量の第１のナノ粒子３がサンプル１１中に存在することが注目に値する。各第１のナノ粒子３は典型的に、１０００個から１００００個の間のプライマー配列５を保有する。オリジナル１２の初期濃度では、従って、２０００個のプライマー配列５のうちおよそ１個が遮断され、このことは、第１のナノ粒子３と第２のナノ粒子２２との間の金−ＤＮＡ−金結合の顕著な抑制を導かない。図１０ａに示すように、漸増する数の光熱サイクルによる金−ＤＮＡ−金結合の有効な抑制は、低い初期濃度のオリジナル１２のかなりの増幅を介してのみ可能である。

図１０ｂは、代替的検出法における増幅反応後のオリジナル１２のコピーの濃度を示す。ここでは、図１０ａの７つのサンプルチューブ２４からのサンプル１１は、最初に水で５０倍希釈され、引き続き、リアルタイムＰＣＲが実施されて、オリジナルのコピーの定量的検出を可能にする。この目的を達成するために、リアルタイムＰＣＲ溶液が使用され、その１０μｌは、５μｌの２×ＰｈｕｓｉｏｎＢｌｏｏｄＰＣＲ緩衝液（ｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ_２を含む。Ｂｉｏｚｙｍ）、０．２μｌのＰｈｕｓｉｏｎＢｌｏｏｄポリメラーゼ、１μｌのＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ（１０×；Ｒｏｃｈｅ）、１μｌプライマーＩＤ５５μＭ、および１μｌプライマーＩＤ８５μＭ、０．８μｌのＨ_２Ｏならびに１μｌの５０倍希釈したサンプル１１を含む。リアルタイムＰＣＲのために、最初に、９８℃における変性が１分間実施され、引き続き、各々９８℃で１秒間、６６℃で５秒間および７２℃で１秒間からなる４０サイクルが完了される。ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩの蛍光が、６６℃における各アニーリング期の最後に測定される。リアルタイムＰＣＲのために、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭｘ３００５Ｐを使用した。図１０ｂ中のｙ軸上に、オリジナルのコピーが初めて所定の濃度に達した、リアルタイムＰＣＲの閾値サイクル（Ｃｔ値）が示される。リアルタイムＰＣＲの開始時のオリジナル１２のコピーの濃度が高いほど、閾値サイクルは小さくなる。図１０ｂ中の結果は、図１０ａからの結果を確認する。オリジナル１２の所与の初期濃度において完了する光熱サイクルが多いほど、増幅反応後のオリジナル１２のコピーの数は大きくなる。

好ましくは、光熱変性では、非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ１０を使用することも可能であるように、サンプル１１の小さい部分体積だけが加熱される。１つの実施形態では、熱安定性でないＫｌｅｎｏｗフラグメント２９が、ＤＮＡポリメラーゼとして使用される。Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９は、増幅反応における耐塩性がより高いという利点を有する。それにより、好ましくはより良い反応条件が、第１のナノ粒子３および第２のナノ粒子２２を用いた検出反応において選択され得、検出反応のより良い特異性および感度を導き得る。これに加えて、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９は、７６ｋＤＡにおいて、典型的に使用される９５ｋＤＡのＴａｑＤＮＡポリメラーゼよりも小さいという利点を提供する。従って、オリゴヌクレオチド４で官能化されたナノ粒子８にごく接近して、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１０よりも少ない立体障害を受ける。さらに、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９は、その最適な伸長温度が３７℃であるという利点を有する。３７℃における伸長は、より小さい熱負荷がナノ粒子８に対して発揮される、従って、ナノ粒子８の安定性に関するより低い要件が必要であるという利点を有する。同時に、潜在的にナノ粒子を不安定化する塩の使用においてより高い柔軟性が存在する。Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９が増幅に使用されるこの実施形態では、金製で６０ｎｍの直径を有する第１のナノ粒子３が、図１で使用した方法と同様に、最初に官能化される。ここで、より短いプライマー配列５ＩＤ９が使用され、より低いアニーリング温度およびより高い塩濃度と同様、オリジナル１２とのハイブリダイゼーションにおけるより高い特異性が達成され得る。オリゴヌクレオチド４ＩＤ９対オリゴヌクレオチド４ＩＤ２の比は、１：９になる。