CN107604052A - 用于扩增核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于扩增核酸(1)的方法，其中在反应体积(2)中的纳米颗粒(8)通过激发将热传递至它们的环境。

Description

用于扩增核酸的方法
本申请是中国专利申请201380007616.5的分案申请，原申请201380007616.5的申请日为2013年2月1日，其名称为“用于扩增核酸的方法”。
技术领域
本发明涉及一种用于扩增核酸的方法。
背景技术
用于扩增核酸的方法是本领域已知的。专利说明书US 4 683 202公开了一种用于扩增在核酸或核酸混合物中含有的特定核酸序列的方法，其中每个核酸由2个具有相等或不等长度的单独互补链组成。所述方法包括：(a)在特定条件下用针对每种要扩增的不同特定序列的2种寡核苷酸引物处理所述链，所述条件使得，对于每种要扩增的不同序列，合成与每种核酸链互补的每种引物的延伸产物，其中选择所述引物以致于与每种特定序列的不同链充分互补，使得从一种引物合成的延伸产物当与它的补体分离时可以充当用于合成其它引物的延伸产物的模板；(b)将引物延伸产物与用于合成它们的模板分离，以产生单链分子；和(c)在使用在步骤(b)中产生的每个单链作为模板合成引物延伸产物的条件下，用步骤(a)的引物处理从步骤(b)制备的单链分子。所述步骤可以连贯地或同时地进行。此外，可以重复步骤(b)和(c)，直到已经达到期望的序列扩增程度。就其中使用聚合酶执行步骤(a)和(c)的方法而言，所述方法通常被称作聚合酶链式反应(PCR)。
国际专利申请WO 2007/143034 A1公开了据推测适合用于执行PCR的方法。所述方法可以包括在PCR中使用光源来提供加热。所述方法还可以包括使用表面等离子体共振或荧光共振能量转移来实现PCR反应的实时监测。所述方法可以包括：将模板、引物或聚合酶固定化在表面(诸如金)上或在另一种表面等离子体共振活性表面上。
专利申请US 2002/0061588 A1公开了提供对外部信号局部地和直接地做出应答的核酸的方法。所述信号排它地作用于核酸的一个或几个特定的局部化部分上。根据该发明，所述信号可以改变特定核酸的性能，并由此改变它的功能。因而，该发明提供了这样的方法：其控制生物样品中的核酸的结构和功能，而不影响样品的其它部分。在一个实施方案中，调节剂将热传递至核酸或核酸的组成部分，这导致例如分子间或分子内键的去稳定化以及核酸的结构和稳定性的改变。优选的调节剂包括金属纳米颗粒、半导体纳米颗粒、磁性纳米颗粒、氧化物纳米颗粒和生色团。还有人提出，与PCR结合使用这些方法。具体地，有人提出，用调节剂控制PCR反应。
专利申请US 2003/0143604 A1涉及使用纳米颗粒检测探针来监测扩增反应，尤其是PCR。具体地，该专利申请涉及使用保护剂(诸如牛血清白蛋白)处理过的纳米颗粒寡核苷酸缀合物来定量地和定性地检测靶多核苷酸。该专利申请公开了使用金纳米颗粒引物的核酸扩增和检测。在第一步中，在有用引物官能化的金纳米颗粒存在下，使核酸靶标变性。在第二步中，使金纳米颗粒及其连接的寡核苷酸与核酸靶标杂交，并从连接至纳米颗粒的核酸引物开始产生互补DNA序列的一个拷贝。重复第一步和第二步，并检测通过扩增的互补纳米颗粒探针的结合而产生的光信号。
根据本发明的问题
本发明的根本问题是，提供一种改进的用于扩增核酸的方法。
根据本发明的解决方案
通过具有权利要求1的特征的方法解决了所述问题。所述方法用于扩增核酸，其中在反应体积中，纳米颗粒通过激发将热传递至它们的环境。
所述反应体积是在其中执行根据本发明的方法的体积。所述体积可以被反应容器包围。所述反应体积含有样品。所述样品含有液体，优选水。在所述样品中可以含有通过所述方法可扩增的核酸。
根据本发明的纳米颗粒优选地是这样的颗粒：其由于它们的尺寸而在散装材料中显示没有观察到或不那么明显的特殊光学特性，特别是特有的吸收或散射光谱。优选地，所述纳米颗粒具有在2-500nm之间、更优选地在3-300nm之间和最优选地在5-200nm之间的直径。优选的纳米颗粒具有在7-150nm之间的直径。所述纳米颗粒可以是球形的，但是，非球形的形状也是可能的，例如，长纳米颗粒(纳米棒)。在本发明的一个优选实施方案中，所述纳米颗粒包含至少一种半导体或一种金属，优选贵金属，例如，金或银。在一个实施方案中，所述纳米颗粒完全由金属组成，在另一个实施方案中，所述金属仅形成纳米颗粒的一部分，例如，它的壳。一种优选的纳米颗粒可以是壳-芯纳米颗粒。一种优选的纳米颗粒可以在它的表面上具有孔，所述孔可以被原子或分子占据，所述原子或分子具有由所述孔的性能限定的尺寸和电荷，特别优选地，当所述纳米颗粒位于溶液中时，这样的原子或分子仅被吸附至纳米颗粒。根据本发明，所述纳米颗粒还包含吸附至它的表面上的原子和分子。由于它们的材料吸收或等离子体共振，优选的纳米颗粒适合用于吸收光能。
当通过纳米颗粒的激发而将热从纳米颗粒传递至它的环境时，根据本发明，这意味着，能量被传递至纳米颗粒，其中所述纳米颗粒通过能量的传递来加热它的环境。在此过程中，优选地通过激发，比纳米颗粒的较宽环境更强烈地加热直接环境。通常，纳米颗粒首先通过激发而被加热，然后将热传递至它们的环境。还可以想象，通过纳米颗粒的激发，将热传递至它们的环境，而不首先加热纳米颗粒本身。优选地，纳米颗粒的环境是球形体积，所述球形体积的直径等于位于所述体积中央的纳米颗粒的直径的100倍；更优选地，所述体积的直径是在它的中央的纳米颗粒的直径的10倍，最优选4倍，优选地小于2倍。
优选地，通过纳米颗粒的激发，局部地加热纳米颗粒的环境。具体地，如果被加热的体积仅是整个体积的一部分，那么温度的快速变化是可能的。一方面，仅用少量的能量输入可以产生高温差。另一方面，在以下情况下，被加热的体积的快速冷却是可能的：在被照射的体积中存在足够大的低温热源(cold temperature reservoir)，使得在辐照纳米颗粒以后，它们的环境被冷却。这可以通过足够强烈地照射纳米颗粒(以获得期望的温度增加)并保持足够短的时间量(用于使热保持在局部)来实现。
因此，如果将各个被照射的体积(例如，在激光的焦点中)中的激发的间隔t选择成短于或等于临界激发间隔t1，那么存在根据本发明的局部加热。在这里，t1是热从一个纳米颗粒扩散至处于平均纳米颗粒距离处的下一个纳米颗粒所需的时间乘以换算系数s1；如果|x|是平均纳米颗粒距离并且纳米颗粒之间的介质的热扩散系数是D，那么t1由t1＝(s1*|x|)2/D给出，其中热扩散系数D在水溶液中通常具有D＝10-7m2/s的值。
换算系数s1是在激发间隔中颗粒的暖锋传播的距离的量度。由激发的纳米颗粒在几个纳米颗粒直径的距离处造成的温度增加仅是在颗粒表面处的最大温度增加的非常小的部分。在本发明的一个实施方案中，允许几个纳米颗粒的暖锋的重叠，其含义是，对于根据上面方程式的临界激发间隔t1的定义，使用大于1的换算系数。在本发明的另一个实施方案中，在激发间隔中不允许暖锋的重叠(对应于显著的局部加热)，其含义是，对于根据上面方程式的临界激发间隔t1的定义，使用小于或等于1的换算系数s1。对于根据本发明的局部加热的定义，优选s1＝100，优选s1＝30，优选s1＝10，优选s1＝7，优选s1＝3，且最优选s1＝1，优选s1＝0.7，优选s1＝0.3。
在以下情况(除了别的以外)下，当s1>1时的值可以是有利的：其中被照射的体积显示出高高径比(例如，在适当聚焦的激光束的焦点中)，使得相当多的纳米颗粒位于被照射的体积的表面处，且因此，更少的被加热的纳米颗粒存在于它们的环境中，并且发生从被照射的体积的显著热流出，使得更远的邻居的加热贡献在更长的时间段内保持可忽略。
这意味着，例如，在1nM的纳米颗粒浓度(其导致|x|＝1.2μm的平均纳米颗粒距离)，如果激发间隔保持短于t1＝14μs(将换算系数选择为s1＝1，D＝10-7m2/s)，发生根据本发明的局部加热。可以假定，当选择t为t>t1时，由纳米颗粒发出的热可以在辐照过程中通过扩散而覆盖大于平均颗粒距离的距离，这实际上会导致许多纳米颗粒的暖锋的重叠，使得在纳米颗粒之间的整个体积中存在温度增加；加热越长，被照射的体积中的温度增加将在空间上越均匀，因为在纳米颗粒周围的温度分布的影响不仅由最近的纳米颗粒产生，而且由更远的邻居产生。
如果用纳米颗粒吸收的辐射照射反应体积长于t1，那么所述加热被称作总体加热。
例如，通过用Peltier元件或电阻加热器从外面加热反应体积，可以进行根据本发明的总体加热。例如，通过用水吸收的辐射比纳米颗粒更强烈地或者同样强烈地照射反应体积，也可以进行所述总体加热。在这里，术语温度增加是指在激发以后立即观察时在一个位置处的温度与在即将激发之前在相同位置处的温度的差异。
可以同时进行总体加热和局部加热。
已知的扩增核酸的方法包括一个或几个步骤，其中需要加热样品的至少某些部分。
本发明使得在扩增核酸的方法中不需要加热整个反应体积成为可能。相反，通过纳米颗粒的激发，可能仅加热反应体积的特定部分。有利地，以此方式，可能仅加热为了扩增核酸而需要加热的反应体积的那些部分。因而，可以保留样品的热敏感的部分。如果需要传递更少的能量，局部加热可以比整个反应体积的总体加热更快速。因此，有利地，本发明使得提供一种更快的且需要更少能量的扩增核酸的方法成为可能。
根据本发明的优选实施方案
具体地，通过聚合酶链式反应(PCR)，可以扩增核酸。在反应体积中进行所述PCR。所述反应体积含有一种要扩增的核酸，其被称作原始核酸。所述原始核酸是单链的。在反应体积中，所述原始核酸可以与它的互补链(其被称作补体)一起形成双链。如果原始核酸和补体作为双链存在，那么该双链必须在第一步中变性，即，该双链必须分离成2个单链。解链是变性的另一个术语。变性发生在被称作变性温度的温度。所述反应体积还含有至少2种寡核苷酸，它们被称作引物。引物之一被称作正向引物，另一种被称作反向引物。所述正向引物与原始核酸的3'-末端互补。所述反向引物与补体的3'-末端互补。在第二步中，正向引物与原始核酸杂交，反向引物与补体杂交。引物分别与原始核酸或补体的互补部分的杂交被称作退火。第二步发生在被称作退火温度的温度。所述反应体积还含有DNA聚合酶。在第三步中，DNA聚合酶从正向引物开始合成补体的拷贝。从反向引物开始，DNA聚合酶合成原始核酸的拷贝。通过合成，补体的拷贝与原始核酸杂交，原始核酸的拷贝与补体杂交。第三步被称作延伸，并且在被称作延伸温度的温度进行。此后，循环地重复第一步、第二步和第三步，直到达到期望的扩增程度，其中原始核酸的拷贝是原始核酸，且补体的拷贝是补体。如果原始核酸位于比所述原始核酸更长的DNA单链上，那么PCR不仅产生所述原始核酸的拷贝，而且产生所述DNA单链的拷贝，所述DNA单链的拷贝在3'方向更长且含有所述原始核酸。因此，在该情况下，PCR不仅产生补体的拷贝，而且产生与所述DNA单链互补的DNA单链的拷贝，其中所述拷贝在3'方向更长且含有所述补体。
