DE102013022382B3

DE102013022382B3 - Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE102013022382B3
Application number: DE102013022382.2A
Authority: DE
Inventors: Lars Ullerich; Joachim Stehr; Federico Bürsgens; Cecilia Rebuffo-Scheer
Original assignee: GNA Biosolutions GmbH
Current assignee: HP Health Solutions Germany GmbH
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2013-08-01
Publication date: 2017-07-13
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: DE102013022382B9

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren (1) in einer Probe (12), wobei das Verfahren einen Vervielfältigungsschritt zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren und einen Testschritt zum Bestimmen der Konzentration der Produkte des Vervielfältigungsschritts umfasst und wobei der Testschritte nach dem Ende des Vervielfältigungsschritts beginnt, und wobei wenigstens einem Teil der Probe in dem Testschritt Stoffe zugeführt werden. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren (1) in einer Probe (12), wobei das Verfahren einen Vervielfältigungsschritt zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren und einen Testschritt zum Bestimmen der Konzentration der Produkte des Vervielfältigungsschritts umfasst, und wobei der Probe (12) in dem Testschritt keine Stoffe zugeführt werden.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren.
Hintergrund der Erfindung
Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Patentschrift US 4 683 202 offenbart ein Verfahren, mit dem mindestens eine spezifische Nukleinsäuresequenz aus einer Nukleinsäure oder aus einem Gemisch von Nukleinsäuren vervielfältigt werden kann, wobei jede Nukleinsäure aus zwei getrennten, komplementären Strängen, von gleicher oder ungleicher Länge, besteht. Das Verfahren umfasst: (a) Das Behandeln der Stränge mit zwei Primern für jede unterschiedliche spezifische Sequenz, die vervielfältigt wird, unter derartigen Bedingungen, dass für jede unterschiedliche Sequenz, die vervielfältigt wird, ein Extensionsprodukt für jeden Primer synthetisiert wird, das komplementär zu dem jeweiligen Nukleinsäurestrang ist; dabei werden besagte Primer so ausgewählt, dass sie im Wesentlichen komplementär zu unterschiedlichen Strängen jeder spezifischen Sequenz sind, so dass das Extensionsprodukt, das aus einem Primer synthetisiert wird, wenn es von seinem Komplement getrennt ist, als eine Vorlage für die Synthese des Extensionsprodukts des anderen Primers dienen kann; (b) das Trennen der Primer-Extensionsprodukte von den Vorlagen, an denen sie synthetisiert wurden, so dass einzelsträngige Moleküle entstehen; (c) das Behandeln der einzelsträngigen Moleküle aus dem Schritt (b) mit den Primern aus Schritt (a) unter derartigen Bedingungen, dass ein Primer-Extensionsprodukt synthetisiert wird, wobei jeder der Einzelstränge aus Schritt (b) als Vorlage verwendet wird. Die Schritte können nacheinander oder gleichzeitig ausgeführt werden. Zudem können die Schritte (b) und (c) wiederholt werden bis das erwünschte Ausmaß der Sequenz-Vervielfältigung erreicht ist. In dem Fall, dass in dem Verfahren die Schritte (a) und (c) mit Hilfe einer Polymerase ausgeführt werden, wird das Verfahren gewöhnlich als Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bezeichnet.
In der Internationalen Offenlegungsschrift WO 2007/143034 A1 werden Verfahren offenbart, die zur Durchführung einer PCR geeignet sein sollen. Die Verfahren können die Benutzung einer optischen Strahlenquelle zur Erhitzung in einer PCR umfassen. Die Verfahren können auch die Verwendung der Oberflächenplasmonenresonanz oder des Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers zur Überwachung einer PCR in Echtzeit einschließen. Die Verfahren können weiterhin die Immobilisierung eines Templates, Primers oder einer Polymerase auf einer Oberfläche wie Gold oder einer anderen Oberfläche, die in Bezug auf die Oberflächenplasmonenresonanz aktiv ist, umfassen.
Die Patentanmeldung US 2002/0061588 A1 offenbart Verfahren, um Nukleinsäuren lokal und direkt auf ein externes Signal ansprechbar zu machen. Das Signal wirkt nur auf eine oder mehrere spezifische lokalisierte Anteile der Nukleinsäure. Gemäß der Erfindung kann das Signal die Eigenschaften einer spezifischen Nukleinsäure und dadurch auch ihre Funktion verändern. Dementsprechend stellt die Erfindung Verfahren bereit, die die Struktur und Funktion einer Nukleinsäure in einer biologischen Probe regeln, ohne andere Bestandteile der Probe zu beeinflussen. In einer Ausführungsform transferiert ein Modulator Hitze auf eine Nukleinsäure oder einen Teil einer Nukleinsäure, was z. B. darin resultiert, dass inter- oder intramolekulare Bindungen destabilisiert werden und sich die Struktur und Stabilität der Nukleinsäure ändert. Bevorzugte Modulatoren schließen Metallnanopartikel, halbleitende Nanopartikel, magnetische Nanopartikel, Oxidnanopartikel und Chromophore ein. Es wird auch angeregt, diese Verfahren in Zusammenhang mit einer PCR zu verwenden. Insbesondere wird vorgeschlagen, eine PCR-Reaktion mit einem Modulator zu steuern.
Die Patentanmeldung US 2003/0143604 A1 betrifft die Verwendung von Nanopartikel-Detektions-Sonden zur Überwachung von Vervielfältigungsreaktionen, insbesondere PCR. Vornehmlich beschäftigt sich die Patentanmeldung mit der Verwendung von Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten, die mit einem Schutzreagens, wie bovines Serumalbumin, behandelt sind, um ein Target-Polynukleotid quantitativ und qualitativ zu detektieren. Die Patentanmeldung offenbart eine Nukleinsäure-Vervielfältigung und -Detektion unter Verwendung von Gold-Nanopartikel-Primern. In einem ersten Schritt wird dabei das Nukleinsäure-Target denaturiert in Anwesenheit der Gold-Nanopartikel, an denen Primer angebracht sind. In einem zweiten Schritt hybridisieren die Gold-Nanopartikel mit den daran angebrachten Primern an das Nukleinsäure-Target und eine Kopie der komplementären DNA-Sequenz wird erzeugt ausgehend von den Nukleinsäure-Primern, die an die Nanopartikel angebracht sind. Die Schritte eins und zwei werden wiederholt und das optische Signal, das durch das Binden von komplementären Nanopartikel-Sonden, die amplifiziert wurden, entsteht, wird gemessen.
Die nachveröffentlichte Patentanmeldung DE 10 2012 201 475.6 betrifft ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren. In diesem Verfahren übertragen Nanopartikel in einem Reaktionsvolumen durch Anregung Wärme an ihre Umgebung.
Der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Verwendung von einem oder mehreren Nanopartikeln, die jeweils mit mindestens einem Oligonukleotid konjugiert sind, zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren bereitzustellen. Der Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren bereitzustellen.
Erfindungsgemäße Lösung
In einem Aspekt der Erfindung wird die Erfindungsaufgabe durch ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren in einer Probe, gelöst, wobei das Verfahren einen Vervielfältigungsschritt zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren und einen Testschritt zum Bestimmen der Konzentration der Produkte des Vervielfältigungsschritts umfasst, wobei der Testschritte nach dem Ende des Vervielfältigungsschritts beginnt und wobei der Probe oder einem Teil der Probe in dem Testschritt Stoffe zugeführt werden. Dies schließt auch Fälle ein, in denen die Probe oder ein Teil der Probe einer anderen Zubereitung, z B. einer Testsonden enthaltenden Testzubereitung, zugeführt wird.
Es ist ein erreichbarer Vorteil dieser Ausführung der Erfindung, dass der Vervielfältigungsschritt und der Testschritt unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen stattfinden können. So können vorteilhafterweise weitere Reaktionspartner, die die Reaktionsbedingungen für den Testschritt verbessern, z. B. ein Salz, ein Puffer oder ein Detergenz, erst nach Abschluss des Vervielfältigungsschritts zugegeben werden. Vorteilhafterweise kann vermieden werden, dass bei den in der Probe befindlichen Stoffen ein Kompromiss zwischen den Erfordernissen des Vervielfältigungsschritts und des Testschritts geschlossen werden muss.
Ein Vervielfältigungsschritt ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens, in dem in der Probe vorliegende Nukleinsäuren vervielfältigt werden. Der Vervielfältigungsschritt kann mehrere Unterschritte haben, in denen jeweils eine Vervielfältigung stattfindet. Zum Beispiel kommen als ein solcher Unterschritt ein Durchlauf eines Vervielfältigungszyklus in Frage, wie er bei einer Polymerasekettenreaktion (PCR) typischerweise wiederholt durchlaufen wird. Es ist möglich, dass sich an den Testschritt, der sich an den Vervielfältigungsschritt anschließt, ein weiterer Vervielfältigungsschritt anschließt. Das Verfahren kann also einen oder mehrere Vervielfältigungsschritte umfassen.
Ein Testschritt ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens, in dem die Konzentration der Produkte des Vervielfältigungsschritts bestimmt wird. Auch dies kann in mehreren Unterschritten geschehen. Es ist möglich, dass sich an den Testschritt ein weiterer Vervielfältigungsschritt anschließt, an den sich ein weiterer Testschritt anschließt, sodass zwei Testschritte vorliegen. Das Verfahren kann also einen oder mehrere Testschritte umfassen. Die alternierende Abfolge von Vervielfältigungs- und Testschritten lässt sich fortsetzen, so dass das Verfahren viele Vervielfältigungsschritte und viele Testschritte umfasst.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Erfindungsaufgabe durch ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren in einer Probe gelöst, wobei das Verfahren einen Vervielfältigungsschritt zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren und einen Testschritt zum Bestimmen der Konzentration der Produkte des Vervielfältigungsschritts umfasst und wobei der Probe in dem Testschritt keine Stoffe zugeführt werden. Dabei kann der Testschritt auf den Vervielfältigungsschritt folgen oder sich mit dem Vervielfältigungsschritt überlappen, auch vollständig überlappen.
Mit dieser Ausführung der Erfindung ist vorteilhafterweise erreichbar, dass der Testschritt ohne weitere Arbeitsschritte und ohne weiteren Zeitverlust schon während der Vervielfältigungsreaktion oder direkt nach der Vervielfältigungsreaktion stattfindet. Reaktionspartner, die die Reaktionsbedingungen für den Testschritt verbessern, z. B. ein Salz, ein Puffer oder ein Detergenz, sind bei dieser Ausführung der Erfindung vorteilhafterweise schon während der Vervielfältigungsreaktion im Reaktionsvolumen enthalten.