官能化および６回の洗浄工程後、第１のナノ粒子３は、ＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＰＢＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、０．０１％アジド、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に２００ｐＭの濃度で存在する。増幅反応は、１００μｌサンプルチューブ中で１０μｌのＰＣＲ混合物（Ｋｌｅｎｏｗフラグメントエキソ−について１μｌの１０×反応緩衝液（ｄＮＴＰもポリメラーゼも含まない。ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、０．２μｌのＫｌｅｎｏｗフラグメントエキソ−（ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、１μｌのｄＮＴＰ、各２．５ｍＭ（ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、０．２μｌのＮａＣＬ５Ｍ、０．２μｌのＭｇＣｌ２２５０ｍＭ、０．２μｌのＭｇＳＯ４２５０ｍＭ、１μｌの２００ｐＭの濃度の第１のナノ粒子３、１μｌリバースプライマーＩＤ６５００ｎＭ、オリジナル１２として１μｌオリゴヌクレオチドＩＤ３（ここで、オリジナル１２は、例えば０ｐＭ、１０ｐＭまたは２０ｐＭの濃度でＰＣＲ混合物中に存在する）、４．２μｌ水）で実施される。ここで使用される塩の量は、図１０からの実施例におけるよりも顕著に高い。図１０からのＤＮＡポリメラーゼ１０を用いる場合、十分な増幅はこれらの塩濃度では不可能である。図７に示すように、サンプルチューブ２４は、ウォーターバス２６中でガラスキュベット２５において３７℃に温度制御される。３７℃の温度は、ここでは、アニーリング温度および伸長温度である。レーザー１６は、第１のナノ粒子３を励起するように機能し、ミラースキャナ１８（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰｒｏＳｅｒｉｅｓ１）の背後のＦシータレンズ（Ｊｅｎｏｐｔｉｋ、焦点距離１００ｍｍ）と共に、１．５Ｗのアウトプット出力で、ウォーターバス２６中のサンプルチューブ２４中に焦点を合わせた周波数倍増ダイオード励起Ｎｄ：ＹＡｇレーザー（ｃｏｈｅｒｅｎｔＶｅｒｄｉＶ１０）である。ミラースキャナ１８は、図３に既に示したように、サンプルチューブ２４を通じて行毎に焦点を移動させること、および従って、光熱増幅において反応体積２全体を含めることが可能である。１つのサンプルチューブ２４当たり、１０００行が、サンプルチューブ２４におけるおよそ５ｍ／ｓの行速度で、およそ５μｍの距離における焦点を用いてスキャンされる。これは、第１のサンプルチューブ２４における１サイクルに対応する。引き続き、全ての他のサンプルチューブ２４が、次々にスキャンされ、その結果各サンプルチューブ２４は１つのサイクルを経た。第１のサンプルチューブ２４のスキャン後の４０ｓの待機時間後、次のサイクルが開始され、これは、各サンプルチューブ２４が合計で３５サイクルを完了するまで、反復される。図１１中で左から右に、最初の３つのサンプルチューブ２４は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９およびｄＮＴＰを含む上記ＰＣＲ混合物を受けた。４から６までのサンプルチューブ２４は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９を含むがｄＮＴＰを含まず、７から９までのサンプルチューブ２４は、ｄＮＴＰを含むがＫｌｅｎｏｗフラグメント２９を含まない。図１１の略図の下の行に示すように、１、４および７のサンプルチューブ２４はオリジナル１２を含まず、２、５および８は１０ｐＭのオリジナル１２を含み、３、６および９は２０ｐＭのオリジナル１２を含む。全てのサンプルチューブ２４が３５サイクルを完了した後、これらはウォーターバス２６から取り出される。図９のうち１つに対応する試験プローブ２１が、増幅反応の分析において使用される。試験プローブ２１とのハイブリダイゼーションのために、改変リン酸塩緩衝液が使用される（１３ｍＭのＰＢＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１μｇ／ｍｌのＰＶＰ１０、ｐＨ７．５）。１０μｌハイブリダイゼーション溶液は、３．３５μｌの改変リン酸塩緩衝液、３．３μｌホルムアミド、０．６μｌのＮａＣｌ５Ｍ、０．２５μｌの２００ｐＭ試験プローブ溶液、および増幅後の対応する２．５μｌのＰＣＲ溶液）を含む。第１のナノ粒子３と試験プローブ２１との連結の検証は、ナノ粒子８の光熱励起によって実施される。