由于可以在不同的温度进行PCR的单独步骤，在PCR步骤的过程中或之间可以必须执行一个或几个加热步骤和在必要时的冷却步骤，在所述加热和冷却步骤中，分别加热或冷却反应体积或其部分。优选地，在加热步骤中或在至少一个加热步骤中的加热至少部分地通过纳米颗粒的激发来实现，并且所述加热优选地是局部加热。
在PCR中，优选地选择变性温度，使得DNA的单链解链，同时不会以显著方式破坏DNA聚合酶。变性温度的典型值是例如95℃。最佳退火温度经常依赖于引物的序列和长度。通常，将引物的退火温度设计为在50℃至65℃之间。最佳延伸温度通常依赖于使用的DNA聚合酶。例如，当使用Taq聚合酶时，通常选择72℃的延伸温度。
在本发明意义上，杂交是指从2个单链形成双链，每个单链可以由核酸和/或寡核苷酸组成。在适当的反应条件下，杂交通常会导致最低能量状态，这可以通过彼此键合的2个单链来实现。换而言之，这意味着，在适当的条件下，2个单链以下述方式彼此结合：参考2个单链的序列，产生最大可能互补性。
当核酸A与核酸B部分地互补时，这意味着，核酸A的一部分与核酸B的一部分互补。
纳米颗粒的激发优选地借助于交变场、更优选地借助于交变电磁场、最优选地光学地进行。优选地，所述激发发生在远红外和远紫外线之间的范围内(在100nm至30μm波长的范围内)，更优选地在近红外至近紫外线的范围内(在200nm至3μm波长的范围内)，最优选地在可见光范围内(在400nm至800nm的范围内)。与从外侧对反应容器的常规总体加热相比，这可以提供以下优点：不需要克服反应容器的热绝缘壁，因为能量被直接传递到纳米颗粒上。以此方式，可以实现样品的期望部分的更快速加热。
在本发明的一个优选实施方案中，用激光器激发纳米颗粒。更优选地，所述激光具有激发纳米颗粒的表面等离子体共振的频率。所述激光器可以连续地供给光或作为脉冲光。所述激光器可以是例如气体激光器、二极管激光器或二极管泵浦固态激光器。激光器激发被照射的体积中的纳米颗粒的时间间隔优选地是在皮秒至秒的范围内，更优选地在纳秒至秒之间，最优选地在10ns至500μs之间。优选地，激发间隔短于在纳米颗粒的环境中产生的热扩散经过平均纳米颗粒距离使得平均而言邻近颗粒的暖锋不存在显著重叠所需的平均时间。更优选地，选择激发间隔，使得在每个照射的纳米颗粒周围的温度增加下降至平均而言小于在20纳米颗粒直径的距离(更优选地在2纳米颗粒直径的距离，最优选地在1纳米颗粒直径的距离)处的它的最大值的一半。在一个实施方案中，每个体积的短激光辐照阶段是优选的，使得脱杂交的DNA单链在变性过程中仅可以从纳米颗粒扩散离开小于100nm，更优选小于20nm。由此，脱杂交的DNA单链结合相同纳米颗粒上的寡核苷酸的概率较高。这可以导致根据本发明的方法的加速。在一个优选的实施方案中，引物缀合的纳米颗粒的浓度小于10nM，其中所述激发间隔优选地是在1ns至10μs之间，更优选地在10ns至1μs之间，且最优选地在15ns至300ns之间。优选地不选择激发间隔显著小于1ns；另外，DNA双链的加热阶段不足以使其中所含的单链通过扩散发生充分分离以致于它们不会彼此立即再杂交。
占空比是激发间隔与PCR循环持续时间之比。优选地将占空比选择为足够大，使得激发会通过局部加热而导致DNA双链的充分变性。与此同时，将占空比选择为，使得整个样品的平均温度增加保持足够小以避免杂交、延伸和变性的紊乱。优选地，被照射的体积的占空比小于50％，更优选地小于20％，最优选地小于1％。被照射的体积的占空比优选地大于10-12，更优选地大于10-10，更优选地大于10-9，且最优选地大于10-8。用于激发纳米颗粒的表面功率密度优选是在20W/mm2至1000kW/mm2之间，更优选地在100W/mm2至100kW/mm2之间，且最优选地在250W/mm2至10kW/mm2之间。
在另一个优选的实施方案中，由于激光能的材料吸收而将激光能传递至纳米颗粒。用于激发纳米颗粒的光还可以源自例如热辐射器，例如，闪光灯。在本发明的另一个优选的实施方案中，用交变电磁场或电磁波激发纳米颗粒，所述交变电磁场或电磁波在纳米颗粒中诱导涡流。还可以用超声激发适当地设计的纳米颗粒。
与本发明有关的术语寡核苷酸优选地不仅包括(脱氧)寡核糖核苷酸，而且包括这样的寡核苷酸：其在它们的主链上(例如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯或肽核酸[PNA])，尤其是在主链的糖上(例如2'-O-烷基衍生物、3'-和/或5'-氨基核糖、锁核酸[LNA]、己糖醇核酸、吗啉代、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)或三环-DNA；在这点上，参见D.Renneberg和C.J.Leumann的标题为“Watson-Crick base-pairing properties of Tricyclo-DNA”的出版物,J.Am.Chem.Soc.,2002,第124卷,第5993-6002页，其有关内容通过引用形成本公开内容的一部分)，含有一个或多个经过修饰的核苷酸类似物，或者含有碱基类似物，例如，7-脱氮嘌呤或通用碱基(诸如硝基吲哚)或经修饰的天然碱基(诸如N4-乙基胞嘧啶)。在本发明的一个实施方案中，寡核苷酸是与非核苷类似物(例如PNA)的缀合物或嵌合体。在一个实施方案中，寡核苷酸在一个或多个位置处含有非核苷单元，诸如间隔物，例如六乙二醇或Cn-间隔物，其中n是在3-6之间。就寡核苷酸含有修饰而言，以使得与天然DNA/RNA分析物的杂交也可能含有修饰的方式选择这些。优选的修饰会影响解链行为，优选解链温度，尤其是为了区分它们的氨基酸具有不同互补性程度的杂交体(错配区分)。优选的修饰包括LNA、8-氮杂-7-脱氮-嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶和/或寡核苷酸中的脱碱基中断。根据本发明的其它修饰是，例如，使用生物素、巯基和荧光供体和荧光受体分子的修饰。
在本发明的一个优选实施方案中，用寡核苷酸缀合纳米颗粒。以此方式，纳米颗粒形成纳米颗粒寡核苷酸缀合物。以此方式可以实现，通过纳米颗粒的激发，可以特异性地加热形成根据本发明的方法的一部分的寡核苷酸，而不必加热整个反应体积。在一个特别优选的实施方案中，将纳米颗粒缀合至引物。更优选地，将纳米颗粒缀合至PCR的正向引物和反向引物。在本发明的一个优选实施方案中，一类纳米颗粒寡核苷酸缀合物具有正向引物，但是没有连接反向引物；另一类具有反向引物，但是没有连接正向引物。
在本发明的另一个优选的实施方案中，给一类纳米颗粒寡核苷酸缀合物缀合正向引物以及反向引物。在该实施方案中，从纳米颗粒上的正向引物开始，在PCR中合成与原始核酸互补的新DNA单链。将该新DNA单链缀合至纳米颗粒，作为含有正向引物的新DNA单链。在合成后，新DNA单链立即与原始核酸形成双链。在随后的变性步骤中，新DNA单链与原始核酸分离。在退火温度，新DNA单链与位于纳米颗粒表面上的反向引物杂交，从而形成环。为了与相同纳米颗粒上的反向引物杂交，仅必须经过短距离。为了在优选的纳米颗粒浓度实现与不同纳米颗粒上的反向引物的杂交，平均而言，要经过的距离更大。因而，在该实施方案中，可有利地实现的是，退火更快速地发生，并且PCR可以更快速地完成。
在本发明的一个优选实施方案中，以使引物和纳米颗粒之间存在超过一个巯基的共价键的方式，将纳米颗粒连接至引物。通常，PCR缓冲液含有二硫苏糖醇，其使金纳米颗粒和引物之间的巯基键失稳，且其可以特别是在热应变下(例如，在变性过程中)导致引物本身脱离纳米颗粒。引物和纳米颗粒之间的超过一个巯基的共价键可以减少引物的脱离并因而改善PCR效率。
在一个优选的实施方案中，使用计数器序列(countersequence)，其可以结合这样的寡核苷酸：所述寡核苷酸本身已经脱离它们预先连接的纳米颗粒。计数器序列是寡核苷酸。在所述方法中，可以发生的是，缀合至纳米颗粒的寡核苷酸本身脱离所述纳米颗粒并变成游离的。在所述游离寡核苷酸是根据本发明的引物的情况下，这些游离引物可以结合原始核酸或补体。由于游离引物没有结合至纳米颗粒，所述游离引物不可通过纳米颗粒的激发分别从原始核酸或补体脱杂交。由此，降低所述方法的效率和灵敏度。计数器序列与游离寡核苷酸至少部分地互补，并且以足够的亲和力结合它们以限制游离寡核苷酸的功能。以此方式，可以增加所述方法的效率和灵敏度。在所述方法的一个特别优选的实施方案中，将足以封闭游离引物的量的计数器序列加入样品中，甚至在加入原始核酸之前。与此同时，所述量足够小，使得纳米颗粒展示足够大数目的未封闭的引物。如果纳米颗粒上的引物的数目超过游离引物的数目，那么这是可能的。
在一个优选的实施方案中，将填充分子连接至纳米颗粒。所述填充分子会阻止样品中的纳米颗粒的不希望的聚集。因而，所述填充分子有利地起稳定纳米颗粒的作用。使用填充分子，可以调节纳米颗粒的电荷。以此方式，可以适应存在于纳米颗粒的环境中的盐浓度，使得DNA聚合酶可以尽可能快速地合成，并且有利地，所述方法可以快速地进行。填充分子可以由不是引物的寡核苷酸组成，并且其优选地短于引物。填充分子也可以例如由聚合物(例如，聚乙二醇)组成。在一个优选的实施方案中，所述填充分子允许减少纳米颗粒上的引物的数目并替代性地使用更多的填充序列，而不使方法效率降低显著量。
在所述方法的另一个优选的实施方案中，在纳米颗粒上的寡核苷酸将间隔物序列显示为部分序列。间隔物序列位于寡核苷酸的更靠近纳米颗粒的部分中。以此方式，间隔物序列将寡核苷酸的剩余部分作为间隔物。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸含有一个具有引物功能且被称作引物序列的部分序列以及一个作为间隔物序列的部分序列。由于间隔物序列使得引物序列进一步隔开，要扩增的核酸和DNA聚合酶可以有利地获得对引物序列的更好接近。在一个优选的实施方案中，原始核酸的拷贝和补体的拷贝保持经由间隔物序列连接至纳米颗粒的表面。在一个特别优选的实施方案中，间隔物序列含有限制性内切核酸酶的限制位点，使得合成的拷贝可以被从纳米颗粒切掉。这优选地发生在所述方法终止以后；但是，它还可以发生在所述方法进行过程中。由此，所述方法使得产生在样品中游离存在的核酸拷贝成为可能。在所述方法的一个优选的实施方案中，间隔物序列至少象填充分子一样长，使得引物序列不被填充分子遮蔽。