Das Vervielfältigen von Nukleinsäuren erfolgt mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bei der ein Zyklus bestehend aus den Schritten Denaturierung, Annealing und Elongation wiederholt durchlaufen wird, gelöst, wobei bei wenigstens einem der Durchlaufe die Zyklusdauer t_c kürzer als 40 Sekunden ist.
Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung
Vorteilhafte Aus- und Weiterbildungen, welche einzeln oder in Kombination miteinander eingesetzt werden können, sind die Gegenstand der abhängigen Ansprüche
Bei einem bevorzugten Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren übertragen Nanopartikel in einem Reaktionsvolumen durch Anregung Wärme an ihre Umgebung
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel sind bevorzugt Partikel, die aufgrund ihrer Größe besondere optische Eigenschaften aufweisen, z. B. charakteristische Absorptions- oder Streuspektren, die so im Volumenmaterial nicht oder nicht so deutlich hervortreten. Die Nanopartikel haben vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 2 und 500 nm, besonders vorzugsweise zwischen 3 und 300 nm und ganz besonders vorzugsweise zwischen 5 und 200 nm. Bevorzugte Nanopartikel haben einen Durchmesser zwischen 7 und 150 nm. Die Nanopartikel können sphärisch sein, es kommen aber insbesondere auch nicht-globuläre Formen in Frage, z. B. elongierte Nanopartikel (Nanorods). In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung umfasst der Nanopartikel mindestens einen Halbleiter oder ein Metall, vorzugsweise ein Edelmetall, z. B. Gold oder Silber. In einer Ausführung besteht der Nanopartikel vollständig aus dem Metall, in einer anderen bildet das Metall nur einen Teil des Nanopartikels, z. B. seine Hülle. Ein bevorzugter Nanopartikel kann ein Schale-Kern-Nanopartikel sein. Ein bevorzugter Nanopartikel kann an seiner Oberfläche Poren besitzen, die von Atomen oder Molekülen mit einer durch die Eigenschaften der Poren bestimmten Größe und Ladung besetzt werden können, besonders vorzugsweise lagern sich diese Atome oder Moleküle erst dann an den Nanopartikel an, wenn dieser sich in einer Lösung befindet. Erfindungsgemäß umfasst der Nanopartikel auch die an seiner Oberfläche angelagerten Atome und Moleküle. Bevorzugte Nanopartikel eignen sich aufgrund ihrer Materialabsorption oder Plasmonenresonanz dazu, optische Energie zu absorbieren.
Bekannte Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren enthalten einen oder mehrere Schritte, in denen wenigstens Teile der Probe erhitzt werden müssen. Durch die Erfindung ist es erreichbar, dass in dem Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren nicht das ganze Reaktionsvolumen erhitzt werden muss. Es ist hingegen möglich, nur spezifische Teile des Reaktionsvolumens durch Anregung von Nanopartikeln zu erhitzen. So ist es vorteilhafterweise möglich, nur die Teile des Reaktionsvolumens zu erhitzen, die zur Vervielfältigung der Nukleinsäuren erhitzt werden müssen. Auf diese Weise können hitzeempfindliche Bestandteile der Probe geschont werden. Das lokale Erhitzen kann schneller sein als das globale Erhitzen des ganzen Reaktionsvolumens, wenn weniger Energie übertragen werden muss. Somit ist es durch die Erfindung mit Vorteil möglich, ein Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren bereitzustellen, das schneller ist und weniger Energie benötigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren läuft in einem Raum, der nachfolgend als Reaktionsvolumen bezeichnet wird, ab. Das Reaktionsvolumen kann von einem Reaktionsgefäß umgeben sein. Das Reaktionsvolumen enthält eine Probe, in der für gewöhnlich die zu vervielfältigende(n) Nukleinsäure(n) vorliegen. Die Probe kann eine Flüssigkeit umfassen, vorzugsweise Wasser. Die Flüssigkeit kann vorteilhafterweise als Suspensionsmedium und/oder Lösungsmittel, für die Originale und Komplemente und/oder andere Bestandteile der Probe dienen.
Wenn durch Anregung eines Nanopartikels Wärme an seine Umgebung übertragen wird, bedeutet das erfindungsgemäß, dass Energie auf den Nanopartikel übertragen wird, wobei der Nanopartikel durch die Übertragung der Energie seine Umgebung erhitzt. Dabei wird vorzugsweise durch die Anregung der Nanopartikel die unmittelbare Umgebung der Nanopartikel stärker erhitzt als die weitere Umgebung der Nanopartikel. Gewöhnlich werden die Nanopartikel zunächst durch Anregung erhitzt und übertragen dann Wärme an ihre Umgebung. Es ist jedoch auch denkbar, dass durch die Anregung der Nanopartikel Wärme an deren Umgebung übertragen wird, ohne dass die Nanopartikel zuerst selbst erhitzt werden. Bevorzugt ist die Umgebung der Nanopartikel ein sphärisches Volumen, das den 100fachen Durchmesser des Nanopartikels hat, der sich in seinem Mittelpunkt befindet, besonders vorzugsweise hat es den 10fachen Durchmesser, ganz besonders vorzugsweise den 4fachen Durchmesser und vorzugsweise weniger als den 2fachen Durchmesser.
Wenn wenigstens zwei Schritte der PCR bei unterschiedlichen Temperaturen ausgeführt werden, kann es notwendig sein, in dem Zyklus einen oder mehrere Heizschritte und/oder Kühlschritte vorzusehen, in denen das Reaktionsvolumen oder Teile des Reaktionsvolumens erhitzt beziehungsweise gekühlt werden. Ein Heiz- oder Kühlschritt kann vor oder nach einem der Schritte Denaturierung, Annealing und Elongation stattfinden. Dabei überlappt sich typischerweise ein Heiz- oder Kühlschritt mit dem vorangehenden und/oder dem nachfolgenden Denaturierungs-, Annealing- oder Elongationsschritt. Vorzugsweise wird das Erhitzen in dem oder mindestens einem der Heizschritte zumindest teilweise durch Anregung der Nanopartikel erreicht und ist vorzugsweise ein lokales Erhitzen.
Bei einer PCR wird ein Zyklus, der die Schritte Denaturierung, Annealing (auch als Hybridisierung bezeichnet) und Elongation umfasst, wiederholt durchlaufen, und zwar vorzugsweise in dieser Reihenfolge. Zudem ist vorzugsweise jeder dieser Schritte in allen Durchläufen gleich lang. Dies ist aber keineswegs notwendig; so kann einer der Schritte oder können mehrere der Schritte durchaus in einem Durchlauf eine kürzere Dauer als in einem anderen Durchlauf haben. Die Dauer t_c eines Durchlaufs des Zyklus wird im Folgenden als Zyklusdauer bezeichnet.
Im Folgenden wird eine zu vervielfältigende Nukleinsäure als Original bezeichnet; eine andere geläufige Bezeichnung ist Amplikon. Das Original ist ein Einzelstrang und kann in dem Reaktionsvolumen zusammen mit seinem komplementären Strang, der als Komplement bezeichnet wird, einen Doppelstrang bilden. Dabei ist nach jedem Durchlauf eine entstandene Kopie des Originals ein Original für den nächsten Durchlauf und eine entstandene Kopie des Komplements ist ein Komplement für den nächsten Durchlauf. Bei einem Durchlauf des Zyklus kann die Anzahl der Exemplare des Originals und Komplements erhöht werden. Die Zyklen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zumindest in einem Teil der Probe durchlaufen.
Der Denaturierungsschritt dient dazu, einen Nukleinsäure-Doppelstrang zu denaturieren, d. h. in ihre beiden Einzelstränge aufzutrennen. So kann in dem Denaturierungsschritt z. B. das Original von dem Komplement getrennt werden. Denaturieren wird auch als Schmelzen bezeichnet. Das Denaturieren des Nukleinsäure-Doppelstrangs wird gewöhnlich thermischinduziert, d. h. zumindest ein Teil des Nukleinsäure-Doppelstrangs oder der ganze Doppelstrang wird einer Temperatur, als Denaturierungstemperatur bezeichnet, ausgesetzt, die ein Trennen der Nukleinsäure-Doppelstränge hervorruft oder zumindest begünstigt. Die Denaturierungstemperatur muss keine feste Temperatur sein, sondern kann auch ein Temperaturintervall sein, innerhalb dessen die Temperatur im Denaturierungsschritt variiert. Die bevorzugte Denaturierungstemperatur ist einerseits so hoch gewählt, dass Nukleinsäure-Doppelstränge aufgetrennt werden können. Andererseits ist die bevorzugte Denaturierungstemperatur so niedrig gewählt, dass eine DNA-Polymerase, die sich möglicherweise ebenfalls in der Probe befindet, nichtwesentlich geschädigt wird. Ein typischer Wert für die Denaturierungstemperatur ist 95°C.
Das Reaktionsvolumen enthält ferner vorzugsweise mindestens einen, besonders vorzugsweise mindestens zwei Oligonukleotide, die als Primer bezeichnet werden. Einer dieser Primer wird als Vorwärtsprimer und ein anderer als Rückwärtsprimer bezeichnet. Der Vorwärtsprimer ist komplementär zum 3'-Ende des Originals. Der Rückwärtsprimer ist komplementär zum 3'-Ende des Komplements. Unter einem Annealing versteht man das Hybridisieren der Vorwärtsprimer mit dem Original und der Rückwärtsprimer mit dem Komplement. Der Annealingschritt dient dem Hybridisieren der Vorwärts- und Rückwärtsprimer an deren komplementäre Sequenzen im Original bzw. Komplement. Auch das Annealing wird gewöhnlich thermisch induziert, d. h. zumindest ein Teil des Originals bzw. des Komplements oder das ganze Original bzw. Komplement wird einer Temperatur, als Annealingtemperatur bezeichnet, ausgesetzt, die ein Hybridisieren der Vorwärts- und Rückwärtsprimer an deren komplementäre Sequenzen im Original bzw. Komplement hervorruft oder zumindest begünstigt. Wie die Denaturierungstemperatur kann auch die Annealingtemperatur ein Temperaturbereich sein, innerhalb dessen die Temperatur im Annealingschritt variiert. Der Annealingschritt findet typischerweise bei Temperaturen von 50°C bis 65°C statt. Die Annealingtemperatur wird dabei so gewählt, dass ein möglichst spezifisches Hybridisieren der Primer erfolgen kann.