図１１は、レーザーパルスおよびナノ粒子８間のＤＮＡの生じた脱ハイブリダイゼーションによって発生され、溶液中の金−ＤＮＡ−金結合の存在の測定である、透過変化を示す。反応前のオリジナル１２の濃度は略図の下に示される。図１１の左側のセクションＡでは、ＰＣＲに必要な成分Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９およびｄＮＴＰを含む、１〜３のサンプルチューブ２４についての結果が示される。ここでは、漸増量のオリジナル１２のコピーを用いると、金−ＤＮＡ−金結合の測定のための指標として測定される透過変化が減少することが明らかである。非熱安定性Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９は、この実施形態では高温を許容しないものの、オリジナル１２の増幅を実施できる。本発明の光熱増幅反応では、サンプル１１は局所的にのみ加熱されるので、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９は、僅かな熱負荷のみを受け、破壊されることなしに多くのサイクルにわたってオリジナル１２を増幅できる。図１１の中央のセクションＢでは、ｄＮＴＰを含まない４〜６のサンプルチューブ２４の結果が示される。ここで、顕著な透過変化は、使用されるオリジナル１２のいずれの濃度でも検出不能である。これは、増幅が起こらなかったことを意味する。図１１の右側のセクションＣには、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９を含まない７〜９のサンプルチューブ２４の結果が示される。ここでも再び、増幅は起こらなかった。この実施例は、非熱安定性Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９もまた、増幅反応を実施する際に使用され得ることを示している。

図１２に示す実施形態では、反応体積２を通るレーザービームの移動に依存する光熱増幅が示される。ここでは、０、１、５、２０および５０ｐＭの濃度のオリジナルが、図１２中の略図の下の行に示されるように、１００μｌサンプルチューブ２４において選択される。図７に示すように、サンプルチューブ２４は、ウォーターバス２６中でガラスキュベット２５において６０℃に温度制御され、ここで、６０℃は、アニーリング温度および伸長温度である。光熱加熱は、ミラースキャナ１８（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰｒｏＳｅｒｉｅｓ１）の背後のＦシータレンズ（Ｊｅｎｏｐｔｉｋ、焦点距離１００ｍｍ）と共に、３Ｗのアウトプット出力で、ウォーターバス２６中のサンプルチューブ２４中に焦点を合わせた周波数倍増ダイオード励起Ｎｄ：ＹＡｇレーザー（ｃｏｈｅｒｅｎｔＶｅｒｄｉＶ１０）からなるレーザー１６によって創出される。図１２は、左側のセクションＡに、１秒間にわたり各々光熱励起された漸増濃度のオリジナル１２を含む５つのサンプルチューブ２４を示し、ここで、レーザー焦点は、移動なしに反応体積２の中央にあった。第１のサンプルチューブ２４が１秒間にわたりこの様式で照射された後、４０ｓにわたり照射されない。これは、第１のサンプルチューブ２４における１サイクルに対応する。４０ｓの待機時間の間、残りのサンプルチューブ２４は第１のサイクルを完了する。これらのサイクルは、合計で３５回反復される。プライマー配列５を含むナノ粒子８と試験プローブ２１との間のハイブリダイゼーションの検出は、図１０に既に示したように、ナノ粒子８の光熱励起によって実施される。図１２の左側のセクションＡに示されるように、レーザー焦点の移動なしの場合、透過変化に対するオリジナル１２の濃度の影響は観察できない。これは、オリジナル１２の顕著な増幅が起きなかったことを示している。その理由は、反応体積２全体の小さい画分のみに焦点があっており、この部分体積中のナノ粒子８のみが反応に関与しているからである。図１２の右側のセクションＢでは、左から右に漸増濃度のオリジナル１２を含む５つのサンプルチューブ２４が示され、これらのサンプルチューブ２４は各々１秒間励起され、さらに、レーザー焦点を、反応体積２を通して移動させた。この方法では、図３に既に示したように、反応体積２全体は行毎にスキャンされ、従って、光熱反応に関与する。各サンプルチューブ２４において、およそ５μｍの距離において、１０００行が、サンプルチューブ２４におけるおよそ５ｍ／ｓの行速度で、焦点を用いてスキャンされる。これは、第１のサンプルチューブ２４における１サイクルに対応する。引き続き、５つ全ての各サンプルチューブ２４がスキャンされるまで、次のサンプルチューブ２４が次々にスキャンされる。第１のサンプルチューブ２４のスキャンから測定して４０ｓの待機時間後、次のサイクルが開始され、これは３５回反復される。図１２の右側のセクションＢから、漸増濃度のオリジナル１２を用いると、測定される透過変化が減少することが明らかである。これは、金−ＤＮＡ−金結合の減少する測定を示す。焦点の移動のみを通じて、かつ未変化のレーザー出力および照射の持続時間において、焦点の移動が増幅反応においてサンプル１１中のナノ粒子８の大部分を含む場合に、増幅が生じる。