在一个优选的实施方案中，通过纳米颗粒的激发从纳米颗粒传递至它们的环境的热足以使纳米颗粒的表面上的寡核苷酸从与所述寡核苷酸杂交的核酸脱杂交。在该实施方案中，将纳米颗粒缀合至寡核苷酸，且所述寡核苷酸的至少一部分与至少部分地互补的核酸杂交。通过纳米颗粒的激发，将热能传递至周围的水，使得在纳米颗粒周围的水的温度优选地足以使寡核苷酸从与其结合的核酸脱杂交。在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法是PCR，并且给所述纳米颗粒缀合引物。当进行PCR时，优选地形成双链PCR产物，在其中的每一个中，双链PCR产物的至少一个单链缀合至纳米颗粒。在该实施方案中，可有利地实现的是，通过纳米颗粒的激发而在纳米颗粒周围产生变性温度，并且在不加热整个反应体积的情况下进行双链PCR产物的变性。以此方式，可以使变性加速，使得PCR可以更快速地进行。在另一个优选的实施方案中，退火温度和延伸温度也通过纳米颗粒的激发而产生。以此方式，与将整个探针加热至退火温度和延伸温度相比，优选地仅必须传递少量的能量。更优选地，PCR的变性、退火和延伸在没有总体加热的情况下进行，而是排它地通过纳米颗粒的激发进行局部加热。由此，所述方法可以在没有用于总体加热的装置的情况下进行，使得需要更少的设备即可执行该方法。
在另一个优选的实施方案中，所述方法包括总体加热步骤。在该步骤中，通过总体加热，至少部分地达到该方法的至少一个步骤的温度。在本发明的一个更优选的实施方案中，所述方法是PCR，并通过反应体积的总体加热达到退火温度。最优选地，贯穿整个方法总体上将反应体积加热至进行退火的预定温度范围内。在该过程中，通过纳米颗粒的激发，达到延伸温度和变性温度。由此，可以有利地在简单设计中实现产生总体加热的装置，因为它仅需要维持预定的温度。
在另一个优选的实施方案中，通过总体加热达到退火温度和延伸温度，排它地通过纳米颗粒的激发实现变性。以此方式，可以有利地实现，产生总体加热的装置需要仅产生具有2种不同温度的温度循环，且因而可以以简单的设计来实现。通常，延伸和退火发生在狭窄的温度范围内。与此相反，为了达到变性，仅必须超过特定温度。因而，用于产生变性的纳米颗粒激发的不均一性是比退火温度和延伸温度的调节更小的问题。因此，可以以更简单的方式在技术上实现一个优选的实施方案，其中纳米颗粒的激发排它地用于产生变性。这对于其中退火温度和延伸温度彼此非常接近(例如当退火温度是60℃且延伸温度是72℃时)使得总体加热仅需要产生小温度增加的优选情况而言是特别适用的。
在一个特别优选的实施方案中，退火温度与延伸温度相同。在该情况下，所述方法是PCR。如果退火温度等于延伸温度，那么必须使用具有仅2种不同温度的温度循环进行PCR，这意味着，所述方法可以用简单设置来执行。
优选地，选择引物的解链温度和使用的DNA聚合酶，使得在解链温度，使用的DNA聚合酶仍然可以在足够的速度合成DNA。在一个特别优选的实施方案中，通过总体加热，达到与退火温度相等的延伸温度，并且通过纳米颗粒的激发达到变性。以此方式，可以以简单方式实现产生总体加热的装置，因为它仅需要保持一种温度。
在一个优选的实施方案中，在执行所述方法的过程中，在任意一个时点仅激发纳米颗粒的一部分。为此目的，例如，可以以它们仅激发在反应体积的一部分中的纳米颗粒的方式，设计用于激发纳米颗粒的装置。在一个特别优选的实施方案中，使用激光器光学地激发纳米颗粒，并且设计将光引导进反应体积中的光学器件，使得仅将光导入反应体积的一部分中。被激发的纳米颗粒部分优选地在执行所述方法的过程中变化。换而言之，在第一次被激发的第一组纳米颗粒与在第二次被激发的第二组纳米颗粒不同。在该情况下，任意数目的纳米颗粒可以存在于第一组中，且任意数目的纳米颗粒可以存在于第二组中，只要第一组和第二组是不同的即可。在所述2个组中，例如，一个组可以与另一个组重叠，使得所述组形成组的交叉。例如，一个组可以是另一个组的子集，使得一个组含有比另一个组更少的纳米颗粒。还可以以它们不会形成交叉的方式将2个组模型化，使得没有纳米颗粒存在于第一组以及第二组中。2个组之一还可以是空的组，使得例如在一个时间纳米颗粒被激发，且在另一个时间，没有纳米颗粒被激发。在一个优选的实施方案中，所述第一组和第二组基本上含有相同数目的纳米颗粒。特别优选地，在不同的时间，激光器会激发纳米颗粒的不同部分。由此，在所述方法的执行中，可以采用具有较低功率的激光器，其仅仅刚好足以激发纳米颗粒的一部分。在一个特别优选的实施方案中，使用2个或更多个激光器来激发纳米颗粒的不同部分。以此方式，可能有利地激发纳米颗粒的不同部分，无需将激光导向反应体积的不同部分的光学元件。
在本发明的另一个优选的实施方案中，发生样品相对于激发场的定向运动，使得在不同的时间，激发在样品的不同分体积中的纳米颗粒。更优选地，所述激发场是激光。在一个最优选的实施方案中，光学元件引导激光以在不同的时间激发反应体积的不同分体积中的纳米颗粒。所述光学元件可以是可移动的，例如，所述光学元件可以含有可移动的镜子、空间调节器或声光调节器。激光器本身还可以是可移动的。通过移动含有样品的反应容器，可以实现样品的移动。在一个特别优选的实施方案中，移动激光束以及反应容器。在另一个优选的实施方案中，样品在反应体积内移动，使得激光在不同的时间捕获样品的不同分体积。这可以例如如下实现：搅拌反应体积中的样品，例如，通过使用磁力搅拌器。反应体积可以例如呈现长形，例如，通道或管。样品可以例如穿过通道移动，其中样品在一个或几个位置穿过激光束。优选地，样品流动穿过通道并经过n个位置，在每个位置处，一个激光束被导向通道中的样品；由于样品经过n个激光束的线性流动，可以执行具有n个循环的PCR。以此方式，可以用少量可移动的部件进行该方法。通过使用通道，微型化(例如，在芯片实验室的含义上)是可能的。优选地，激光束会造成变性同时通过总体加热产生延伸温度和退火温度。特别优选的是，延伸温度等于退火温度，使得在总体加热中仅必须保持一种温度。以此方式，可以用最小的工作量执行根据本发明的方法。
在一个优选的实施方案中，在所述方法中使用热不稳定的DNA聚合酶。对于其中使用纳米颗粒的激发进行变性的情况，可以避免整个反应体积向高温的暴露。相反，可能排它地将纳米颗粒的直接环境加热至变性温度。以此方式，没有位于直接环境中的DNA聚合酶不会暴露于高温。由此，可能使用不是热稳定的、而是热不稳定的DNA聚合酶。通过包含热不稳定的DNA聚合酶，更大的聚合酶选择可用于根据本发明的方法。由于DNA聚合酶的更大选择，可以在更大的程度上改变反应条件，同时维持使用的DNA聚合酶的足够操作。为了使要扩增的核酸能够结合纳米颗粒上的带负电荷的寡核苷酸，可能有必要在样品中以对热稳定的DNA聚合酶的操作可能具有有害作用的浓度使用物质、特别是盐，这会降低所述方法的效率。DNA聚合酶(尤其是具有高盐耐受性的那些)的更大选择可以导致所述方法的效率的增加。DNA聚合酶的更大选择的一部分是小DNA聚合酶，例如，克列诺(Klenow)片段和Phi29。在纳米颗粒紧邻处，热稳定的大DNA聚合酶可能由于附着的引物和可能已经延伸的引物而经历位阻。所以，DNA聚合酶可能不会到达要拷贝的核酸，或者在DNA聚合酶已经合成原始核酸或补体的完整拷贝之前中断所述DNA聚合酶，这会造成所述方法的效率的下降。因而，DNA聚合酶的更大选择使得方法效率的增加成为可能。由于DNA聚合酶的更大选择，有利的是，具有更低生产成本的酶也是可利用的。没有位于纳米颗粒的直接环境中的DNA聚合酶会经历更小程度的热诱导的灭活。由此，有利的是，在所述方法中可以使用更少量的DNA聚合酶。
在本发明的一个优选实施方案中，可溶性的引物以及在纳米颗粒上的引物存在于反应体积中。所述可溶性的引物没有缀合至纳米颗粒，而是溶解在样品中。优选地，所述可溶性的引物小于纳米颗粒引物缀合物，且因而可以以比纳米颗粒引物缀合物更大的浓度存在。因此，所述可溶性的引物可以具有对长双链核酸(例如，基因组DNA)更好且更快的接近。在一个特别优选的实施方案中，在所述方法的第一步中，通过整个反应体积的总体加热使长双链核酸变性，此后可溶性的引物与核酸杂交。PCR最初通过一个或几个含有总体加热的循环运行，在此过程中，DNA聚合酶合成长双链核酸的期望的短拷贝。随后，也使用通过纳米颗粒的激发实现的局部加热来继续PCR。
在本发明的一个优选实施方案中，使用光场可以扩大纳米颗粒引物缀合物的颗粒扩散。通过涡旋光场(根据Silvia Albaladejo等人,Nano Letters,2009,第9卷,第10期,第3527-3531页，其有关内容通过引用形成本公开内容的一部分)来激发纳米颗粒，或者由于施加于纳米颗粒上的光力(根据Arthur Ashkin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,1997,第94卷,第10期,第4853-4860页，其有关内容通过引用形成本公开内容的一部分)，可以增加纳米颗粒扩散。由此，有利的是，在给定的纳米颗粒浓度，可以发生要扩增的核酸与纳米颗粒上的引物的更快速杂交。这可以用于实现根据本发明的方法的加速。
在本发明的一个实施方案中，用测试探针可以检测扩增反应产物的浓度。测试探针是在它们的表面上含有具有测试序列的寡核苷酸的纳米颗粒。在所述方法的一个优选的实施方案中，测试探针的寡核苷酸具有间隔物序列作为部分序列。所述间隔物序列位于寡核苷酸的更靠近纳米颗粒的一侧上。因而，所述间隔物序列将寡核苷酸的剩余部分用作间隔物。在一个优选的实施方案中，所述测试探针的寡核苷酸含有被称作测试序列的部分序列和作为间隔物序列的部分序列。在一个优选的实施方案中，所述测试探针具有与其连接的填充分子。所述测试序列可以与扩增反应的产物杂交。其中，测试序列优选地与扩增反应的产物至少部分地互补。在一个优选的实施方案中，将第一纳米颗粒缀合至正向引物。在有原始核酸和DNA聚合酶存在下，延伸正向引物，使得经由正向引物产生与第一纳米颗粒结合的补体。其中，补体由正向引物和延伸序列组成，所述延伸序列通过正向引物的延伸而建立。特别优选地，使用可溶性的和/或纳米颗粒缀合的反向引物进行PCR，使得在指数扩增中，优选地产生原始核酸和纳米颗粒缀合的补体的大量拷贝。最优选地，第一纳米颗粒在它们的表面上含有正向引物和反向引物。在一个任选的中间步骤中，通过局部或总体加热，使原始核酸和可能它们的拷贝从补体变性。然后使第一纳米颗粒与测试探针在一起，如果这在以前没有发生的话。测试探针的测试序列与延伸序列互补，使得测试探针可以经由测试序列结合至第一纳米颗粒上的延伸的正向引物。在适当的反应条件下，第一纳米颗粒和测试探针的连接可以发生达到存在纳米颗粒结合的补体的程度。这意味着，如果没有形成延伸序列，则不会产生测试探针和纳米颗粒之间的连接。更优选地，选择根据本发明的使用测试探针的扩增和检测的反应条件，使得第一纳米颗粒与测试探针的连接程度允许得到关于在扩增之前在样品中存在何种原始核酸浓度的结论。通过第一纳米颗粒与测试探针的连接，可以产生可测量的变化，例如，吸收光谱中的等离子体共振的红移或拓宽。在一个特别优选的实施方案中，通过测试探针与纳米颗粒的连接而发生的可测量的变化与扩增之前样品中的原始核酸的浓度成比例。以此方式，有利的是，可以使用简单工具来验证浓度。