Der Begriff Oligonukleotid umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht nur (Desoxy)-Oligo-Ribonukleide, sondern auch Oligonukleotide, die ein oder mehrere Nukleotid-Analoga mit Modifikationen an ihrem Backbone (z. B. Methylphosphonate, Phosphothioate oder Peptide Nucleic Acids [PNA], insbesondere an einem Zucker des Backbone (z. B. 2'-O-Alkylderivate, 3'- und/oder 5'-Aminoribosen, Locked Nucleic Acids [LNA], Hexitol Nucleic Acids, Morpholinos, Glycol Nucleic Acid (GNA), Threose Nucleic Acid (TNA) oder Tricyclo-DNA, vergleiche hierzu den Aufsatz von D. Renneberg und C. J. Leumann, ”Watson-Crick base-pairing properties of Tricyclo-DNA”, J. Am. Chem. Soc., 2002, Bd. 124, Seiten 5993–6002, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist) enthalten oder die Basen-Analoga enthalten, z. B. 7-Deazapurine oder Universalbasen wie Nitroindol oder modifizierte natürliche Basen wie N4-Ethyl-Cytosin. In einer Ausführung der Erfindung sind die Oligonukleotide Konjugate oder Chimären mit nicht-nukleosidischen Analoga, z. B. PNA. Die Oligonukleotide enthalten in einer Ausführung der Erfindung, an einer oder mehreren Positionen nicht-nukleosidische Einheiten wie Spacer, z. B. Hexaethylenglycol oder Cn-Spacer mit n zwischen 3 und 6. Soweit die Oligonukleotide Modifikationen enthalten, sind diese so gewählt, dass auch mit der Modifikation eine Hybridisierung mit natürlichen DNA/RNA-Analyten möglich ist. Bevorzugte Modifikationen beeinflussen das Schmelzverhalten, vorzugsweise die Schmelztemperatur, insbesondere um Hybride mit unterschiedlichen Graden der Komplementarität ihrer Basen unterscheiden zu können (Mismatch-Diskriminierung). Bevorzugte Modifikationen umfassen LNA, 8-Aza-7-Deaza-Purine, 5-Propinyl-Uracil und -Cytosin und/oder abasische Unterbrechungen oder Modifikationen im Oligonukleotid. Weitere Modifikationen im Sinne der Erfindung sind z. B. Modifikationen mit Biotin, Thiol und Fluoreszenzdonor- und Fluoreszenzakzeptormolekülen.
Hybridisieren bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung das Ausbilden eines Doppelstrangs aus zwei Einzelsträngen, die jeweils aus einer Nukleinsäure und/oder einem Oligonukleotid bestehen können. In geeigneten Reaktionsbedingungen führt das Hybridisieren in der Regel zu dem geringstmöglichen Energiezustand, der durch die Verbindung der beiden Einzelstränge erreicht werden kann. Mit anderen Worten binden unter geeigneten Bedingungen die beiden Einzelstränge vorzugsweise so aneinander, dass in Bezug auf die Sequenzen der beiden Einzelstränge die größtmögliche Komplementarität (d. h. Spezifität) hergestellt ist. Wenn eine Nukleinsäure A teilweise komplementär zu einer Nukleinsäure B ist, bedeutet dies, dass die Nukleinsäure A in einem Teil zu einem Teil der Nukleinsäure B komplementär ist.
Das Reaktionsvolumen enthält ferner vorzugsweise eine DNA-Polymerase. Die DNA-Polymerase kann in einem Elongationsschritt ausgehend von dem Vorwärtsprimer eine Kopie des Komplements synthetisieren. Ausgehend von dem Rückwärtsprimer kann die DNA-Polymerase eine Kopie des Originals synthetisieren. Durch die Synthese ist die Kopie des Komplements mit dem Original hybridisiert und die Kopie des Originals ist mit dem Komplement hybridisiert. Zum Zweck der Elongation wird die DNA-Polymerase einer Temperatur, die als Elongationstemperatur bezeichnet wird, ausgesetzt, die eine Elongation ermöglicht oder zumindest begünstigt. Auch bei der Elongationstemperatur kann es sich um einen Temperaturbereich handeln, innerhalb dessen die Temperatur im Elongationsschritt variiert. Bei der Verwendung einer Polymerase von Thermus aquaticus (Taq) wird typischerweise eine Elongationstemperatur von 72°C verwendet. In manchen Auführungsformen der PCR sind die Annealing- und die Elongationstemperaturen identisch, das heißt, beide Schritte finden bei der gleichen Temperatur statt.
Vorzugsweise werden mit der Erfindung speziell Nukleinsäuren vervielfältigt, welche ihren Ursprung aus Organismen, einschließlich Viren, haben, und dem entsprechend beispielsweise genomische DNA, Organellen-DNA, Plasmid-DNA, RNA und mRNA umfassen kann.
Die Erfindung ist besonders gut geeignet für die Vervielfältigung von Nukleinsäuren, die kürzer als 150 Basen, besonders vorzugsweise kürzer als 100 Basen, besonders vorzugsweise kürzer als 80 Basen, besonders vorzugsweise kürzer als 60 Basen sind.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die Nanopartikel mit Oligonukleotiden konjugiert. Die Nanopartikel bilden in dieser Weise Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate. Damit kann mit Vorteil erreicht werden, dass die Oligonukleotide durch Anregung der Nanopartikel spezifisch erhitzt werden, ohne dass das ganze Reaktionsvolumen erhitzt werden muss. In einer besonders bevorzugten Ausführung sind die Nanopartikel mit Primern konjugiert. Ganz besonders vorzugsweise sind die Nanopartikel mit den Vorwärts- und Rückwärtsprimern der PCR konjugiert. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind auf einer Sorte von Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten Vorwärtsprimer, jedoch keine Rückwärtsprimer und auf einer anderen Sorte Rückwärtsprimer, jedoch keine Vorwärtsprimer angebracht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist eine Sorte von Konjugaten aus Nanopartikeln und Oligonukleotiden sowohl mit Vorwärts- als auch Rückwärtsprimern konjugiert. In dieser Ausführung wird in einer PCR ausgehend von dem Vorwärtsprimer auf einem Nanopartikel ein zu dem Original komplementärer neuer DNA-Einzelstrang geschrieben. Dieser neue DNA-Einzelstrang ist mit dem Nanopartikel konjugiert, da der neue DNA-Einzelstrang den Vorwärtsprimer enthält. Unmittelbar nach dem Schreiben bildet der neue DNA-Einzelstrang mit dem Original einen Doppelstrang. In einem darauffolgenden Denaturieren wird der neue DNA-Einzelstrang vom Original getrennt. Bei einer Annealingtemperatur hybridisiert der neue DNA-Einzelstrang mit einem Rückwärtsprimer, der sich auf der Oberfläche des Nanopartikels befindet, so dass eine Schleife entsteht. Für das Hybridisieren mit dem Rückwärtsprimer desselben Nanopartikels muss nur ein kurzer Weg zurückgelegt werden. Für das Hybridisieren mit einem Rückwärtsprimer auf einem anderen Nanopartikel muss bei bevorzugten Konzentrationen von Nanopartikeln im Mittel ein längerer Weg zurückgelegt werden. Somit ist es in dieser Ausführungsform mit Vorteil erreichbar, dass das Annealing schneller stattfindet und eine PCR schneller durchlaufen werden kann.
In einer bevorzugten Ausführung ist die Wärme, die durch die Anregung der Nanopartikel auf deren Umgebung übertragen wird, ausreichend, um die Oligonukleotide auf der Oberfläche der Nanopartikel von mit den Oligonukleotiden hybridisierten Nukleinsäuren zu dehybridisieren. In dieser Ausführung sind Nanopartikel mit Oligonukleotiden konjugiert und zumindest ein Teil dieser Oligonukleotide sind mit zumindest teilweise komplementären Nukleinsäuren hybridisiert. Durch die Anregung der Nanopartikel wird thermische Energie an das umliegende Wasser übertragen, so dass bevorzugt die Temperatur des Wassers um die Nanopartikel ausreicht, um die Oligonukleotide von den mit ihnen verbundenen Nukleinsäuren zu denaturieren.
Bei der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise ein oder mehrere Nanopartikel, die jeweils mit mindestens einem Oligonukleotid konjugiert sind, zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren verwendet, wobei eines oder mehrere der Oligonukleotide wenigstens eine Primersequenz aufweisen sowie einen weiteren Abschnitt, der sich von dem nanopartikelnahen Ende der Primersequenz in Richtung des Nanopartikels erstreckt, und wobei der weitere Abschnitt wenigstens eine abasische Modifikation aufweist. Es ist ein erreichbarer Vorteil dieser Ausführung der Erfindung, dass in dem Fall, dass die Primersequenz, typischerweise aber nicht notwendigerweise nach ihrer Elongation, als Vorlage für die Synthese eines komplementären Strangs mittels einer DNA-Polymerase dient, eine Aktivität der Polymeralse jenseits der abasischen Modifikation teilweise oder sogar vollständig unterbunden wird. Mit anderen Worten, es kann vermieden werden, dass ein Teil des Abschnitts, der sich von der Primersequenz aus gesehen jenseits der abasischen Modifikation befindet, von der DNA-Polymerase als Vorlage für die Synthese eines komplementären Strangs herangezogen wird.
Mithin kann durch diese Ausführung der Erfindung einer unnötigen Länge des Syntheseprodukts entgegengewirkt werden. Dadurch kann z. B. Problemen entgegengewirkt werden, die darauf zurückzuführen sind, dass ein unnötig langer komplementärer Strang eine erhöhte Schmelztemperatur für die Dehybridisierung von dem mit dem Nanopartikel konjugierten Oligonukleotiden benötigen könnte. Auch kann z. B. Problemen entgegengewirkt werden, die dadurch entstehen, dass der unnötig lange komplementäre Strang in folgenden Hybridisierungsschritten unnötig unspezifisch hybridisiert und dadurch die Spezifität des Vervielfältigungsverfahrens leidet.
Eine abasische Modifikation im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Abschnitt des Oligonukleotids, in welchem die Abfolge von Nukleotiden durch die Einführung von einem oder mehreren Molekülen, welche keine Nukleotide darstellen, unterbrochen ist; dergestalt, dass eine Polymerase die Synthese eines ansonsten vollständig oder teilweise hybridisierten, komplementären Oligonukleotids auf Höhe dieses Abschnitts vollständig oder teilweise abbricht, da an diesem Abschnitt keine hinreichende Basenkomplementarität gegeben ist.
Die bevorzugte abasische Modifikation ist an dem der Primersequenz zugewandten Ende des weiteren Abschnitts angrenzend an die Primersequenz angeordnet. Durch diese Ausführung der Erfindung kann vorteilhafterweise eine Elongation eines komplementären Strangs über den Primer hinaus teilweise oder sogar vollständig unterbunden werden.
Die bevorzugte abasische Modifikation ist 3'-seitig bezüglich der Primersequenz angeordnet. Mit dieser Ausführung der Erfindung ist vorteilhafterweise eine Elongation der Primersequenz in 3'-Richtung über die abasische Modifikation hinaus teilweise oder sogar vollständig unterbunden werden.