図１３では、本発明による方法を実施するための機器が示され、ここで、光源１７は、任意選択的な第１の対物レンズ３０を介してミラーなどの屈折要素３２に対して光ビームを方向付け、任意選択的な第２の対物レンズ３１を介してサンプルチューブ２４上に光ビームを方向付ける。ここでは、サンプルチューブ２４は、ユニット３３を旋回させることによって、異なるサンプルチューブ２４に異なる時点において光が当たり得るように、さらなるサンプルチューブ２４と一緒に回転可能ユニット３３上に取り付けられる。従って、有利なことに、低出力の光源１７を用いた場合であっても、サンプルチューブ２４中に存在するナノ粒子８の多数を励起することが達成可能である。

図１４は、その表面上に充填用分子９およびオリゴヌクレオチド４を含む、本発明によるナノ粒子８の一区画を示す。従来のＤＮＡポリメラーゼ１０は、オリゴヌクレオチド４に沿って相補鎖（破線）を合成する。この間、大きい従来のＤＮＡポリメラーゼ１０は、図１４ａにおいて充填用分子を介した立体障害を受ける。図１４ｂでは、ＤＮＡポリメラーゼ１０は、隣接するオリゴヌクレオチド４による立体障害を受ける。図１４ａおよび１４ｂ中の立体障害は各々、新たに合成された鎖の未成熟鎖破壊をもたらし得る。図１４ｃ中のＫｌｅｎｏｗフラグメント２９は、従来のＤＮＡポリメラーゼ１０よりも小さいので、充填用分子９とオリゴヌクレオチド４との間を通って到達でき、従って、新たな鎖の合成を最後まで完了させることができる。Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９が充填用分子を通って到達できない場合であっても、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２９はなお、その活性中心で、立体的に障害する充填用分子９に近づくことができ、従って、新たに合成された鎖の潜在的な鎖破壊は、後にのみ起こる。従って、より小さいポリメラーゼは、粒子表面に近接したプライマー配列のより効率的な使用を可能にする。さらに、ナノ粒子表面にごく接近して局所的に発生された熱は、変性工程のために特に効率的に使用され得る。これに加えて、配列Ａ’を有するカウンター配列３４が示される。カウンター配列３４は、ナノ粒子８上の配列Ａを有するオリゴヌクレオチド４に対して相補的であり、オリゴヌクレオチド４が遊離プライマー７として機能できないように、ナノ粒子８から意図せず脱離する配列Ａを有するオリゴヌクレオチド４を中和する機能を果たす。

図１５中の実施形態では、ナノ粒子オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを使用する光熱増幅が示され、ここで、第１のナノ粒子３とプライマー配列５との間の共有結合は、２つのチオールを用いて実施される。この目的を達成するために、金製で６０ｎｍの直径を有する第１のナノ粒子３が、オリゴヌクレオチド４で官能化される（Ｊ．Ｈｕｒｓｔ、上記に従う）。ここでは、オリゴヌクレオチドＩＤ１と比較して、その５’末端にチオールの代わりにジチオールを保有するオリゴヌクレオチド４ＩＤ１０（ＩＤＴＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が使用される。官能化および６回の洗浄工程後、第１のナノ粒子３は、ＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＰＢＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、０．０１％アジド、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に２００ｐＭの濃度で存在する。増幅反応は、２００μｌサンプルチューブ２４中で１０μｌの総体積（それぞれ０または２００ｐＭの濃度で溶解された５μｌのＤｒｅａｍＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒｍｉｘ２×（ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、０．１μｌのＮａＣｌ５Ｍ、０．１μｌのＭｇＣｌ_２２５０ｍＭ、０．１μｌのＭｇＳＯ_４２５０ｍＭ、１μｌの官能化された第１のナノ粒子２００ｐＭ、１μｌリバースプライマーＩＤ６５００ｎＭ、１００ｎＭオリゴヌクレオチド４ＩＤ４（ここで、例えば反応前のオリジナル１２の貯蔵の間などに、オリゴヌクレオチド４ＩＤ４は表面を飽和させる働きをする）を含む水中に１μｌオリゴヌクレオチド４ＩＤ３（増幅されるオリジナル１２として）、１．