在另一个优选的实施方案中，所述方法包括缀合至第一纳米颗粒的正向引物和游离的和/或纳米颗粒结合的反向引物。特别优选的是，所述纳米颗粒在它们的表面上含有正向引物以及反向引物。在第一步中，在有原始核酸存在下，DNA聚合酶将正向引物延伸成纳米颗粒结合的补体。在第二步中，从反向引物(其结合至纳米颗粒结合的补体)开始，合成原始核酸的拷贝。此后，使第一纳米颗粒与测试探针在一起，如果这尚未发生的话。在该实施方案中，测试序列与正向引物互补。如果没有延伸正向引物，那么测试探针可以较好地结合第一纳米颗粒。如果延伸了正向引物，那么测试序列与正向引物的结合由于位阻而被抑制。如果原始核酸的新合成的拷贝与延伸的正向引物杂交，那么会阻止测试序列与延伸的正向引物的结合。以此方式，第一纳米颗粒和测试探针之间的连接程度下降至这样的程度：其中合成扩增反应的产物，即，原始核酸的补体和拷贝。当适当地选择反应条件时，可以检测原始核酸的浓度，使得在扩增之前在样品中存在的原始核酸越多，可测量的变化越小。可测量的变化可以是例如吸收光谱中的等离子体共振的红移或拓宽。以此方式，可以有利地设计简单试验，其允许确定特定核酸的浓度。
本发明使得提供一种改进的用于扩增核酸的方法成为可能。
附图说明
图1在一个示意图中显示了缀合至填充分子、间隔物序列和引物序列的根据本发明的纳米颗粒。
图2在另一个示意图中显示了缀合至填充分子、间隔物序列和引物序列的根据本发明的纳米颗粒。
图3在一个示意图中显示了用激光器、二维镜子扫描仪和样品执行根据本发明的方法的一个设置。
图4在一个示意图中显示了用激光器、镜子和样品(其相对于激光束移动)执行根据本发明的方法的另一个设置。
图5在一个示意图中显示了用激光器、一维镜子扫描仪和样品(其在一个维度移动)执行根据本发明的方法的另一个设置。
图6在一个示意图中显示了用于DNA的阳性检测的根据本发明的纳米颗粒和根据本发明的测试探针。
图7在一个示意图中显示了用激光器、二维镜子扫描仪和在水浴器中的样品试管执行根据本发明的方法的另一个设置。
图8在2个简图中显示了使用总体和局部加热的扩增反应的结果，其中将测试探针用于DNA的阳性检测。
图9在一个示意图中显示了用于DNA的阴性检测的根据本发明的纳米颗粒和根据本发明的测试探针。
图10在2个简图中显示了使用总体和局部加热的扩增反应的结果，其中将测试探针用于DNA的阴性检测。
图11在一个简图中显示了使用非热稳定的克列诺片段的扩增反应的结果。
图12在一个简图中显示了使用固定激光束和移动激光束的扩增反应的结果。
图13在一个示意图中显示了用光源、偏转元件和可移动的样品试管执行根据本发明的方法的一种设置。
图14在一个示意图中显示了含有填充分子、寡核苷酸和DNA聚合酶的根据本发明的纳米颗粒的断面。
图15在4个简图中显示了扩增反应的结果，其中将测试探针用于DNA的阴性检测。
图16在一个示意图中显示了用于激发样品试管中的纳米颗粒的第一激光器以及用于测量样品的透射的第二激光器和光电二极管。
具体实施方式
图1显示了用于扩增核酸1的根据本发明的方法的一个实施方案，其作为PCR来实现。反应体积2含有第一纳米颗粒3。第一纳米颗粒3在它们的表面上显示寡核苷酸4，如在图1a中所见。一类寡核苷酸4各自含有具有序列A的引物序列5作为部分序列和间隔物序列6S作为额外的任选的部分序列。引物序列5被定义为引物7的序列。间隔物序列6S用于保持引物序列5离纳米颗粒8的表面足够远，使得要扩增的核酸1以更好的效率结合引物序列5和DNA聚合酶10更好地接近引物序列5。具有引物序列5A的寡核苷酸4例如经由巯基键连接至第一纳米颗粒的表面，使得3'-末端面向离开第一纳米颗粒3的方向。任选地，另一类寡核苷酸4可以存在于第一纳米颗粒3的表面上；这些是填充分子9F。使用填充分子9，可以调节纳米颗粒8的电荷，从而避免纳米颗粒8的不希望的聚集。此外，填充分子9可以增加纳米颗粒8的表面上的引物序列5到彼此的距离，使得要扩增的核酸1和DNA聚合酶10可以更好地接近引物序列5。这可以增加所述方法的效率。间隔物序列6优选地至少象填充分子9一样长，使得引物序列5有利地从填充分子9突出。
样品11存在于反应体积2中，该样品11含有来自图1a的第一纳米颗粒3以及引物序列5、间隔物序列6和填充分子9，和除此以外，dNTP和DNA聚合酶10。要检测的核酸1可以存在于样品11中。在该实施方案中，要检测的核酸1是DNA单链(其也被称作原始核酸12)，且含有部分序列A'以及部分序列B'。原始核酸12可以含有其它部分序列，例如作为在5'或3'-末端上的突出部分或在2个部分序列A'和B'之间。在图1b中，原始核酸12用它的部分序列A'结合在第一纳米颗粒3的表面上的引物序列5A。在图1c中显示了DNA聚合酶10结合原始核酸12并结合与原始核酸12杂交的引物序列5A。随后，DNA聚合酶10在延伸步骤中合成(这显示在图1d中)，从引物序列5A(与原始核酸12互补的核酸1，该核酸被称作补体13，且连接至第一纳米颗粒3的表面上的间隔物序列6)的3'末端开始。在图1e中，然后用光照射第一纳米颗粒3，所述光被第一纳米颗粒3吸收(因为它的等离子体性能或材料性能)且被转化成热。该热被传递至第一纳米颗粒3的环境和原始核酸12的区域内，并且与原始核酸12杂交的新合成的补体13足以使原始核酸12从补体13变性。原始核酸12现在再次成为游离的(如在图1f中所示)，使得它可以结合另一个引物序列5，并且可以在所述方法的额外循环中合成其它纳米颗粒结合的补体13。以此方式，用递增数目的循环建立补体13的浓度的线性增加。在本文件中下面进一步阐明了在图1g和1h中描述的方法的步骤。
图2显示了根据本发明的方法的一个实施方案，其中纳米颗粒8位于样品11中。纳米颗粒8在它们的表面上显示填充分子9F。此外，纳米颗粒8缀合至寡核苷酸4。第一类寡核苷酸4由间隔物序列6S和引物序列5A组成。第二类寡核苷酸4由间隔物序列6S和引物序列5B'组成。在该实施方案中，要扩增的原始核酸12是具有部分序列A、C、B(未显示)的单链DNA分子。从在纳米颗粒8的表面上的引物序列B'开始，DNA聚合酶10合成与原始核酸12互补的链，使得如在图2a中所示，具有序列S、B'、C'和A'的DNA单链位于纳米颗粒8上。与此同时，在图2a上可以看出，DNA聚合酶已经从引物序列5A开始合成原始核酸12的拷贝，所述引物序列5A与纳米颗粒8的表面上的间隔物序列6S连接。如图2a中的一个箭头所示，与纳米颗粒8连接的原始核酸12的拷贝会用它的部分序列B与相同纳米颗粒8的表面上的引物序列5B'杂交。图2a中的第二个箭头表明，在纳米颗粒8的表面上合成的补体13用它的部分序列A'与相同纳米颗粒8的表面上的引物序列5A杂交。所述2个杂交的结果显示在图2b中。其中，原始核酸12以及补体13在纳米颗粒8的表面上形成环。图2c表明，从引物7B'合成与原始核酸12互补的链，所述链经由间隔物序列6S连接至纳米颗粒8的表面。另一种DNA聚合酶10从引物序列5A开始合成原始核酸12的拷贝，所述拷贝也经由间隔物序列6连接至纳米颗粒8的表面。2个合成的结果显示在图2d中。在该实施方案中，正向引物14以及反向引物15都位于相同的纳米颗粒8上。以此方式，新合成的DNA链可以与相同纳米颗粒8上的引物7回交。这会导致根据本发明的方法的加速，因为新合成的DNA链不必远距离移动就会遇到互补引物7。相反，新合成的DNA链可以特别快速地结合相同纳米颗粒8的表面上的互补引物7，这具体地会被纳米颗粒8上的引物7的高局部浓度促进。在图2d中激发纳米颗粒8(例如，用激光器16)以后，原始核酸12的拷贝和补体的拷贝(它们各自经由间隔物序列6连接至纳米颗粒8的表面)脱杂交。此后，原始核酸12的拷贝(其连接至纳米颗粒8)可以与补体13(其连接至另一个相同纳米颗粒8的表面)杂交。通过杂交，连接纳米颗粒8，使得可测量的变化发生。可测量的变化可以例如由样品11的颜色变化组成。在图2a至2e中显示的根据本发明的方法的实施方案使得提供用于检测原始核酸12的简单试验成为可能。
图3显示了适合用于执行根据本发明的方法的一种设置。该设置含有光源17(其在该情况下作为激光器16来应用)和二维镜子扫描仪18(其可以将光从激光器16导向样品11)。二维镜子扫描仪18可以在2个维度偏转激光器。在该设置中，通过将激光束聚焦在样品11的一部分上，发生样品11的变性。在该方法过程中，使激光束偏转，使得它击中样品11的不同部分。在图3所示的实施例中，镜子扫描仪18使激光束偏转，使得激光束逐行移动穿过样品11所在的反应体积2。在图3中，用短划线显示激光束在样品11中经过的路径。由于在该方法中的任意时间仅激发样品11的某些部分的事实，可以使用具有更小功率输出的激光器16。由于低于1微秒的激发足以借助于光热地(optothermally)加热的纳米颗粒8使DNA变性，大约10-100μm的激光器16的典型焦点直径允许激光束以大约10-100m/s的速度扫描样品11，同时在激光器扫过的每个点导致DNA的变性。这会实现大样品体积的非常快速的扫描。例如，在78μm的焦点直径和128行(行间距离为78μm，行长度为1厘米)，在10m/s的扫描激光束速度，1cm2的面积的完全扫描仅需要128ms。有利地，这显著短于使用总体加热的变性步骤通常需要的时间。光学元件(例如，图3所示的镜子扫描仪18和所谓的F-θ-透镜)可以达到焦点质量和尺寸在扫描的整个样品11中的良好同质性。作为连续发射激光器16的一个替代方案，可以使用脉冲激光器16或热辐射器。
图4显示了用于执行根据本发明的方法的一种设置，其中将激光器16和镜子19固定，并且使用镜子19将激光器16的激光束导向样品11。其中，将样品11排列成可在2个维度移动，使得通过移动样品11，可以用激光器16的焦点达到整个样品11或样品11的大部分。