Die abasische Modifikation ist vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die umfasst: 1', 2'-Dideoxyribose (dSpacer), Triethylen-Glycol (Spacer9) und Hexa-Ethylenglycol (Spacer18).
Soweit der weitere Abschnitt mehrere abasische Modifikationen aufweist, sind diese vorzugsweise einander unmittelbar benachbart angeordnet. Soweit der weitere Abschnitt mehrere abasische Modifikation aufweist, ist vorzugsweise jede abasische Modifikation aus der Gruppe 1', 2'-Dideoxyribose, Triethylen-Glycol und Hexa-Ethylenglycol ausgewählt.
Der weitere Abschnitt hat vorzugsweise zumindest unter anderem die Funktion eines Abstandhalters (im Folgenden auch als Spacersequenz und Spacer bezeichnet), der einen Abstand zwischen der Primersequenz und dem Nanopartikel herstellt oder einen solchen Abstand vergrößert. Mit anderen Worten, die Spacersequenz dient dem übrigen Teil des Oligonukleotids als Abstandhalter. Dadurch, dass die Primersequenz durch die Spacersequenz von den Nanopartikeln weiter beabstandet ist, können vorteilhafterweise die zu vervielfältigenden Nukleinsäuren und die DNA-Polymerasen einen besseren Zugang zu den Primersequenzen finden. In einer bevorzugten Ausführung bleiben nach ihrer Synthese die Kopien des Originals und des Komplements über die Spacersequenz auf der Oberfläche der Nanopartikel befestigt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Spacersequenz eine Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuklease auf, so dass die synthetisierten Kopien von den Nanopartikeln abgeschnitten werden können. Dies geschieht bevorzugt nachdem die Vervielfältigung abgeschlossen ist, kann aber auch während der Vervielfältigung geschehen. So ist es mit der Erfindung möglich, Kopien von Nukleinsäuren herzustellen, die frei in der Probe vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind auf den Nanopartikeln Füllmoleküle aufgebracht. Die Füllmoleküle verhindern die unerwünschte Aggregation der Nanopartikel in der Probe. Damit dienen die Füllmoleküle mit Vorteil der Stabilisierung der Nanopartikel. Durch die Füllmoleküle kann die Ladung der Nanopartikel moduliert werden. Dadurch kann die Salzkonzentration, die sich in der Umgebung der Nanopartikel befindet so angepasst werden, dass die DNA-Polymerase möglichst schnell synthetisieren kann und das Verfahren mit Vorteil schnell durchgeführt werden kann. Die Füllmoleküle können aus Oligonukleotiden bestehen, die jedoch keine Primer sind und bevorzugt kürzer als die Primer sind. Die Füllmoleküle können auch z. B. aus Polymeren, wie z. B. Polyethylenglykol, bestehen. Die Füllmoleküle erlauben es in einer bevorzugten Ausführungsform, die Anzahl der Primer auf den Nanopartikeln zu verringern und stattdessen mehr Füllsequenzen zu verwenden, ohne dass wesentliche Einbußen an der Effizienz des Verfahrens verursacht werden. In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens sind die Spacersequenzen mindestens genauso lang wie die Füllmoleküle. Dadurch kann vorteilhafterweise vermieden werden, dass die Primersequenzen durch die Füllmoleküle verdeckt werden.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die Nanopartikel so mit den Oligonukleotiden verbunden, dass kovalente Bindungen mit mehr als einem Thiol zwischen Olionukleotiden und Nanopartikeln vorhanden sind. PCR-Puffer enthalten in der Regel Dithiothreitol, das die Thiolbindung zwischen einem Gold-Nanopartikel und einem Oligonukleotid destabilisiert, und das insbesondere bei thermischer Belastung, wie z. B. während des Denaturierens, dazu führen kann, dass sich Oligonukleotide von den Nanopartikeln lösen. Kovalente Bindungen mit mehr als einem Thiol zwischen Oligonukleotid und Nanopartikel können das Ablösend der Oligonukleotide verringern und so die Effizienz der PCR erhöhen.
Bei einer Ausführung der der vorliegenden Erfindung umfasst das Vervielfältigen von Nukleinsäuren in einer Probe einen Vervielfältigungsschritt zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren und einen Testschritt zum Bestimmen der Konzentration der Produkte des Vervielfältigungsschritts, wobei der Testschritt nach dem Ende des Vervielfältigungsschritts beginnt und wobei der Probe in dem Testschritt Stoffe zugeführt werden.
Bei einer anderen Ausführung der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren einen Vervielfältigungsschritt zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren und einen Testschritt zum Bestimmen der Konzentration der Produkte des Vervielfältigungsschritts, wobei der Probe in dem Testschritt keine Stoffe zugeführt werden. Dabei kann der Testschritt auf den Vervielfältigungsschritt folgen oder sich mit dem Vervielfältigungsschritt überlappen, auch vollständig überlappen. Vorzugsweise sind die Salzbedingungen und/oder der Puffer, besonders vorzugsweise alle chemischen Reaktionsbedingungen im Vervielfältigungsschritt und im Testschritt gleich.
Bei der Erfindung ist in einer bevorzugten Ausführung eine globale Temperatur der Probe während des Testschritts unterschiedlich zu einer globalen Temperatur des Vervielfältigungsschritts. Mit anderen Worten, zu wenigstens einem Zeitpunkt des Testschritts ist die globale Temperatur der Probe unterschiedlich zu der globalen Temperatur der Probe zu wenigstens einem Zeitpunkt des Vervielfältigungsschritts. Besonders vorzugsweise ist eine globale Temperatur der Probe während des Testschritts, besonders vorzugsweise am Anfang des Testschritts, besonders vorzugsweise während der überwiegenden Zeit des Testschritts, besonders vorzugsweise während des gesamten Testschritts unterschiedlich zu einer globalen Temperatur während des Vervielfältigungsschritts, besonders vorzugsweise am Ende des Vervielfältigungsschritts, besonders vorzugsweise während der überwiegenden Zeit des Vervielfältigungsschritts, besonders vorzugsweise während des gesamten Vervielfältigungsschritts.
Es ist ein erreichbarer Vorteil dieser Ausführung der Erfindung, dass der Vervielfältigungsschritt und der Testschritt unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen stattfinden können. Vorteilhafterweise kann vermieden werden, dass bei der globalen Temperatur ein Kompromiss zwischen den Erfordernissen des Vervielfältigungsschritts und des Testschritts geschlossen werden muss.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die globale Temperatur die durchschnittliche Temperatur der Probe, in der der Vervielfältigungsschritt und der Testschritt durchgeführt werden. Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der „überwiegende” Teil der Zeit eines Schritts mehr als 50% der Dauer dieses Schritts.
In einer Ausführung der Erfindung ist „Unterschiedlich zu” speziell „höher als”, in einer anderen speziell „niedriger als”. In einer bevorzugten Ausführung bedeutet „unterschiedlich”, dass sich die Temperaturen um mehr als 1 Grad, besonders vorzugsweise mehr als 2 Grad, besonders vorzugsweise mehr als 5 Grad, besonders vorzugsweise mehr als 10 Grad, besonders vorzugsweise mehr als 20 Grad, besonders vorzugsweise mehr als 40 Grad unterscheiden.
Bei der Erfindung ist in einer bevorzugten Ausführung eine globale Temperatur der Probe während des Testschritts im Wesentlichen gleich zu einer globalen Temperatur des Vervielfältigungsschritts. Mit anderen Worten, zu wenigstens einem Zeitpunkt des Testschritts ist die globale Temperatur der Probe im Wesentlichen gleich zu der globalen Temperatur der Probe zu wenigstens einem Zeitpunkt des Vervielfältigungsschritts. Besonders vorzugsweise ist eine globale Temperatur der Probe während des Testschritts, besonders vorzugsweise am Anfang des Testschritts, besonders vorzugsweise während der überwiegenden Zeit des Testschritts, besonders vorzugsweise während des gesamten Testschritts im Wesentlichen gleich zu einer globalen Temperatur während des Vervielfältigungsschritts, besonders vorzugsweise am Ende des Vervielfältigungsschritts, besonders vorzugsweise während der überwiegenden Zeit des Vervielfältigungsschritts, besonders vorzugsweise während des gesamten Vervielfältigungsschritts.
In einer bevorzugten Ausführung bedeutet „gleich”, dass sich die Temperaturen um weniger als 20 Grad, besonders vorzugsweise weniger als 10 Grad, besonders vorzugsweise weniger als 5 Grad, besonders vorzugsweise weniger als 5 Grad, besonders vorzugsweise weniger als 2 Grad, besonders vorzugsweise weniger als 1 Grad unterscheiden.
Vorzugsweise werden in dem Testschritt zur Bestimmen der Konzentration der Produkte des Vervielfältigungsschritts Testsonden verwendet, die einen Nanopartikel aufweisen. Die Testsonden werden der Probe in einer Ausführung der Erfindung im Testschritt zugeführt. In einer anderen Ausführung der Erfindung werden die Testsonden der Probe vor dem Testschritt, vorzugsweise vor oder während des Vervielfältigungsschritts, zugeführt.
In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens weisen die Oligonukleotide auf den Nanopartikeln der Testsonden als Teilsequenz eine Spacersequenz auf. Die Spacersequenz liegt dabei auf der dem Nanopartikel zugewandten Seite des jeweiligen Oligonukleotids. So dient die Spacersequenz dem übrigen Teil des Oligonukleotids als Abstandhalter. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein Oligonukleotid sowohl eine Teilsequenz, die als Testsequenz bezeichnet wird, als auch eine Teilsequenz, die eine Spacersequenz ist. In einer bevorzugten Ausführung sind auf den Nanopartikeln Füllmoleküle aufgebracht. Die Testsequenzen können mit Produkten der Vervielfältigungsreaktion hybridisieren. Dabei sind die Testsequenzen vorzugsweise komplementär zu den Produkten der Vervielfältigungsreaktion.