７μｌ水）中で実施される。図７に示すように、サンプルチューブ２４は、ウォーターバス２６中でガラスキュベット２５において６０℃に温度制御され、この温度は、アニーリング温度および伸長温度である。最初の２つのサンプルチューブ２４は、陰性コントロールとしてウォーターバス中に挿入され、レーザービームが当てられない。オリジナル１２の初期濃度は、第１のサンプルチューブ２４において０ｐＭおよび第２のサンプルチューブ２４において２０ｐＭになるように選択される。第３および第４のサンプルチューブは光熱処理される。光熱加熱は、ミラースキャナ１８（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰｒｏＳｅｒｉｅｓ１）の背後のＦシータレンズ（Ｊｅｎｏｐｔｉｋ、焦点距離１００ｍｍ）と共に、３Ｗのアウトプット出力で、ウォーターバス２６中のサンプルチューブ２４中に焦点を合わせた周波数倍増ダイオード励起Ｎｄ：ＹＡｇレーザー（ＣｏｈｅｒｅｎｔＶｅｒｄｉＶ１０）からなるレーザー１６によって実施される。各サンプルチューブ２４について、５００行が、サンプルチューブにおけるおよそ５ｍ／ｓの行速度で、およそ１０μｍの距離における焦点を用いてスキャンされる。これは、第３のサンプルチューブ２４における１サイクルに対応する。引き続き、第４のサンプルチューブ２４がスキャンされ、その結果第３および第４のサンプルチューブは１サイクルを完了した。第３のサンプルチューブ２４のスキャン後の４０ｓの待機時間後、次のサイクルが開始され、これは、第３および第４のサンプルチューブ２４が各々３５サイクルを完了するまで、反復される。オリジナル１２の初期濃度として、第３のサンプルチューブ２４について０ｐＭを選択し、第４のサンプルチューブ２４について２０ｐＭを選択する。第３および第４のサンプルチューブが３５サイクルを完了した後、４つ全てのサンプルチューブ２４がウォーターバス２６から取り出される。試験プローブ２１は、レーザーサイクルおよびオリジナル１２の濃度の影響を試験するように機能し、この試験プローブ２１は、好ましくは、選択されたプライマーおよびハイブリダイゼーション条件下で、プライマー配列５で官能化された第１のナノ粒子３にハイブリダイズでき、この第１のナノ粒子３は、増幅反応で産生されたオリジナル１２の相補的コピーによって遮断されない。これは、図９に示すような試験プローブ２１に対応する。試験プローブ２１の産生およびハイブリダイゼーション条件は、図１０に既に記載した。図１５中の略図は、試験プローブ２１を含むハイブリダイゼーション溶液の吸収スペクトルおよび第１のナノ粒子３を含む光熱増幅反応からの対応するＰＣＲ溶液の吸収スペクトルを示す。これらの吸収スペクトルは、ＶａｒｉａｎＣａｒｙ５０分光計において３ｍｍの光路を有する石英キュベットにおいて記録した。これらの略図では、実線は、試験プローブ２１と共に第１のナノ粒子３を含む、ＰＣＲ溶液および光熱増幅反応の混合の直後の吸収スペクトルを示す。破線は、ハイブリダイゼーションの６分後に記録され、点線は１２分間のハイブリダイゼーション後に記録される。図１５ａでは、試験プローブ２１と、増幅反応前にオリジナル１２を含まず光熱処理を受けていない第１のサンプルチューブ由来のＰＣＲ産物のナノ粒子８との間のハイブリダイゼーションの間のスペクトルが示される。試験プローブ２１とプライマー配列５との間のハイブリダイゼーションが第１のナノ粒子３上で起こるので、ナノ粒子３のプラズモン共鳴の明確なレッドシフトおよび広幅化が、ハイブリダイゼーション時間の増加と共に見られる。相当するハイブリダイゼーションは図１５ｂにおいても見ることができ、この図は、試験プローブ２１と、増幅反応前に２０ｐＭのオリジナル１２を含み光熱処理を受けなかった第２のサンプルチューブ由来のＰＣＲ産物のナノ粒子８とのハイブリダイゼーションを示す。相当するハイブリダイゼーションは図１５ｃにおいても見ることができ、この図は、試験プローブ２１と、増幅反応前にオリジナル１２を含まないが光熱処理を受けた第３のサンプルチューブ由来のＰＣＲ産物のナノ粒子８とのハイブリダイゼーションを示す。図１５ｃ中のハイブリダイゼーションは、プライマー配列５が光熱処理後に第１のナノ粒子３に結合したままであることを示している。試験プローブ２１と、増幅反応前に２０ｐＭのオリジナル１２を含み光熱処理を受けた第４のサンプルチューブ由来のＰＣＲ産物のナノ粒子８とのハイブリダイゼーションを示す図１５ｄ中でのみ、ハイブリダイゼーション時間が増加しても、吸収スペクトルの変化はほとんど何も見られない。後者の場合のみ、オリジナル１２の十分な数のコピーが増幅反応の間に産生され、これらのコピーは、第１のナノ粒子３上のプライマー配列５を今度は遮断し、従って、試験プローブ２１とのハイブリダイゼーションを防止する。この実施例は、プライマー配列５が第１のナノ粒子３の表面上のジチオールに共有結合している場合に光熱増幅反応もまた機能すること、およびオリジナル１２のコピーの濃度の検出のための吸収スペクトルが増幅反応後に使用され得ることを示している。