图5显示了一种用于执行根据本发明的方法的设置，其中将激光器16固定，并且镜子扫描仪18可以在一个方向偏转激光器16的激光束。将样品11排列成可在一个方向移动，使得通过移动镜子扫描仪18和样品11，可以用激光束达到整个样品11或样品11的大部分。在图6中显示了通过根据本发明的PCR来检测核酸1的一种可能性。其中，第一纳米颗粒3(其在它们的表面上显示填充分子9F和第一寡核苷酸20)位于样品中。第一寡核苷酸20由间隔物序列6S和引物序列5A组成，如在图6a中所示。如果具有部分序列A'和B'的原始核酸12存在于样品11中，那么原始核酸12会与在第一纳米颗粒3之一上的互补引物序列5A杂交。DNA聚合酶10从引物序列5A开始合成具有部分序列A和B的补体13，使得补体13经由间隔物序列6S连接至第一纳米颗粒3的表面，如在图6c中所示。在下一步中，将图6d所示的测试探针21加入样品中。测试探针21是第二纳米颗粒22，其在它们的表面上显示填充分子9和第二寡核苷酸23。第二寡核苷酸23含有间隔物序列6S和测试序列5B'。测试序列5B'可以与在第一纳米颗粒3的表面上的补体13的互补部分序列B杂交，如在图6f中所示。由此，第一纳米颗粒3和第二纳米颗粒22连接，使得可测量的变化可以发生。如果原始核酸12不存在于样品11中，那么不会在第一纳米颗粒3的表面上建立补体13，如在图6b中所见。由于在第一纳米颗粒3上不存在补体13，第一纳米颗粒3和第二纳米颗粒22不可彼此连接，并且不会发生可测量的变化。在该实施方案中，序列B'与序列B互补；序列B'还可以与序列A的某些部分互补。在第一纳米颗粒3上的间隔物序列6S与在第二纳米颗粒22上的间隔物序列6S相同。但是，在另一个实施方案中，可以在第一纳米颗粒3和第二纳米颗粒22上使用不同的间隔物序列6。并且，可以在相同种类的纳米颗粒8上使用几种不同的间隔物序列6。优选地选择缓冲液和杂交条件(例如，温度、盐浓度、纳米颗粒浓度、额外缓冲液添加剂的浓度、pH)，使得连接第一纳米颗粒3与第二纳米颗粒23的杂交仅可以在完全延伸第一纳米颗粒3上的引物序列5A以后产生。例如，可以将第一纳米颗粒3与第二纳米颗粒22的连接检测为吸收光谱的等离子体共振的红移和拓宽。例如，还可以如下检测连接：测量在纳米颗粒8的光热激发以后在一个或几个波长处的透射的变化以及得到的核酸1的变性，所述核酸1连接第一纳米颗粒3与第二纳米颗粒22。可以在特定的杂交缓冲液中供给测试探针21，在所述方法的合成补体13的步骤以后，向所述杂交缓冲液中加入样品11的至少一部分，该部分含有第一纳米颗粒3。在所述方法开始之前，测试探针21可以与第一纳米颗粒3一起已经存在于样品中。在该情况下，可以将测试探针21钝化，使得它们不会充当引物7。测试探针21的钝化可以由选择测试探针21上的引物序列5组成，以此方式，在PCR过程中在退火温度不会发生所述引物序列5与原始核酸12的杂交，但是仅在随后降低温度以后才会发生。测试探针21的钝化可以如下建立：连接第二寡核苷酸23，其在第二纳米颗粒22的3'-末端处含有原始核酸12的部分序列，使得DNA聚合酶10不会延伸第二寡核苷酸23。在该情况下，第二寡核苷酸23可以在它们的5'-末端上为游离的或连接至第二纳米颗粒22。测试探针21还可以通过在第二寡核苷酸23的游离主要末端处碱基修饰(例如，用二脱氧胞嘧啶(ddC))来钝化，所述修饰会阻止延伸。
在如图6所示的方法的实施方案中，用寡核苷酸4官能化用金制成的具有60nm直径的第一纳米颗粒3(根据J.Hurst等人,Anal.Chem.,78(24),8313-8318,2006，其有关内容通过引用形成本公开内容的一部分)。其中，使用一部分寡核苷酸4 ID 1和作为填充分子9的四部分寡核苷酸4 ID 2。在官能化和6个洗涤步骤以后，第一纳米颗粒3以200μl的浓度存在于PBS缓冲液(20mM PBS,10mM NaCl,0.01％吐温20,0.01％叠氮化物,1mM EDTA,pH 7.5)中。以10μl的总体积在200μl样品试管24中进行扩增反应(5μl DreamTaq PCR标准混合物2x(fermentas),0.1μl NaCl 5M,0.1μl MgCl2 250mM,0.1μl MgSO4 250mM,1μl官能化的第一颗粒200pM,1μl溶解在含有100nM寡核苷酸4ID4(寡核苷酸4ID4用于饱和表面，例如，在反应之前在原始核酸12的贮存过程中)的水中的寡核苷酸4ID3(作为要扩增的原始核酸12，其中要确定的原始核酸12的浓度是处于10μl的总体积，例如，0pM、10pM、20pM或50pM)，2.7μl水)。如在图7中所示，在水浴器26中在玻璃比色皿25中使样品试管24达到65℃的温度，其中所述温度是退火温度以及延伸温度。水浴器26除了保持正确的温度以外，还用于将激光器16更好地耦合进样品试管24的非平面表面中。水浴器26中的水能够降低样品试管24的外侧和它的内侧(其用PCR反应混合物填充)之间的折射率差异；因而抑制激光束的折射和对焦点质量和清晰度产生的负面影响。由此，有利地改善激光器16的耦合。激光器16(其用于激发纳米颗粒)是频率倍增的二极管泵送的:Nd:YAg激光器(Coherent Verdi V10)，其用在镜子扫描仪18(Cambridge technologies,Pro Series 1)后面的F-θ-透镜(Jenoptik,焦距100mm)以1.5W的输出功率聚焦在水浴器26中的样品试管24(焦点直径大约20μm)。镜子扫描仪18允许将焦点逐行移动穿过样品试管24(如已经在图3中所示)，并因而在光热扩增中牵涉整个PCR反应体积。每个样品试管24，以大约2m/s的在样品试管24中的行速度，以大约12μm的距离用焦点扫描400行。这对应于在第一样品试管24中的一个循环。随后，一个接一个地扫描所有其它样品试管24，使得每个样品试管24已经经历一个循环。在扫描第一样品试管24以后40s的等待时间以后，开始下一个循环，并且进行重复，直到每个样品试管24已经完成25个循环。选择0pM作为第一样品试管24中的原始核酸12的开始浓度，选择20pM作为第二样品试管24中的原始核酸12的开始浓度，并选择50pM作为第三样品试管24中的原始核酸12的开始浓度。对于阴性对照，将第四样品试管24插入水浴器26中，所述水浴器26也含有50pM浓度的原始核酸12，但是没有被激光束命中。在第一、第二和第三样品试管24已经完成25个循环以后，从水浴器26取出所有4个样品试管24。为了检测激光器循环和原始核酸12的浓度的作用，使用测试探针21，其能够在选择的缓冲液和杂交条件下排它地与通过延伸纳米颗粒结合的引物而产生的测试序列杂交。其中，引物7的延伸段与原始核酸12互补，如在图6c中所示。为了生产测试探针21，用寡核苷酸4官能化用金制成的具有16nm直径的第二纳米颗粒22(根据J.Hurst,出处同上)。其中，使用一部分寡核苷酸4ID5和作为填充分子9的四部分寡核苷酸4ID2。官能化和6个洗涤步骤以后，第二纳米颗粒22以200pM的浓度存在于PBS缓冲液(20mM PBS,10mM NaCl,0.01％吐温20,0.01％叠氮化物,1mM EDTA,pH 7.5)中。对于第一纳米颗粒3上的寡核苷酸4与第二纳米颗粒22上的寡核苷酸4的杂交，使用改进的磷酸盐缓冲液(13mM PBS,200mM NaCl,0.02％吐温20,1mM EDTA,20mM柠檬酸钠,1μg/ml PVP10,pH7.5)。10μl杂交溶液含有2.25μl改进的磷酸盐缓冲液、3μl甲酰胺、2μl NaCl 5M、0.25μl200pM测试探针溶液和2.5μl得自光热扩增的相应的PCR溶液，该PCR溶液含有第一纳米颗粒3。如果足量的具有序列ID3的原始核酸12存在于样品试管中，那么会延伸在第一纳米颗粒3的表面上的具有序列ID1的寡核苷酸4，并且所述寡核苷酸4能够与测试探针的表面上的具有序列ID5的寡核苷酸4杂交，如在图6f中所示。使用纳米颗粒8的光热激发验证杂交(根据EP 2162549，其有关内容通过引用形成本公开内容的一部分)。为此目的，用来自第一激光器27(50μs脉冲持续时间，532nm波长，大约700mW峰功率，焦点直径大约30μm)的脉冲击中样品试管24，如在图16中所示。由此，将纳米颗粒8进行光热加热，并将热传递至它们的环境。如果第一纳米颗粒3和第二纳米颗粒22由于寡核苷酸4的杂交而连接(如在图6f中所示)，那么它们将通过激光器脉冲而分离。这可以使用第二激光器28(波长630nm，连续功率5mW)来检测，如在图16中所示；第二激光器的焦点(30μM直径)与第一激光器27的焦点(其优选地用于排它地脱杂交)重叠，所述第二激光器的焦点检测在第一激光器27的激光器脉冲之前和之后的吸光度。在光程上光热地诱导吸光度的变化，并测量为大约2mm的量。用光电二极管35测量透过该层的第二激光器28的光的强度。从脉冲之前和之后光电二极管的电流差异确定光热诱导的透射变化，所述透射变化由纳米颗粒8之间的延伸的第一寡核苷酸20和第二寡核苷酸23的脱杂交以及随后彼此远离的纳米颗粒的扩散产生。
图8a显示了相对透射变化，其由第一激光器27的激光器脉冲和得到的第一纳米颗粒3和第二纳米颗粒22之间的寡核苷酸4的脱杂交产生；相对透射变化是样品试管24中金-DNA-金键的存在的量度。在图8a的简图下面，完成的循环的数目显示在第一行中。在位于第一行下面的第二行中，以pM为单位显示在进行扩增之前样品试管24中的原始核酸12的浓度。在图8a的简图的右侧，在部分B中，从左至右显示了第一、第二和第三样品试管24，其中的每个已经完成了25个光热循环；除此以外，显示了第四样品试管24，其尚未接受任何光热处理。可以清楚地看出，当已经完成25个循环时，作为金-DNA-金键的指示的所测量的透射变化随着扩增之前原始核酸12浓度的增加而增加。对于不含原始核酸12的第一样品试管24和没有经过光热处理的第四样品试管24，仅观察到小透射变化。这表明，在本文中，没有发生第一纳米颗粒3上的引物序列5的延伸，且因而，与测试探针的结合是不可能的。仅在完成光热循环以后和在有原始核酸存在下，DNA聚合酶10可以建立第一纳米颗粒3上的引物序列5的延伸，这会导致第一纳米颗粒3与第二纳米颗粒22的连接，并由于光热诱导的纳米颗粒8的分离而最后导致透射变化。
作为对比，图8a在左侧在部分A中显示了相应实验的结果，该实验没有通过纳米颗粒8的光热激发而局部地加热DNA，而是在常规热循环仪(Labnet Multi Gene II)中总体上加热整个反应体积2。从左至右显示了第一至第四样品试管24，它们的内容物与在前一段中描述的实验中的样品试管相同。对第一、第二和第三样品试管24进行经典的PCR方案(93℃保持1s，53℃保持20s，35个循环)。如在光热加热的情况下一样，可以观察到，在扩增之前在每个样品试管24中存在的原始核酸12越多，测量的透射变化越大，所述透射变化由激光器脉冲和第一纳米颗粒3和第二纳米颗粒22之间形成的DNA脱杂交造成，并且所述透射变化是溶液中的金-DNA-金键的存在的量度。第四样品试管24(尽管含有50pM原始核酸12)没有被循环加热，且几乎没有表现出透射变化。在该情况下，没有以足够的程度延伸在第一纳米颗粒3上的引物序列5。
图8b显示了利用整个反应体积2的总体加热的类似实验，但是，尽管循环的数目在增加(在简图下面的第一行)，然而在扩增之前样品试管24中的原始核酸12的浓度恒定在10pM(在简图下面的第二行)。在这里，可以清楚地看出，随着循环数目增加，测量的透射变化变得更大，这清楚地表明：延伸的第一纳米颗粒3上的引物7越多，完成的循环越多，因而清楚地表明：测量的信号的起源实际上是DNA聚合酶10完成的第一纳米颗粒3上的寡核苷酸4的延伸。