In einer bevorzugten Ausführung tragen die Testsequenzen am 3' Ende eine oder mehrere terminierende Modifikationen wie z. B. Dideoxycytidin (ddC). Diese Modifizierungen kann vorteilhafterweise die 3'-Extension der Testsequenz durch die Polymerase verhindern und so verhindern, dass auch die Testsequenzen als Primer dienen können.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind Nanopartikel, die der Vervielfältigung dienen, (nachfolgend auch als erste Nanopartikel bezeichnet, um sie von den Nanopartikeln der Testsonden, nachfolgend auch als zweite Nanopartikel bezeichnet, zu unterscheiden) mit Vorwärtsprimern konjugiert. In Anwesenheit des Originals und einer DNA-Polymerase werden die Vorwärtsprimer verlängert, so dass Komplemente entstehen, die über die Vorwärtsprimer an die ersten Nanopartikel gebunden sind. Ein Komplement besteht dabei aus dem Vorwärtsprimer und einer Verlängerungssequenz, die durch das Verlängern des Vorwärtsprimers entsteht. In einem optionalen Zwischenschritt werden die Originale von den Komplementen durch lokales oder globales Erhitzen denaturiert. Die ersten Nanopartikel werden dann mit Testsonden zusammengeführt, wenn dies nicht schon zuvor geschehen ist. Die Testsequenzen der Testsonden sind komplementär zu den Verlängerungssequenzen, so dass die Testsonden über Testsequenzen an die verlängerten Vorwärtsprimer auf den ersten Nanopartikeln binden können. Bei geeigneten Reaktionsbedingungen kommt die Verbindung der ersten Nanopartikel mit den Testsonden in dem Ausmaß zustande, in dem auch nanopartikelgebundene Komplemente vorliegen. Das bedeutet, dass wenn keine Verlängerungssequenzen entstehen, auch keine Verbindung von Testsonden und ersten Nanopartikeln entsteht. Besonders vorzugsweise werden die Reaktionsbedingungen der erfindungsgemäßen Vervielfältigung und des Nachweises durch Testsonden so gewählt, dass das Ausmaß der Verbindung von ersten Nanopartikeln mit Testsonden darüber Rückschlüsse zulässt, welche Konzentration des Originals vor der Vervielfältigung in der Probe vorlag. Durch die Verbindung der ersten Nanopartikel mit den Testsonden kann eine messbare Veränderung entstehen, z. B. eine Rotverschiebung oder Verbreiterung der Plasmonenresonanz im Extinktionsspektrum. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung ist die messbare Veränderung, die durch die Verbindung von Testsonden und ersten Nanopartikeln entsteht, proportional zur Konzentration des Originals in der Probe vor der Vervielfältigung. So kann mit Vorteil mit einfachen Mitteln ein Konzentrationsnachweis erfolgen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung umfasst das Verfahren Vorwärtsprimer, die mit ersten Nanopartikeln konjugiert sind, und freie, also nicht nanopartikelgebundene, Rückwärtsprimer. In einem ersten Schritt werden die Vorwärtsprimer in Anwesenheit des Originals durch eine DNA-Polymerase zu nanopartikelgebundenen Komplementen verlängert. In einem zweiten Schritt wird, ausgehend von dem freien Rückwärtsprimer, der an das nanopartikelgebundene Komplement bindet, eine Kopie des Originals synthetisiert. Danach werden die ersten Nanopartikel mit Testsonden zusammengeführt, wenn dies nicht schon zuvor geschehen ist. Die Testsequenzen sind in dieser Ausführung komplementär zu den Vorwärtsprimern. Wenn die Vorwärtsprimer nicht verlängert wurden, dann können die Testsonden gut an die ersten Nanopartikel binden. Wenn die Vorwärtsprimer verlängert wurden, dann wird die Bindung von Testsequenzen an Vorwärtsprimern durch sterische Hinderung behindert. Wenn eine neu synthetisierte Kopie des Originals mit dem verlängerten Vorwärtsprimer hybridisiert ist, so wird die Bindung der Testsequenz an den verlängerten Vorwärtsprimer verhindert. In dieser Weise sinkt das Ausmaß der Verbindung zwischen ersten Nanopartikeln und Testsonden in dem Ausmaß in dem Produkte der Vervielfältigungsreaktion, das heißt Komplemente und Kopien des Originals, synthetisiert wurden. Bei geeigneter Wahl der Reaktionsbedingungen kann so ein Konzentrationsnachweis des Originals in der Probe durchgeführt werden, so dass eine messbare Veränderung um so geringer ist, je mehr Original in der Probe vor der Vervielfältigung vorhanden war. Die messbare Veränderung kann dabei z. B. eine Rotverschiebung oder Verbreiterung der Plasmonenresonanz im Extinktionsspektrum sein. So kann mit Vorteil ein einfacher Test gestaltet werden, der die Bestimmungen von Konzentrationen spezifischer Nukleinsäuren zulässt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung sind die Rückwärtsprimer ebenfalls mit Nanopartikeln konjugiert. In einer besonders bevorzugten Ausführung sind die Rückwärtsprimer hierbei ebenfalls mit den ersten Nanopartikeln konjugiert, die auch mit den Vorwärtsprimern konjugiert sind.
Vorzugsweise weisen die Nanopartikel der Testsonden eine andere Größe als die Nanopartikel auf, die im Vervielfältigungsschritt zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren verwendet werden. Besonders vorzugsweise sind die Nanopartikel der Testsonden kleiner als die Nanopartikel, die im Vervielfältigungsschritt zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren verwendet werden. Besonders vorzugsweise beträgt das Volumen der Nanopartikel der Testsonden weniger als 50%, besonders vorzugsweise weniger als 25%, besonders vorzugsweise weniger als 12,5% besonders vorzugsweise weniger als 6%, besonders vorzugsweise weniger als 3%, besonders vorzugsweise weniger als 1%, besonders vorzugsweise weniger als 0,1% des Volumens der Nanopartikel, die im Vervielfältigungsschritt zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren verwendet werden.
Durch diese Ausführung der Erfindung kann um die Nanopartikel der Testsonden während der Vervielfältigungsreaktion eine andere lokale Temperatur erreicht werden als um die Nanopartikel, die zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren verwendet werden. Beispielsweise kann mit Testsonden, die kleiner als die Nanopartikel sind, die zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren verwendet werden, erreicht werden, dass zwar die ersten Nanopartikel eine ausreichende Temperatur für die Vervielfältigungsreaktion erreichen, aber die Testsonden eine geringere Temperatur erreichen. Dadurch ist erreichbar, dass die Testsonden weniger thermisch belastet werden. Es ist auch erreichbar, dass auf den Testsonden keine Vervielfältigungsreaktion stattfinden kann. Letzteres ist insbesondere bei Ausführungen der Erfindung vorteilhaft, bei denen die Testsonden sich während der Vervielfältigungsreaktion in der Probe befinden.
Bei einer Ausführung der Erfindung übertragen Nanopartikel in einem Reaktionsvolumen durch Anregung Wärme an ihre Umgebung.
Bevorzugt wird durch die Anregung der Nanopartikel die Umgebung der Nanopartikel lokal erhitzt, da besonders schnelle Temperaturänderungen vor allem dann möglich sind, wenn das erhitzte Volumen nur einen kleinen Bruchteil des Gesamtvolumens ausmacht. Zum einen kann schon mit einem kleinen Energie-Eintrag durch Bestrahlung eine hohe Temperaturdifferenz erzeugt werden. Zum anderen ist eine sehr schnelle Abkühlung des erwärmten Volumens möglich, wenn ein ausreichend großes kaltes Temperatur-Reservoir im bestrahlten Volumen vorhanden ist, um nach der Bestrahlung die Nanopartikel und ihre Umgebung wieder abzukühlen. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die Nanopartikel hinreichend stark (um den gewünschten Temperaturhub zu erreichen) und hinreichend kurz (damit die Wärme lokalisiert bleibt) bestrahlt werden. Im dem Fall, dass die Vervielfältigung mittels einer Polymerase, z. B. einer DNA-Polymerase, durchgeführt wird, ist es durch die lokale Erhitzung ist es möglich, die Polymerasen einer geringeren Hitze auszusetzen.
Eine lokale Erhitzung im Sinne der vorliegenden Erfindung liegt dann vor, wenn die Dauer der Anregung im jeweils bestrahlten Volumen (z. B. im Laserfokus) t kürzer oder vergleichbar kurz einer kritischen Anregungsdauer t1 gewählt wird. Hierbei ist t1 gegeben durch die Zeit, die die Wärme benötigt, um bei mittlerem Nanopartikelabstand von einem Nanopartikel zum nächsten zu diffundieren, multipliziert mit einem Skalierungsfaktor s1, und zwar ist bei einem mittleren Nanopartikelabstand |x| und einer Temperaturleitfähigkeit D des Mediums zwischen den Nanopartikeln t1 geben durch t1 = (s1·|x|)²/D, wobei die Temperaturleitfähigkeit D typischerweise in wässriger Lösung einen Wert von D = 10^–7 m²/s hat.
Der Skalierungsfaktor s1 ist ein Maß dafür, wie weit sich die Wärmefront eines Partikels während der Anregungsdauer ausbreitet. Die Temperaturerhöhung durch einen angeregten Nanopartikel im Abstand von einigen Nanopartikeldurchmessern ist nur ein sehr kleiner Bruchteil der maximalen Temperaturerhöhung auf der Partikeloberfläche. In einer Ausführung der Erfindung wird ein Überlapp der Wärmefronten von einigen Nanopartikeln zugelassen in dem Sinne, dass zur Definition der kritischen Anregungsdauer t1 anhand der oben angegebenen Formel ein Skalierungsfaktor s1 größer als 1 verwendet wird. In einer anderen Ausführung der Erfindung wird kein Überlapp der Wärmefronten während der Anregungsdauer zugelassen (entspricht einer stark lokalisierten Erwärmung) in dem Sinne, dass zur Definition der kritischen Anregungsdauer t1 anhand der oben angegebenen Formel ein Skalierungsfaktor s1 kleiner oder gleich 1 verwendet wird. Für die Definition der lokalen Erhitzung ist vorzugsweise s1 = 100, vorzugsweise s1 = 30 vorzugsweise s1 = 10, vorzugsweise s1 = 7, vorzugsweise s1 = 3 und ganz besonders vorzugsweise s1 = 1, vorzugsweise s1 = 0,7, vorzugsweise s1 = 0,3.
Werte für s1 > 1 können u. a. beispielsweise in solchen Fällen vorteilhaft sein, in denen das bestrahlte Volumen ein hohes Seitenverhältnis aufweist (etwa im Fokus eines moderat fokussierten Laserstrahls), so dass sich vergleichsweise viele Nanopartikel an der Oberfläche des bestrahlten Volumens befinden und sich daher weniger beheizte Nanopartikel in ihrer Umgebung befinden, und ein starker Wärmeabfluss aus dem bestrahlten Volumen heraus stattfindet, so dass der Erwärmungsbeitrag der weiter entfernten Nachbarn länger vernachlässigbar bleibt.
Da heißt, dass sich beispielsweise bei einer Nanopartikelkonzentration von 1 nM ein mittlerer Nanopartikelabstand von |x| = 1,2 Mikrometern ergibt, so dass ein erfindungsgemäßes lokales Erhitzen vorliegt, sofern die Anregungsdauer weniger als t1 = 14 Mikrosekunden beträgt (der Skalierungsfaktor ist hier s1 = 1 gewählt).