本明細書、特許請求の範囲および図面に開示される特徴は、その種々の実施形態における本発明の実現のために、個々におよび任意の組み合わせで適切なものであり得る。

１核酸
２反応体積
３第１のナノ粒子
４オリゴヌクレオチド
５プライマー配列
６スペーサー配列
７プライマー
８ナノ粒子
９充填用分子
１０ＤＮＡポリメラーゼ
１１サンプル
１２オリジナル
１３相補体
１４フォワードプライマー
１５リバースプライマー
１６レーザー
１７光源
１８ミラースキャナ
１９ミラー
２０第１のオリゴヌクレオチド
２１試験プローブ
２２第２のナノ粒子
２３第２のオリゴヌクレオチド
２４サンプルチューブ
２５ガラスキュベット
２６ウォーターバス
２７第１のレーザー
２８第２のレーザー
２９Ｋｌｅｎｏｗフラグメント
３０第１の対物レンズ
３１第２の対物レンズ
３２屈折要素
３３回転可能ユニット
３４カウンター配列
３５光ダイオード

Claims

反応体積（２）中のナノ粒子（８）が励起を介してその周囲に熱を転移させる、核酸（１）の増幅のための方法であって、前記ナノ粒子（８）の励起を介して、前記ナノ粒子（８）の前記周囲が局所的に加熱され、前記励起の間隔が、臨界励起時間ｔ１＝（ｓ１＊｜ｘ｜）^２／Ｄ（式中、ｓ１＝１００であり、Ｄが、前記ナノ粒子（８）間の媒体の熱拡散率である）以下になるように選択される方法。
前記核酸（１）がポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される請求項１に記載の方法。
前記ナノ粒子（８）がレーザー（１６）によって励起される請求項１または２に記載の方法。
前記ナノ粒子（８）がオリゴヌクレオチド（４）とコンジュゲートされる請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
ナノ粒子（８）とオリゴヌクレオチド（４）との１つの種類のコンジュゲートが、フォワードプライマー（１４）およびリバースプライマー（１５）とコンジュゲートされる請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記方法において、前記オリゴヌクレオチド（４）が以前に付着していた前記ナノ粒子（８）から脱離した、前記オリゴヌクレオチド（４）に結合することができるカウンター配列（３４）が使用される請求項４または５に記載の方法。
充填用分子（９）が前記ナノ粒子（８）に付着される請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノ粒子（８）上の前記オリゴヌクレオチド（４）が、部分配列としてスペーサー配列（６）を含む請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノ粒子（８）の励起により前記ナノ粒子（８）の前記周囲に転移される熱が、前記オリゴヌクレオチド（４）にハイブリダイズした核酸（１）から、前記ナノ粒子（８）の表面上の前記オリゴヌクレオチド（４）を脱ハイブリダイズするために十分である請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記方法が、全体的加熱工程を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
アニーリング温度が伸長温度と等しい請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記方法の間の任意の１つの時点において、前記ナノ粒子（８）の一部のみが励起によって加熱される請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
サンプル（１１）の異なる部分体積中のナノ粒子（８）が異なる時点において励起されるように、励起場に対して方向付けられた前記サンプル（１１）の移動が起こる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
前記方法において、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼ（１１）が使用される請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
前記増幅反応の産物の濃度が、試験プローブ（２１）を使用して決定される請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。