在所述方法的一个实施方案中，在延伸第一纳米颗粒3的表面4上的引物序列5(在该延伸过程中，产生纳米颗粒结合的补体13)以后，使用游离的反向引物15(其结合补体的3'-末端)。图1g表明，已经合成的具有部分序列A和B的补体13(其经由间隔物序列6连接至第一纳米颗粒3的表面)与预先游离存在于样品11中的引物7B'杂交。其中，引物7具有序列B'且与补体13的部分序列B连接。从具有序列B'的引物7开始，DNA聚合酶合成原始核酸12的拷贝。在图1g中也表明，原始核酸12已经结合第一纳米颗粒3的表面上的另一个引物序列5A，并且DNA聚合酶10从引物序列5A开始合成另一个补体。原始核酸12、原始核酸12的拷贝以及与第一纳米颗粒连接的2个补体13显示在图1h中。随后通过第一纳米颗粒3的激发实现的变性会导致原始核酸12和它的拷贝变成游离的。其中，原始核酸12以及它的拷贝可以充当模板，用于在所述方法的随后的步骤中扩增。在等待时间(其可能是原始核酸12和原始核酸12的拷贝与第一纳米颗粒3上的引物序列5A的杂交以及游离引物B'与已经在第一纳米颗粒3上延伸的引物序列5的杂交所必需的)以后，可以用第一纳米颗粒3的另一个激发执行所述方法的下一个循环。优选地，重复该循环直到足量的延伸的引物序列5存在于第一纳米颗粒3上和/或足量的原始核酸12的拷贝存在于样品11中，以允许验证实现的扩增，或者，单独地，原始核酸12在样品11中的存在。通过使用游离引物7B'(如在图1g和1h中所示)，原始核酸12的指数扩增是可能的。在图1a至1f中，在没有该游离引物7的情况下，仅可实现纳米颗粒结合的补体13的线性扩增。在一个实施方案中，DNA的变性可以在小于1毫秒中发生。在该实施方案中，即使在40个循环中，DNA的变性和随后冷却至延伸温度总共仅需要几毫秒。这意味着，根据本发明的方法的持续时间不是由技术限制(诸如常规热循环仪的加热和冷却速率)确定。并且，避免了反应体积2的热化时间，因为热已经在纳米颗粒8的环境中产生，并且在几纳秒内实现平衡温度分布。由此，可以显著地加速PCR。
在图9中显示了用于验证实现的扩增的一种可能性。图9a和9c描绘了使用溶解的反向引物7B'的指数扩增，如在图1a至1h中已经显示的。此后，将测试探针21加入样品11中。在该实施方案中，测试探针21由第二纳米颗粒22组成，所述第二纳米颗粒22在它们的表面上被任选的填充分子9和测试序列A'官能化，如在图9d中所示。任选地，可以将间隔物序列6S(其不一定与图1或图9a的第一纳米颗粒3上的间隔物序列6S相同)置于测试序列A'和第二纳米颗粒22的表面之间。测试序列A'与第一纳米颗粒3上的引物序列5A的至少一部分互补。测试序列A'与原始核酸12的拷贝(其含有在图1a至1h的方法中产生的部分序列A')竞争引物序列5A。这意味着，如果存在许多原始核酸12的拷贝，那么在第一纳米颗粒3的表面上的引物序列5A已经被原始核酸12的拷贝的部分序列A'占据。在该情况下，引物序列5A不可与第二纳米颗粒22上的测试探针A'杂交或者仅可以在有限程度上与其杂交。因而，第一纳米颗粒3没有连接至第二纳米颗粒22或者仅在有限程度上与其连接。如在图9c中所示，在第一纳米颗粒3上的延伸的引物序列5A与原始核酸12和它的拷贝杂交，且因而形成可以造成位阻的刚性双链DNA；也因此，当存在大量原始核酸12的拷贝时，可阻止第一纳米颗粒3与第二纳米颗粒22的连接。在没有或有小量原始核酸12和原始核酸12的拷贝存在下，第一纳米颗粒3主要呈现未被占据的引物序列5A，如在图9b中所示。当加入测试探针21时，第二核苷酸23A'与第一纳米颗粒3上的未占据的引物序列5A杂交。因此，第一纳米颗粒连接至第二纳米颗粒22，如在图9e中所示。在该实施方案中，第一纳米颗粒3与第二纳米颗粒22的连接程度越弱，通过扩增反应产生的原始核酸12的拷贝越多，这取决于在扩增反应开始时原始核酸12的浓度。选择缓冲液条件和杂交条件(例如温度、盐浓度、纳米颗粒浓度、其它缓冲液添加剂的浓度、pH)，使得在完成引物序列5A的特异性延伸和完成原始核酸12的拷贝的合成以后，引物序列5A与第二寡核苷酸23A'的杂交的抑制尽可能有效。与此同时，选择所述条件，使得当没有发生扩增时，会建立引物序列5A与第二寡核苷酸23A'的有效杂交。例如，通过吸收光谱的等离子体共振的红移和拓宽，或者通过测量纳米颗粒8的光热激发以后在一个或几个波长的透射变化以及得到的纳米颗粒连接的DNA的变性，可以验证由杂交引起的第一纳米颗粒3与第二纳米颗粒22的连接。可替换地，例如，通过PCR、实时PCR、定量实时-PCR、凝胶电泳或通过使用染料标记的探针，可以进行在所述方法中产生的原始核酸12的拷贝的验证或定量。
在图9所示的方法的实施方案中，如已经在图6的实施方案中所示，用寡核苷酸4官能化用金制成的具有60nm直径的第一纳米颗粒3，但是，在图9中寡核苷酸4 ID1与寡核苷酸4 ID2的比率是1:9。在官能化和6个洗涤步骤以后，第一纳米颗粒3以200pM的浓度存在于PBS缓冲液(20mM PBS,10mM NaCl,0.01％吐温20,0.01％叠氮化物,1mM EDTA,pH 7.5)中。在200μl样品试管24中以10μl的总体积进行扩增反应(5μl DreamTaq PCR标准混合物2x(fermentas),0.1μl NaCl 5M,0.1μl MgCl2 250mM,0.1μl MgSO4 250mM,1μl官能化的第一纳米颗粒3 200pM,1μl反向引物ID6 500nM,1μl溶解于含有100nM寡核苷酸4ID4(在本文中，寡核苷酸4ID4用于饱和表面，例如，在反应之前贮存原始核酸12的过程中)的水中的寡核苷酸4ID3(作为要扩增的原始核酸12，其中要在10μl总体积中确定的原始核酸12的浓度总计为例如0pM或10pM),1.7μl水)。将样品试管24在水浴器26中在玻璃比色皿25中保持在54℃的温度，如在图7中所示。
其中，54℃构成退火温度以及延伸温度。水浴器26除了用于温度控制以外，还用于更好地将激光器16耦合进样品试管24的非平面表面中。在水浴器26中的水允许降低样品试管24(其用PCR反应混合物填充)的外侧和它的内侧之间的折射率差异，并因而抑制激光束的折射和对焦点质量和清晰度产生的负面影响。由此，有利地改善激光器16的耦合。激光器16(其用于激发纳米颗粒8)是频率倍增的二极管泵送的Nd:YAg激光器(Coherent VerdiV10)，其以3W的输出功率用在镜子扫描仪18后面的F-θ-透镜(Jenoptik,焦距100mm)聚焦在水浴器26中的样品试管24。镜子扫描仪18允许将焦点逐行移动穿过样品试管24(如在图3中所示)，并因而在光热扩增中涉及整个反应体积2。每个样品试管24，以大约2m/s的在样品试管24中的行速度，以大约12μm的距离用焦点扫描400行。这对应于在第一样品试管24中的一个循环。随后，一个接一个地扫描所有其它样品试管24，使得每个样品试管24已经经历一个循环。在扫描第一样品试管24以后40s的等待时间以后，开始下一个循环，并且根据预定的循环数目进行重复。检测了7个样品试管24，它们从左至右显示在图10a中。第一和第二样品试管24不含有任何原始核酸12。在第三至第七样品试管24中，10pM原始核酸12作为初始浓度存在。作为对照，第一和第三样品试管24没有进行光热处理。第四样品试管24用5个循环光热处理，第五样品试管24用15个循环光热处理，第六样品试管24用25个循环光热处理。第二和第七样品试管24用35个循环的最大数目光热处理。所有样品试管24在水浴器26内保持相同量的时间，仅光热激发不同。在第二和第七样品试管24已经完成所有35个循环以后，从水浴器26中取出所有7个样品试管24。该方法的一个优点是，无需巨大工作量，可以用不同数目的循环处理不同样品11，这可以例如应用在平行化的定量PCR中。
测试探针21用于确定激光器循环和原始核酸12的浓度的影响，所述测试探针21可以在选择的引物和杂交条件下优选地与用引物序列5官能化的第一纳米颗粒3杂交，所述纳米颗粒没有被原始核酸12的互补拷贝封闭，所述拷贝在扩增反应中产生。这对应于如在图9中所示的测试探针21。为了生产测试探针21，用寡核苷酸4官能化用金制成的具有60nm直径的第二纳米颗粒22(根据J.Hurst,出处同上)。其中，使用四部分寡核苷酸4ID2和一部分寡核苷酸4ID7。在官能化和6个洗涤步骤以后，第二纳米颗粒22以200pM浓度存在于PBS缓冲液(20mM PBS,10mM NaCl,0.01％吐温20,0.01％叠氮化物,1mM EDTA,pH7,5)中。对于杂交，使用改进的磷酸盐缓冲液(13mM PBS,200mM NaCl,0.02％吐温20,1mM EDTA,20mM柠檬酸钠,1μg/ml PVP10,pH 7.5)。10μl杂交溶液含有5.75μl改进的磷酸盐缓冲液、1.5μl甲酰胺、0.25μl 200pM测试探针溶液和2.5μl光热扩增反应的相应PCR溶液，所述相应PCR溶液含有第一纳米颗粒3。第一纳米颗粒3和第二纳米颗粒22之间的连接的检测通过纳米颗粒8的光热激发而发生，如在图8a中所示。图10a显示了透射变化，其由激光器脉冲以及引起的第一纳米颗粒和第二纳米颗粒22之间的DNA的脱杂交产生，并且所述透射变化是金-DNA-金键在样品11中的存在的量度。在图10a中在左侧在部分A中显示了第一和第二样品试管24，其各自不含有原始核酸，其中所述第一样品试管24没有完成光热循环，所述第二样品试管24已经完成了35个光热循环。两个样品试管24显示出测量的高透射变化，作为金-DNA-金键的高量度的指示。在没有原始核酸12的情况下，不同数目的完成的循环因而在该情况下对测量的透射变化或对金-DNA-金键的量度没有影响；这是因为，没有原始核酸12可用于扩增，因而不会发生原始核酸12的拷贝对引物序列5的封闭。
图10a在右侧在部分B中显示了第三至第七样品试管24，其中以10pM的原始核酸12的初始浓度，在扩增反应中进行递增数目的光热循环。在这里，显而易见的是，作为金-DNA-金键的指示测量的透射变化基本上随着完成的光热循环的数目增加而下降。这表明，产生的原始核酸12的拷贝越多，完成的循环越多。其中，值得注意的是，在10pM的原始核酸12的初始浓度，在样品11中存在的第一纳米颗粒3是原始核酸12的2倍。每个第一纳米颗粒3通常携带1000-10000个引物序列5。因而，在原始核酸12的初始浓度，2000个引物序列5中的大约1个被封闭，这不会导致第一纳米颗粒3和第二纳米颗粒22之间的金-DNA-金键的显著抑制。如在图10a中所示，递增数目的光热循环对金-DNA-金键的有效抑制仅仅可能是通过原始核酸12的低初始浓度的显著扩增。
图10b显示了在一个替代性的检测方法中，在扩增反应以后的原始核酸12的拷贝的浓度。其中，首先将得自图10a的7个样品试管24的样品11在水中稀释50倍，随后进行实时PCR，这允许定量检测原始核酸的拷贝。为此目的，使用实时PCR溶液，其中10μl含有5μl 2xPhusion Blood PCR-缓冲液(包括dNTP和MgCl2；Biozym)、0.2μl Phusion Blood聚合酶、1μl SybrGreen I(10x；Roche)、1μl引物ID5 5μM和1μl引物ID8 5μM、0.8μl H2O和1μl 50倍稀释的样品11。对于实时PCR，首先，进行在98℃的变性1分钟，随后，完成40个循环，每个循环由在98℃的1秒、在66℃的5秒和在72℃的1秒组成。在66℃的每个退火阶段结束时，测量SybrGreen I的荧光。对于实时PCR，使用由Agilent Technologies生产的StratageneMx3005P。在图10b的y-轴上，显示了实时PCR的阈值循环(Ct-值)，其中原始核酸的拷贝已经首次达到预定浓度。在实时PCR开始时原始核酸12的拷贝的浓度越高，阈值循环越小。图10b中的结果证实了得自10a的结果：在给定的原始核酸12初始浓度完成的光热循环越多，在扩增反应以后原始核酸12的拷贝数目越高。