Es ist davon auszugehen, dass wenn t > t1 gewählt wird, die Wärme, die von den Nanopartikeln abgegeben wird, durch Diffusion während der Bestrahlung folglich eine Strecke zurücklegen kann, die größer ist als der mittlere Nanopartikelabstand, und dies im Ergebnis zu einer Überlagerung der Wärmefronten vieler Nanopartikel führt, so dass im gesamten Volumen zwischen den Nanopartikeln eine Temperaturerhöhung stattfindet; die Temperaturerhöhung dürfte im bestrahlten Volumen räumlich umso homogener werden, je länger geheizt wird, da nicht nur die Beiträge der nächsten Nanopartikel, sondern auch weiter entfernter Nachbarn in die Temperaturverteilung um ein Nanopartikel herum eingeht. Wenn das Reaktionsvolumen mit einer von den Nanopartikeln absorbierten Strahlung länger als t1 bestrahlt wird, wird daher die Erhitzung als global bezeichnet. Ein erfindungsgemäß globales Erhitzen kann z. B. auch dadurch stattfinden, dass das Reaktionsvolumen von außen mit einem Peltier-Element oder einer Widerstandsheizung geheizt wird. Das globale Erhitzen kann auch dadurch erfolgen, dass z. B. das Reaktionsvolumen mit einer Strahlung bestrahlt wird, die von dem Wasser in der Probe stärker als oder ähnlich stark wie von den Nanopartikeln absorbiert wird.
Temperaturerhöhung bedeutet hierbei die Differenz zwischen der Temperatur an einem Ort zum Beobachtungszeitpunkt unmittelbar nach der Anregung und der Temperatur am gleichen Ort zum Zeitpunkt unmittelbar vor der Anregung. Globales Erhitzen und lokales Erhitzen kann auch gleichzeitig durchgeführt werden.
Die Anregung der Nanopartikel geschieht vorzugsweise durch ein Wechselfeld, besonders vorzugsweise durch ein elektromagnetisches Wechselfeld, ganz besonders vorzugsweise optisch. Vorzugsweise geschieht die Anregung im mit Licht Bereich vom fernen Infrarot bis zum fernen Ultraviolett (in einem Bereich von 100 nm bis 30 μm Wellenlänge), besonders vorzugsweise im Bereich vom nahen Infrarot bis zum nahen Ultraviolett (in einem Bereich von 200 nm bis 3 μm Wellenlänge), ganz besonders bevorzugt durch sichtbares Licht (in einem Bereich von 400 nm bis 800 nm Wellenlänge). Dies kann gegenüber dem herkömmlichen globalen Erhitzen des Reaktionsgefäßes von außen den Vorteil bieten, dass nicht die thermisch isolierende Wand des Reaktionsgefäßes überwunden werden muss, da die Energie direkt auf die Nanopartikel übertragen wird. So kann eine schnellere Heizung des gewünschten Anteils der Probe erreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Nanopartikel durch einen Laser angeregt. Besonders vorzugsweise hat das Laserlicht eine Frequenz, die die Oberflächenplasmonenresonanz der Nanopartikel anregt. Der Laser kann das Licht gepulst oder kontinuierlich zur Verfügung stellen. Wenn der Laser gepulst ist, dann werden vorzugsweise Nanosekunden-Laser verwendet. Der Laser kann z. B. ein Gaslaser, ein Diodenlaser oder ein diodengepumpter Festkörperlaser sein.
Der Tastgrad ist das Verhältnis von Zeitintervall der Anregung zu Dauer eines PCR-Zyklus. Der Tastgrad wird vorzugsweise so groß gewählt, dass die Anregung zu einem ausreichenden Denaturieren der DNA-Doppelstränge durch lokales Erhitzen führt. Zugleich wird der Tastgrad vorzugsweise so gewählt, dass die mittlere Temperaturerhöhung der gesamten Probe ausreichend klein gehalten wird, so dass keine störenden Einflüsse auf Hybridisierung, Elongation und Denaturieren auftreten. Vorzugsweise beträgt der Tastgrad für das bestrahlte Volumen weniger als 50%, besonders vorzugsweise weniger als 20% und ganz besonders vorzugsweise weniger als 1%. Der Tastgrad beträgt im bestrahlten Volumen geeigneterweise mehr als 10^–12, vorzugsweise mehr als 10^–10, besonders vorzugsweise mehr als 10^–9 und ganz besonders vorzugsweise mehr als 10^–8.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Leistungsdichte die optische Leistung pro Fläche des in die Probe einfallenden Lichts; sofern es sich um eine gepulste Lichtquelle handelt ist die Spitzenleistung maßgeblich. Die Leistungsdichte, mit der die Nanopartikel angeregt werden, beträgt vorzugsweise bei mindestens einem Durchlauf des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 10 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 20 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 40 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 80 Durchläufen des Zyklus und ganz besonders vorzugsweise bei mindestens 160 Durchläufen des Zyklus mehr als 10 W/mm^2,, besonders vorzugsweise mehr als 50 W/mm², besonders vorzugsweise mehr als 100 W/mm², besonders vorzugsweise mehr als 200 W/mm², besonders vorzugsweise mehr als 300 W/mm² und ganz besonders vorzugsweise mehr als 400 W/mm². Mit dieser Ausführung der Erfindung ist vorteilhafterweise erreichbar, dass die Nanopartikel durch die Anregung ausreichend erwärmt werden.
Die Leistungsdichte, mit denen die Nanopartikel angeregt werden, beträgt vorzugsweise weniger als 20.000 kW/mm², besonders vorzugsweise bei mindestens einem Durchlauf des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 10 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 20 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 40 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 80 Durchläufen des Zyklus und ganz besonders vorzugsweise bei mindestens 160 Durchläufen des Zyklus weniger als 10.000 kW/mm^2,, besonders vorzugsweise weniger als 5.000 kW/mm², besonders vorzugsweise weniger als 3.000 kW/mm², besonders vorzugsweise weniger als 1.000 W/mm², besonders vorzugsweise weniger als 500 kW/mm², besonders vorzugsweise weniger als 300 kW/mm², besonders vorzugsweise weniger als 150 kW/mm² und ganz besonders vorzugsweise weniger als 80 kW/mm². Mit dieser Ausführung der Erfindung kann vorteilhafterweise einer Beschädigung der Nanopartikel oder der daran gebundenen DNA entgegengewirkt oder diese verhindert werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird die Energie des Lichts durch die Materialabsorption der Nanopartikel auf diese übertragen. Das Licht, das zur Anregung der Nanopartikel verwendet wird, kann auch z. B. von einem thermischen Strahler, z. B. einer Blitzlampe, stammen. In einer weiteren bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Nanopartikel durch ein elektromagnetisches Wechselfeld oder elektromagnetische Wellen angeregt, die Wirbelströme in den Nanopartikeln erzeugen. Es ist bei geeigneter Gestaltung der Nanopartikel auch möglich, die Nanopartikel mit Ultraschall anzuregen
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Einwirkdauer t_A die Gesamtdauer, in der eine Energiequelle zum Zweck einer Denaturierung, z. B. während des Durchlaufs des Zyklus der PCR, mit einer zum Denaturieren geeigneten Leistung auf einen Punkt in der Probe einwirkt, um eine Erwärmung in der Probe hervorzurufen.
Die Energiequelle überträgt während der gesamten Zeit t_A eine Leistung, die zur Denaturierung geeignet ist, auf den besagten Punkt. Eine Energiequelle in Form eines Lasers könnte zum Beispiel bei einer höheren Leistung zur Denaturierung und zu einer anschließenden Extinktionsmessung bei geringerer Leistung verwendet werden. In diesem Fall ist t_A lediglich die Zeit, in die der Laser die höhere, zur Denaturierung geeignete Leistung auf den Punkt überträgt.
Falls mehrere Energiequellen zur Denaturierung verwendet werden, so bezieht sich t_A vorzugsweise auf die Zeit, in der alle Energiequellen zur Denaturierung zugleich auf den Punkt einwirken. Bei der Aktivierung mehrerer Energiequellen kann häufig erst das zeitgleiche Einwirken zur Denaturierung führen.
Der besagte Punkt ist dabei innerhalb des Teils der Probe, in der das Verfahren durchgeführt wird, so bestimmt, dass t_A den größten möglichen Wert annimmt. Wenn die Erwärmung also beispielsweise von einem feststehenden Peltier-Element hervorgerufen wird, ist t_A die Gesamtdauer, in der Wärme vom Peltier-Element in diesem Zyklus zu diesem Punkt fließt (typischerweise etwa die Einschaltdauer während des Heizschritts; in jedem Fall kürzer als die Zyklendauer). Wenn die Erwärmung durch einen Lichtstrahl mit dem Durchmesser d hervorgerufen wird, der mit einer Geschwindigkeit v durch das Probenvolumen geführt („gescannt”) wird, ist t_A die Zeitdauer d / v während der der Lichtstrahl hierbei auf einen Punkt in der Probe einwirkt. Wenn die Erwärmung durch eine gepulste Lichtquelle hervorgerufen wird, deren Lichtstrahl während der Pulsdauer nicht relativ zur Probe bewegt wird, ist die Pulsdauer die Einwirkdauer. Wenn die Erwärmung durch eine gepulste Lichtquelle, die durch die Probe gescannt wird, hervorgerufen wird, ist die kürzere der beiden Dauern (Pulsdauer und Zeitdauer d / v ) die Einwirkdauer.
Die Einwirkdauer t_A beträgt bei mindestens einem Durchlauf des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 10 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 20 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 40 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 80 Durchläufen des Zyklus und ganz besonders vorzugsweise bei mindestens 160 Durchläufen des Zyklus vorzugsweise mehr als 1 ps (Picosekunde), besonders vorzugsweise mehr als 30 ps, besonders vorzugsweise mehr als 100 ps, besonders vorzugsweise mehr als 300 ps, besonders bevorzugt mehr als 1 ns (Nanosekunde), besonders vorzugsweise mehr als 10 ns, besonders vorzugsweise mehr als 100 ns, besonders vorzugsweise mehr als 300 ns, besonders vorzugsweise mehr als 1 μs (Mikrosekunde), besonders vorzugsweise mehr als 3 μs, besonders vorzugsweise mehr als 10 μs.
Die Einwirkdauer t_A beträgt bei mindestens einem Durchlauf des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 10 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 20 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 40 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 80 Durchläufen des Zyklus und ganz besonders vorzugsweise bei mindestens 160 Durchläufen des Zyklus vorzugsweise weniger als 10 s (Sekunden), besonders vorzugsweise 1 s, besonders vorzugsweise weniger als 100 ms (Millisekunden), besonders vorzugsweise weniger als 10 ms, besonders vorzugsweise weniger als 1 ms besonders vorzugsweise weniger als 500 μs, besonders vorzugsweise weniger als 100 μs, besonders vorzugsweise weniger als 50 μs, besonders vorzugsweise weniger als 10 μs. Vorzugsweise ist die Einwirkdauer t_A kürzer als es im Mittel dauert, bis die Wärme, die in der Umgebung der Nanopartikeln entsteht, den mittleren Teilchenabstand diffundiert, so dass im Mittel kein signifikanter Überlapp der Wärmefronten benachbarter Teilchen stattfindet.
Besonders vorzugsweise ist die Einwirkdauer t_A bei mindestens einem Durchlauf des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 10 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 20 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 40 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 80 Durchläufen des Zyklus und ganz besonders vorzugsweise bei mindestens 160 Durchläufen des Zyklus so gewählt, dass die Temperaturerhöhung um jedes bestrahlten Nanopartikel herum im Mittel in einer Entfernung von 20 Nanopartikeldurchmessern, besonders vorzugsweise 2 Nanopartikeldurchmessern, ganz besonders vorzugsweise 1 Nanopartikeldurchmesser, auf weniger als die Hälfte der Temperaturerhöhung auf der Oberfläche der Nanopartikel abfällt.
In einer Ausführung ist eine kurze Bestrahlungsdauer pro Volumen bevorzugt, so dass ein dehybridisierter DNA-Einzelstrang während des Denaturierens nur weniger als 100 nm (Nanometer), besonders vorzugsweise weniger als 20 nm, besonders vorzugsweise weniger als 5 nm, vom Nanopartikel weg diffundieren kann. Dadurch ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass der dehybridisierte DNA-Einzelstrang an ein Oligonukleotid auf demselben Nanopartikel bindet („Rehybridisierung”). Dies kann ein beschleunigtes erfindungsgemäßes Verfahren ermöglichen. Hierfür sind Einwirkdauern t_A zwischen 0,1 ns und 1000 ns vorzuziehen, besonders zwischen 1 ns und 300 ns.
In einer bevorzugten Ausführungsform für die Rehybridisierung ist die Konzentration der mit Primern konjugierten Nanopartikel kleiner als 10 nM, dabei beträgt das Einwirkdauer t_A vorzugsweise zwischen 1 ns und 10 μs (Mikrosekunde), besonders vorzugsweise zwischen 10 ns und 1 μs und ganz besonders vorzugsweise zwischen 15 ns und 300 ns. Das Zeitintervall der Anregung wird vorzugsweise nicht wesentlich kleiner als 1 ns gewählt, da sonst die Zeit der Erwärmung des DNA-Doppelstranges nicht dazu ausreicht, dass die beiden enthaltenen Einzelstränge sich durch Diffusion ausreichend voneinander trennen können, so dass sie nicht sofort wieder miteinander hybridisieren.
Die Bestrahlungszeiten pro Probenvolumen (d. h. die Zeit die ein bestimmtes Volumen je Zyklus zur Erwärmung optothermisch bestrahlt wird) liegen vorzugsweise unter 1 s/μl liegen, besonders vorzugsweise unter 0,1 s/μl, bzw. 0,01 s/μl, bzw. unter 0,001 s/μl liegen. Vorzugsweise sind die Bestrahlungszeiten pro Volumen, abhängig von der eingesetzten Strahlenquelle gleichzeitig größer als 1 ps/μl, bzw. vorzugsweise größer als 10 ps/μl, bzw. 100 ps/μl (z. B. beim Einsatz gepulster Laser), bzw. in anderen Ausführungsformen (z. B. bei Lasern im CW-Betrieb) größer als 10 ns/μl, bzw. 100 ns/μl.
Die Aufheizzeit beträgt bei mindestens einem Durchlauf des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 10 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 20 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 40 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 80 Durchläufen des Zyklus und ganz besonders vorzugsweise bei mindestens 160 Durchläufen des Zyklus vorzugsweise weniger als 100 ms, besonders vorzugsweise weniger als 10 ms, besonders vorzugsweise weniger als 1 ms, besonders vorzugsweise weniger als 100 μs, besonders vorzugsweise weniger als 50 μs, besonders vorzugsweise weniger als 10 μs, besonders vorzugsweise weniger als 5 μs, besonders vorzugsweise weniger als 1,5 μs.
Die Aufheizzeit beträgt bei mindestens einem Durchlauf des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 10 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 20 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 40 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 80 Durchläufen des Zyklus und ganz besonders vorzugsweise bei mindestens 160 Durchläufen des Zyklus vorzugsweise mehr als 1 ns, besonders vorzugsweise mehr als 5 ns, besonders vorzugsweise mehr als 10 ns.
Die Abkühlzeit beträgt bei mindestens einem Durchlauf des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 10 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 20 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 40 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 80 Durchläufen des Zyklus und ganz besonders vorzugsweise bei mindestens 160 Durchläufen des Zyklus vorzugsweise weniger als 100 ms, besonders vorzugsweise weniger als 10 ms, besonders vorzugsweise weniger als 1 ms, besonders vorzugsweise weniger als 100 μs, besonders vorzugsweise weniger als 50 μs, besonders vorzugsweise weniger als 10 μs, besonders vorzugsweise weniger als 5 μs, besonders vorzugsweise weniger als bzw. 1,5 μs.
Die Abkühlzeit beträgt bei mindestens einem Durchlauf des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 10 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 20 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 40 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 80 Durchläufen des Zyklus und ganz besonders vorzugsweise bei mindestens 160 Durchläufen des Zyklus vorzugsweise mehr als 1 ns, besonders vorzugsweise mehr als 5 ns, besonders vorzugsweise mehr als 10 ns.
Die Aufheizzeit ist die Zeit, die vergeht, nachdem die Anregungsintensität I(t) der Lichtquelle im jeweils angeregten Volumen ihren Maximalwert erreicht hat, bis sich an jedem Punkt im angeregten Volumen eine Temperatur einstellt, die sich auch bei Verdoppelung der Einwirkdauer um maximal 3°C ändert.
Die Abkühlzeit ist die Zeitdauer nach dem Abschaltzeitpunkt der anregenden Lichtquelle, die vergeht bis sich an jedem Punkt im betrachteten Volumen eine Temperatur einstellt, die um maximal 3°C von der Temperatur vor der Einwirkung abweicht.
Der Abschaltzeitpunkt t_off der anregenden Lichtquelle wird definiert als der Zeitpunkt, an dem die Anregungsintensität I im betrachteten Volumen auf weniger als 5% der maximalen Anregungsintensität zurückgegangen ist (z. B. nach dem Puls eines Lasers).
Bestimmung der Aufheiz- und Abkühlzeit: Die zeitliche Temperaturentwicklung im Abstand r vom Zentrum eines Nanopartikels mit Radius rNP erhält man durch numerisches Lösen der Wärmeleitungsgleichung in einer genügend großen Wasserkugel mit Radius rMax um das Nanopartikel, wobei das Nanopartikel selbst aus dem Simulationsbereich heraus genommen wird. Durch Ausnutzen der Kugelsymmetrie ergibt sich eine eindimensionale radiale Wärmeleitungsgleichung im Bereich rNP bis rMax, t > 0: α / r²∂_r(r²·∂_rT(r, t)) = ∂_tT(r, t), wobei T(r, t) die Temperatur an der Stelle r zur Zeit t ist und α die thermische Diffusivität des Wassers bezeichnet (α = 1,43·10^–7 m²/s). Als Startbedingung setzt man die Temperatur des umgebenden Mediums vor der optischen Anregung auf T₀: T(r, 0) = T₀. Die Randbedingungen an den Stellen rNP und rMax werden wie folgt gesetzt: An der Stelle r = rNP erhält man die Steigung des Temperaturverlaufs zum Zeitpunkt t aus der absorbierten Leistung des Nanopartikels zum Zeitpunkt t (Neumann Randbedingung): ∂_rT(rNP, t) = P(t)/(4·π·rNP²·k), wobei P(t) die durch das Nanopartikel aufgenommene Leistung und k die thermische Leitfähigkeit von Wasser (k = 0.6W/(m·K)) ist. Die absorbierte Leistung berechnet sich aus P(t) = I(t)·σ mit I(t) der zeitabhängigen Anregungsintensität der Lichtquelle und dem Absorptionsquerschnitt des Partikels σ. (D. h. I(t) wäre beispielsweise – so lange die Fokusgröße nicht verändert wird – für einen CW-Laser eine Konstante, und für einen gepulsten Laser würde I(t) die zeitabhängige Pulsform wiedergeben).
An der Stelle rMax wird die Temperatur konstant gehalten (T(rMax, t) = T₀, Dirichlet Randbedingung). Für rNP < 100 nm wählt man zum Beispiel rMax ≥ 10000 nm. Die thermische Diffusivität und thermische Leitfähigkeit des Wasser wird als konstant angenommen. Allgemein gilt α = k/(C·ρ), mit C der spezifischen Wärmekapazität und ρ der Dichte von Wasser.
Mittels geeigneter Programme zum numerischen Lösen solcher partieller Differentialgleichungen (z. B. mit dem Befehl NSolve in Mathematica, etc.) kann dann obige Wämeleitungsgleichung gelöst werden und man erhält Werte für die Temperatur als Funktion des Ortes und der Zeit, T(r, t).
Beispielsweise erhält man für ein sphärisches Gold-Nanopartikel mit rNP = 30 nm, das mit einer konstanten Intensität von 1 kW/mm² bei 532 nm Wellenlänge für eine Dauer von 100 ns angeregt wird für einen Starttemperatur von T₀ = 30°C folgende Werte: T(r = 30 nm, t = 20 ns) = 70°C, T(r = 30 nm, t = 100 ns) = 78°C, T(r = 30 nm, t = 120 ns) = 36°C, T(r = 40 nm, t = 20 ns) = 56°C, T(r = 40 nm, t = 100 ns) = 64°C, T(r = 40 nm, t = 120 ns) = 36°C.
Zur Ermittlung der erfindungsgemäßen Aufheizzeit wird T(r, t) für verschiedene Zeiten ausgewertet. Die Aufheizzeit ist dann die kürzeste Zeit t_auf für die gilt |T(r, t_auf) – T(r, 2·t_auf)| ≤ 3°C mit r ∊ [rNP; rMAX] d. h. der Betrag der Differenz der Temperaturverteilung für die Zeitpunkte t_auf und 2t_auf muss für alle Punkte außerhalb des Nanopartikels kleiner 3°C sein.
Die Abkühlzeit ergibt sich als Differenz t_x – t_off, wobei t_x die kürzeste Zeit ist, für die gilt |T(r, t_x) – T₀| ≤ 3°C mit r ∊ [rNP; rMAX] und t_x > t_off.
Vorzugsweise ist die Konzentration des Amplikons, das in dem Verfahren vervielfältigt werden soll, zu Beginn des Verfahrens größer als 10^–23 M (Mol/Liter), besonders vorzugsweise größer als 10^–21 M, besonders vorzugsweise größer als 10^–20 M, besonders vorzugsweise größer als 10^–19 M. Durch diese Ausführung der Erfindung kann vorteilhaft erreicht werden, dass die Vervielfältigung ausreichend sensitiv ist, um eine zum Nachweis geeignete Menge von Vervielfältigungsprodukten herzustellen.