优选地，在光热变性中，仅加热样品11的小分体积，使得也可能使用非热稳定的DNA聚合酶10。在一个实施方案中，将非热稳定的克列诺片段29用作DNA聚合酶。克列诺片段29具有以下优点：它在扩增反应中更耐盐。由此，优选地可以在使用第一纳米颗粒3和第二纳米颗粒22的检测反应中选择更好的反应条件，这可以导致检测反应的更好特异性和灵敏度。除此以外，克列诺片段29会提供以下优点：在76kDA，它小于通常使用的具有95kDA的TaqDNA聚合酶。因而，在用寡核苷酸4官能化的纳米颗粒8紧邻处，克列诺片段29经历比Taq DNA聚合酶10更少的位阻。此外，克列诺片段29会提供以下优点：它的最佳延伸温度是37℃。在37℃的延伸会提供以下优点：对纳米颗粒8施加更小的热应变，因而对纳米颗粒8的稳定性具有更低的要求；同时，在潜在纳米颗粒失稳盐的应用中存在更多的灵活性。在该将克列诺片段29用于扩增的实施方案中，首先与在图1中使用的方法类似地官能化用金制成的具有60nm直径的第一纳米颗粒3。在本文中，使用的引物序列5ID9越短(如在较低退火温度和较高盐浓度)，在与原始核酸12的杂交中可以达到的特异性越高。寡核苷酸4ID9与寡核苷酸4ID2的比率达到1:9。在官能化和6个洗涤步骤以后，第一纳米颗粒3以200pM浓度存在于PBS缓冲液(20mM PBS,10mM NaCl,0.01％吐温20,0.01％叠氮化物,1mM EDTA,pH 7.5)中。在100μl样品试管中在10μl PCR混合物中进行扩增反应(1μl 10x反应缓冲液用于没有外切酶活性的克列诺片段(不含有dNTP和聚合酶；fermentas),0.2μl没有外切酶活性的克列诺片段(fermentas),1μl各自为2.5mM的dNTP(fermentas),0.2μl NaCL 5M,0.2μl MgCl2250mM,0.2μl MgSO4 250mM,1μl在200pM浓度的第一纳米颗粒3,1μl反向引物ID6 500nM,1μl作为原始核酸12的寡核苷酸ID3(在这里，原始核酸12以例如0pM、10pM或20pM的浓度存在于PCR混合物中),4.2μl水)。在这里使用的盐的量显著高于在图10的实施例中的量。用图10的DNA聚合酶10，在这些盐浓度不可能实现充分扩增。如在图7中所示，在水浴器26中在玻璃比色皿25中将样品试管24控温至37℃。在这里，37℃的温度是退火温度以及延伸温度。激光器16用于激发第一纳米颗粒3，并且是频率倍增的二极管泵送的Nd:YAg激光器(coherent VerdiV10)，其以1.5W的输出功率用在镜子扫描仪18(Cambridge technologies,Pro Series 1)后面的F-θ-透镜(Jenoptik,焦距100mm)聚焦在水浴器26中的样品试管24。镜子扫描仪18允许将焦点逐行移动穿过样品试管24(如已经在图3中所示)，并因而在光热扩增中涉及整个反应体积2。每个样品试管24，以大约5m/s的在样品试管24中的行速度，以大约5μm的距离用焦点扫描1000行。这对应于在第一样品试管24中的一个循环。随后，一个接一个地扫描所有其它样品试管24，使得每个样品试管24已经完成一个循环。在扫描第一样品试管24以后40s的等待时间以后，开始下一个循环，并且进行重复，直到每个样品试管24已经完成共计35个循环。在图11中从左至右，前3个样品试管24已经接受所述包含克列诺片段29和dNTP的PCR混合物。第4个至第6个样品试管24含有克列诺片段29，但是不含有dNTP，并且第7个至第9个样品试管24含有dNTP，但是不含有克列诺片段29。第1个、第4个和第7个样品试管24不含有原始核酸12，第2个、第5个和第8个样品试管24含有10pM原始核酸12，第3个、第6个和第9个样品试管24含有20pM原始核酸12，如在图11的简图下面的行中所示。在所有样品试管24已经完成35个循环以后，将它们从水浴器26取出。将与得自图9的那个对应的测试探针21用于分析扩增反应。为了与测试探针21杂交，使用改进的磷酸盐缓冲液(13mM PBS,200mM NaCl,0.02％吐温20,1mM EDTA,20mM柠檬酸钠,1μg/ml PVP10,pH 7.5)。10μl杂交溶液含有3.35μl改进的磷酸盐缓冲液、3.3μl甲酰胺、0.6μl NaCl5M、0.25μl 200pM测试探针溶液和2.5μl扩增以后的相应PCR溶液)。通过纳米颗粒8的光热激发，进行第一纳米颗粒3和测试探针21的连接的验证。图11显示了透射变化，其由激光器脉冲和形成的纳米颗粒8之间的DNA脱杂交产生，且其是金-DNA-金键在溶液中的存在的量度；在简图下面显示了在反应之前的原始核酸12的浓度。在图11的左侧在部分A上，显示了第1个至第3个样品试管24的结果，所述样品试管24含有PCR所需的组分克列诺片段29和dNTP。在这里，显而易见的是，随着原始核酸12的拷贝的量递增，作为金-DNA-金键的量度的指示测量的透射变化下降。在该实施方案中，非热稳定的克列诺片段29可以进行原始核酸12的扩增，即使它不会耐受高温。如在本发明的光热扩增反应中一样，样品11仅被局部地加热，克列诺片段29仅经历微小热应变，且可以在不被破坏的情况下扩增原始核酸12经历多个循环。在图11中在部分B的中央，显示了第4个至第6个不含dNTP的样品试管24的结果。在这里，在任何使用的原始核酸12的浓度，均不可检测出显著的透射变化。这意味着，没有发生扩增。在图11的右侧部分C中，显示了第7个至第9个不含克列诺片段29的样品试管24的结果。在这里，还是没有发生扩增。本实施例表明，非热稳定的克列诺片段29也可以用于执行扩增反应。
在图12所示的实施方案中，显示的光热放大取决于激光束在反应体积2中的移动。其中，在100μl样品试管24中选择0、1、5、20和50pM的原始核酸浓度，如在图12的简图下面的行中所示。在水浴器26中在玻璃比色皿25中将样品试管24控温至60℃，如在图7中所示，其中60℃是退火温度以及延伸温度。由激光器16产生光热加热，所述激光器16由频率倍增的二极管泵送的Nd:YAg激光器(coherent Verdi V10)组成，其以3W的输出功率用在镜子扫描仪18(Cambridge technologies,Pro Series 1)后面的F-θ-透镜(Jenoptik,焦距100mm)聚焦于水浴器26中的样品试管24。图12在左侧在部分A中显示了5个具有递增原始核酸12浓度的样品试管24，每个样品试管24被光热激发1秒，其中所述激光器焦点没有移动地停止在反应体积2的中央。在以此方式将第一样品试管24照射1秒以后，没有将它照射40s。这对应于第一样品试管24中的一个循环。在40s的等待时间中，剩余的样品试管24完成第一个循环。将循环重复共计35次。借助于在图10中已经显示的纳米颗粒8的光热激发，进行纳米颗粒8(其含有引物序列5)和测试探针21之间的杂交的检测。如在图12在左侧在部分A中所示，在没有移动激光器焦点的情况下，没有观察到原始核酸12的浓度对透射变化的影响。这表明，没有发生原始核酸12的显著扩增。原因是，整个反应体积2的仅小部分是在焦点中，并且仅在该分体积中的纳米颗粒8参与反应。在图12的右侧在部分B中，从左至右显示了5个具有递增原始核酸12浓度的样品试管24，所述样品试管24各自被激发1秒，其中另外，移动激光器焦点穿过反应体积2。以此方式，如在图3中已经显示的，逐行扫描整个反应体积2，且因而涉入光热反应中。在每个样品试管24中，以大约5m/s的在样品试管24中的行速度，以大约5μm的距离用焦点扫描1000行。这对应于在第一样品试管24中的一个循环。随后，一个接一个地扫描接下来的样品试管24，直到扫描所有5个样品试管24。在从扫描第一样品试管24测量的40s的等待时间以后，开始下一个循环，并且重复35次。从图12右侧部分B中显而易见，随着原始核酸12浓度增加，测量的透射变化下降。这是金-DNA-金键的下降量度的指示。仅仅通过焦点的移动和在未变化的激光器功率和辐照持续时间，随着焦点的移动发生扩增，在扩增反应中涉及样品11中的大部分纳米颗粒8。
在图13中，显示了用于执行根据本发明的方法的设备，其中光源17引导光束穿过任选的第一物镜30到偏转元件32(例如，镜子)上，并穿过任选的第二物镜31到样品试管24上。其中，将样品试管24与另一个样品试管24一起固定在可旋转单元33上，使得通过旋转单元33，可以在不同的时间照射不同的样品试管24。因而，有利的是，即使使用具有低功率的光源17，也可以实现激发存在于样品试管24中的大量纳米颗粒8。
图14显示了在它的表面上含有填充分子9和寡核苷酸4的根据本发明的纳米颗粒8的断面。常规DNA聚合酶10沿着寡核苷酸4合成互补链(短划线)。在此过程中，常规的大的DNA聚合酶10经历通过填充分子的位阻(在图14a中)。在图14b中，DNA聚合酶10经历邻近寡核苷酸4导致的位阻。在图14a和14b中的位阻可以各自导致新合成的链的过早链断裂。图14c中的克列诺片段29因为小于常规DNA聚合酶10而可以在填充分子9和寡核苷酸4之间到达，且因而可以完成新链的合成直到末端。即使克列诺片段29不可穿过填充分子到达，克列诺片段29仍然可以用它的活性中心到达更接近空间上受到阻碍的填充分子9，因而仅在以后发生新合成链的潜在链断裂。因此，较小的聚合酶能够更有效地使用接近颗粒表面的引物序列。另外，局部产生的热可以特别有效地用于在纳米颗粒表面紧邻处的变性步骤中。除此以外，显示了具有序列A'的计数器序列34。计数器序列34与纳米颗粒8上的具有序列A的寡核苷酸4互补，并且用于中和在无意中脱离纳米颗粒8的具有序列A的寡核苷酸4，使得寡核苷酸4不可充当游离引物7。
在图15的实施方案中，显示了使用纳米颗粒寡核苷酸-缀合物的光热扩增，其中用2个巯基实现在第一纳米颗粒3和引物序列5之间的共价键。为此目的，用寡核苷酸4官能化用金制成的具有60nm直径的第一纳米颗粒3(根据J.Hurst,出处同上)。其中，使用寡核苷酸4ID10(IDT Technologies,Inc.)，其与寡核苷酸ID1相比在它们的5'-末端上携带二巯基，而不是一个巯基。在官能化和6个洗涤步骤以后，第一纳米颗粒3以200pM浓度存在于PBS缓冲液(20mM PBS,10mM NaCl,0.01％吐温20,0.01％,叠氮化物1mM EDTA,pH 7.5)中。在200μl样品试管24中以10μl总体积进行扩增反应(5μl DreamTaq PCR标准混合物2x(fermentas),0.1μl NaCl 5M,0.1μl MgCl2 250mM,0.1μl MgSO4 250mM,1μl官能化的第一纳米颗粒200pM,1μl反向引物ID6 500nM,1μl分别以0或200pM的浓度溶解在含有100nM寡核苷酸4ID4(在这里，寡核苷酸4ID4用于饱和表面，例如，在反应之前贮存原始核酸12的过程中)的水中的寡核苷酸4ID3(作为要扩增的原始核酸12),1.7μl水)。如在图7中所示，在水浴器26中在玻璃比色皿25中将样品试管24控温至60℃，其为退火温度以及延伸温度。将前2个样品试管24插入水浴中作为阴性对照，但是没有被激光束命中。在第一样品试管24中将原始核酸12的初始浓度选择为0pM，在第二样品试管24中将原始核酸12的初始浓度选择为20pM。将第三和第四样品试管光热处理。用激光器16进行光热加热，所述激光器16由频率倍增的二极管泵送的Nd:YAg激光器(Coherent Verdi V10)组成，其以3W的输出功率用在镜子扫描仪18(Cambridge technologies,Pro Series 1)后面的F-θ-透镜(Jenoptik,焦距100mm)聚焦于水浴器26的样品试管24。对于每个样品试管24，以大约5m/s的在样品试管中的行速度，以大约10μm的距离用焦点扫描500行。这对应于在第三样品试管24中的一个循环。随后，扫描第四样品试管24，使得第三和第四样品试管已经完成一个循环。在扫描第三样品试管24以后40s的等待时间以后，开始下一个循环，并进行重复，直到第三和第四样品试管24已经各自完成35个循环。对于第三样品试管24，选择0pM作为原始核酸12的初始浓度，对于第四样品试管24，选择20pM作为原始核酸12的初始浓度。在第三和第四样品试管已经完成35个循环以后，从水浴器26取出所有4个样品试管24。测试探针21用于检测激光器循环和原始核酸12的浓度的影响，所述测试探针21优选地能够在选择的引物和杂交条件下与用引物序列5官能化的第一纳米颗粒3杂交，所述第一纳米颗粒3没有被在扩增反应中产生的原始核酸12的互补拷贝所封闭。这对应于如在图9中所示的测试探针21。测试探针21的产生和杂交条件已经描述在图10中。在图15中的简图显示了杂交溶液的吸收光谱，所述杂交溶液含有测试探针21以及得自光热扩增反应的相应PCR溶液，所述相应PCR溶液含有第一纳米颗粒3。在Varian Cary 50光谱仪中记录在具有3mm光程的石英比色皿中的吸收光谱。在简图中，实线显示了在将PCR溶液和光热扩增反应物混合以后立即的吸收光谱，所述光热扩增反应物含有具有测试探针21的第一纳米颗粒3；在杂交以后6分钟记录短划线，并在杂交以后12分钟记录虚线。在图15a中显示了在测试探针21与得自第一样品试管的PCR产物的纳米颗粒8的杂交过程中的光谱，所述第一样品试管在扩增反应之前不含有原始核酸12并且没有经历光热处理。当测试探针21和引物序列5之间的杂交在第一纳米颗粒3上发生时，随着递增的杂交时间观察到纳米颗粒3的等离子体共振的明显红移和拓宽。在图15b中也可以看到相当的杂交，该图显示了测试探针21与得自第二样品试管的PCR产物的纳米颗粒8的杂交，所述第二样品试管在扩增反应之前含有20pM原始核酸12且没有接受光热处理。在图15c中也可以看到相当的杂交，该图显示了测试探针21与得自第三样品试管的PCR产物的纳米颗粒8的杂交，所述第三样品试管在扩增反应之前不含有原始核酸12，但是接受光热处理。图15c中的杂交表明，引物序列5在光热处理以后仍然结合第一纳米颗粒3。仅在图15d(其显示了测试探针21与得自第四样品试管的PCR产物的纳米颗粒8的杂交，所述第四样品试管在扩增反应之前含有20pM原始核酸12且接受光热处理)中，随着递增的杂交时间几乎没有观察到吸收光谱的变化。仅在后一种情况下，在扩增反应过程中产生了足够数目的原始核酸12的拷贝，所述拷贝现在封闭第一纳米颗粒3上的引物序列5，并因而阻止了与测试探针21的杂交。本实施例表明，如果引物序列5共价地结合第一纳米颗粒3的表面上的二巯基，光热扩增反应也起作用，并且在扩增反应之后可以使用吸收光谱检测原始核酸12的拷贝的浓度。
在本说明书、权利要求和附图中公开的特征可以个别地以及以任意组合相关联，用于在不同实施方案中实现本发明。
附图标记列表
1核酸
2反应体积
3第一纳米颗粒
4寡核苷酸
5引物序列
6间隔物序列
7引物
8纳米颗粒
9填充分子
10 DNA聚合酶
11样品
12原始核酸
13补体
14正向引物
15反向引物
16激光器
17光源
18镜子扫描仪
19镜子
20第一寡核苷酸
21测试探针
22第二纳米颗粒
23第二寡核苷酸
24样品试管
25玻璃比色皿
26水浴
27第一激光器
28第二激光器
29克列诺片段
30第一物镜
31第二物镜
32偏转元件
33可旋转单元
34计数器序列
35光电二极管
序列表
<110> GNA生物解决办法有限公司
<120> 用于扩增核酸的方法
<140> DE10 2012 201 475.6
<141> 2012-02-01
<150> DE10 2012 201 475.6
<151> 2012-02-01
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<222> (1)..(65)
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagataa gataatgtag tccctggcct 60
caaag 65
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> source
<222> (1)..(25)
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 25
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atgcaaccta aggaggagag ttcctttgag gccagggact acattatctt atc 53
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gttgtcttat agcattggtg ccgatttggg 30
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gttcc 65
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<223> /分子类型="DNA" /注释="5'二巯基修饰的寡核苷酸ID10" /有机体="人工序列"
<400> 10
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagataa gataatgtag tccctggcct 60
caaag 65

Claims (17)

1.用于扩增核酸(1)的方法，其中，在反应体积(2)中的纳米颗粒(8)通过激光器(16)激发将热传递至它们的环境，其特征在于，所述纳米颗粒(8)的直径大于5nm，且所述激光器(16)激发所述纳米颗粒(8)的间隔大于10ns。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒(8)的直径小于200nm，且所述激光器(16)激发所述纳米颗粒(8)的间隔短于500μs。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过纳米颗粒(8)的激发，局部地加热纳米颗粒(8)的环境。
4.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，激发间隔选择成短于或等于临界激发时间t1＝(s1*|x|)2/D，其中s1＝100，|x|为平均纳米颗粒距离，并且D为纳米颗粒(8)之间的介质的热扩散系数。
5.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，通过聚合酶链式反应扩增所述核酸(1)。
6.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，用寡核苷酸(4)缀合所述纳米颗粒(8)。
7.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，用正向引物(14)以及反向引物(15)缀合纳米颗粒(8)和寡核苷酸(4)的一类缀合物。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在所述方法中，使用计数器序列(34)，所述计数器序列(34)可以结合这样的寡核苷酸(4)，所述寡核苷酸(4)本身已经脱离它们以前已经连接的纳米颗粒(8)。
9.根据权利要求6-8之一所述的方法，其特征在于，将填充分子(9)连接至纳米颗粒(8)。
10.根据权利要求6-9之一所述的方法，其特征在于，在所述纳米颗粒(8)上的寡核苷酸(4)含有间隔物序列(6)作为部分序列。
11.根据权利要求6-10之一所述的方法，其特征在于，通过纳米颗粒(8)的激发传递至纳米颗粒(8)的环境的热足以使纳米颗粒(8)的表面上的寡核苷酸(4)从与寡核苷酸(4)杂交的核酸(1)脱杂交。
12.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括总体加热步骤。
13.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述退火温度等于延伸温度。
14.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，在所述方法的任意一个时间，通过激发仅加热纳米颗粒(8)的一部分。
15.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，发生样品(11)相对于激发场的定向移动，使得在不同的时间，激发样品(11)的不同分体积中的纳米颗粒(8)。
16.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，在所述方法中，使用热不稳定的DNA聚合酶(10)。
17.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，使用测试探针(21)，确定扩增反应的产物的浓度。
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