Vorzugsweise ist die Konzentration des Amplikons, das in dem Verfahren vervielfältigt werden soll, zu Beginn des Verfahrens kleiner als 1 nM (Nanomol/Liter), besonders vorzugsweise kleiner als 30 pM (Pikoomol/Liter), besonders vorzugsweise kleiner als 900 (Femtomol/Liter), besonders vorzugsweise kleiner als 800 fM (Femtomol/Liter), besonders vorzugsweise kleiner als 500 fM (Femtomol/Liter), besonders vorzugsweise kleiner als 100 fM, besonders vorzugsweise kleiner als 30 fM. Durch diese Ausführung der Erfindung kann vorteilhaft verhindert werden, dass die Vervielfältigung bereits vor ihrem Ende eine Sättigung erreicht.
Vorzugsweise ist die Anzahl der Amplikons, das in dem Verfahren vervielfältigt werden soll, zu Beginn des Verfahrens kleiner als 500.000, besonders vorzugsweise kleiner als 200.000, besonders vorzugsweise kleiner als 100.000, besonders vorzugsweise kleiner als 10.000. Durch diese Ausführung der Erfindung kann vorteilhaft verhindert werden, dass die Vervielfältigung bereits vor ihrem Ende eine Sättigung erreicht.
In einer Ausführung der Erfindung werden die Nukleinsäuren mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bei der ein Zyklus bestehend aus den Schritten Denaturierung, Annealing und Elongation wiederholt durchlaufen wird, vervielfältigt.
Der Zyklus kann so oft durchlaufen werden, bis das gewünschte Ausmaß der Vervielfältigung erreicht ist. Die Anzahl der Durchläufe des Zyklus der Polymerase-Kettenreaktion ist vorzugsweise größer als 45, besonders vorzugsweise größer als 60, besonders vorzugsweise größer als 80, besonders vorzugsweise größer als 100, besonders vorzugsweise größer als 120, besonders vorzugsweise größer als 160, besonders vorzugsweise größer als 200. Mit einer großen Anzahl von Durchläufen kann vorteilhafterweise eine besonders hohe Vervielfältigung erreicht werden.
Die Anzahl der Durchläufe des Zyklus der Polymerase-Kettenreaktion ist vorzugsweise kleiner als 1000, besonders vorzugsweise kleiner als 750, besonders vorzugsweise kleiner als 500. Mit einer nicht zu hohen Zahl von Durchläufen des Zyklus kann vorteilhafterweise die Dauer der Vervielfältigung verringert werde. Außerdem können vorteilhafterweise negative Einflüsse von Verunreinigungen oder des Verbrauchs oder der Beschädigung von Reaktionspartnern, wie beispielsweise einer bei dem Verfahren eingesetzten Polymerase, gering gehalten werden.
Vorzugsweise verwendet die PCR mit Primern konjugierte Nanopartikel. Beim Durchführen der PCR entstehen so vorzugsweise doppelsträngige PCR-Produkte, wobei jeweils mindestens ein Einzelstrang der doppelsträngigen PCR-Produkte mit einem Nanopartikel konjugiert ist. Durch Anregung der Nanopartikel ist es in dieser Ausführungsform mit Vorteil erreichbar, die Denaturierungstemperatur um die Nanopartikel zu erzeugen und das Denaturieren der doppelsträngigen PCR-Produkte durchzuführen, ohne das gesamte Reaktionsvolumen zu erhitzen. Dadurch kann das Denaturieren beschleunigt werden und so die PCR schneller ablaufen. In einer weiteren bevorzugten Ausführung werden auch die Annealingtemperatur und die Elongationstemperatur durch die Anregung der Nanopartikel erzeugt. So muss vorzugsweise im Vergleich zur Erhitzung der ganzen Probe auf die Annealing- und Elongationstemperatur nur eine geringe Energie übertragen werden. Besonders bevorzugt findet Denaturieren, Annealing und Elongation der PCR ohne ein globales Erhitzen, sondern ausschließlich über ein lokales Erhitzen durch Anregung der Nanopartikel statt. Dadurch kann das Verfahren ohne eine Einrichtung zum globalen Erhitzen durchgeführt werden, so dass ein geringerer apparativer Aufwand zur Durchführung des Verfahrens benötigt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung umfasst das Verfahren einen globalen Erhitzungsschritt. Dabei wird die Temperatur mindestens eines Verfahrensschritts zumindest teilweise durch globales Erhitzen erreicht. In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das Verfahren eine PCR und die Annealingtemperatur wird durch globales Erhitzen des Reaktionsvolumens erreicht. Ganz besonders vorzugsweise wird das Reaktionsvolumen über das ganze Verfahren hinweg durch globales Erhitzen in einem vorbestimmten Temperaturbereich gehalten, in dem das Annealing stattfindet. Dabei werden die Elongationstemperatur und die Denaturierungstemperatur durch Anregung der Nanopartikel erreicht. So kann mit Vorteil die Einrichtung, die das globale Erhitzen erzeugt, in ihrer Konstruktion sehr einfach gehalten werden, da sie nur eine vorbestimmte Temperatur halten muss.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird die Annealingtemperatur und die Elongationstemperatur durch globales Erhitzen erreicht und ausschließlich das Denaturieren durch Anregung der Nanopartikel erzeugt. So kann mit Vorteil erreicht werden, dass die Einrichtung, die das globale Erhitzen hervorruft, einen Temperaturzyklus mit nur zwei unterschiedlichen Temperaturen erzeugen muss und damit konstruktiv einfach gehalten werden kann. Die Elongation und das Annealing finden gewöhnlich jeweils in einem engen Temperaturbereich statt. Dahingegen muss zum Denaturieren nur eine bestimmte Temperatur übertroffen werden. Daher können Inhomogenitäten in der Anregung der Nanopartikel zur Erzeugung des Denaturierens ein geringeres Problem sein als beim Einstellen der Annealing- und Elongationstemperatur. Folglich kann eine bevorzugte Ausführung, in der die Anregung der Nanopartikel ausschließlich zum Denaturieren dient, technisch einfacher realisiert werden. Insbesondere gilt dies für den besonders bevorzugten Fall, in dem die Annealingtemperatur und die Elongationstemperatur sehr nah beieinander liegen, z. B. bei einer Annealingtemperatur von 60°C und einer Elongationstemperatur von 72°C, so dass das globale Erhitzen nur eine geringe Temperaturerhöhung erzeugen muss.
In einer besonders bevorzugten Ausbildung ist die Annealingtemperatur gleich der Elongationstemperatur. Dabei ist das Verfahren als PCR ausgeführt. Wenn die Annealingtemperatur gleich der Elongationstemperatur ist, so ist gewöhnlich zur Durchführung der PCR nur ein Temperaturzyklus mit zwei unterschiedlichen Temperaturen nötig, wodurch das Verfahren in einem einfachen Aufbau durchgeführt werden kann. Besonders vorzugsweise werden die Schmelztemperaturen der Primer und die verwendete DNA-Polymerase so gewählt, dass bei der Schmelztemperatur die verwendete DNA-Polymerase noch mit ausreichender Geschwindigkeit DNA synthetisieren kann. In einer besonders bevorzugten Ausbildung wird die Elongationstemperatur, die gleich der Annealingtemperatur ist, durch globales Erhitzen erreicht und das Denaturieren wird durch Anregung der Nanopartikel erreicht. Auf diese Weise kann die Einrichtung, die das globale Erhitzen hervorruft, konstruktiv einfach gestaltet werden, da sie nur eine Temperatur halten muss.
In einer bevorzugten Ausführung findet zu jedem Zeitpunkt des Verfahrens die Anregung nur eines Anteils der Nanopartikel statt. Dazu können z. B. die Mittel, die der Anregung der Nanopartikel dienen, so gestaltet sein, dass sie nur in einem Teil des Reaktionsvolumens die dort vorliegenden Nanopartikel anregen. In einer besonders bevorzugten Ausführung werden die Nanopartikel durch einen Laser optisch angeregt und die Optik, die das Licht des Lasers in das Reaktionsvolumen leitet, ist so gestaltet, dass nur in einen Teil des Reaktionsvolumens Licht geleitet wird. Der Anteil der Nanopartikel, der angeregt wird, ändert sich bevorzugt im Laufe des Verfahrens. Mit anderen Worten ist eine erste Menge der Nanopartikel, die zu einem ersten Zeitpunkt angeregt werden, nicht identisch mit einer zweiten Menge der Nanopartikel, die zu einem zweiten Zeitpunkt angeregt werden. In diesem Fall können eine beliebige Zahl von Nanopartikeln in der ersten und eine beliebige Zahl von Nanopartikeln in der zweiten Menge vorhanden sein, solange erste und zweite Menge nicht identisch sind. Von den beiden genannten Mengen kann sich z. B. eine mit der anderen teilweise überschneiden, so dass die beiden Mengen eine Schnittmenge bilden. Die eine Menge kann z. B. eine Teilmenge der anderen Menge sein, so dass die eine Menge weniger Nanopartikel enthält als die andere Menge. Die beiden Mengen können z. B. auch so gestaltet sein, dass sie keine Schnittmenge bilden und damit kein Nanopartikel zugleich in der ersten Menge als auch in der zweiten Menge vorhanden ist. Eine der beiden Mengen kann auch die leere Menge sein, so dass z. B. zu einem Zeitpunkt Nanopartikel angeregt werden und zu einem anderen Zeitpunkt keine Nanopartikel angeregt werden. In einer bevorzugten Ausführung enthalten die erste und die zweite Menge im Wesentlichen die gleiche Anzahl von Nanopartikeln. Besonders vorzugsweise regt ein Laser zu verschiedenen Zeiten verschiedene Anteile der Nanopartikel an. Dadurch kann in der Ausführung des Verfahrens ein Laser mit einer kleineren Leistung verwendet werden, die gerade dazu ausreicht, einen Anteil der Nanopartikel anzuregen. In einer besonders bevorzugten Ausführung werden zwei oder mehrere Laser dazu verwendet, verschiedene Anteile der Nanopartikel anzuregen. Dadurch ist es mit Vorteil möglich, verschiedene Anteile der Nanopartikel anzuregen, ohne dass ein optisches Element benötigt wird, das den Laser auf verschiedene Teile des Reaktionsvolumens richtet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung der Erfindung findet eine gerichtete Bewegung der Probe relativ zu einem anregenden Feld statt, so dass zu verschiedenen Zeiten Nanopartikel in verschiedenen Teilvolumina der Probe angeregt werden. Besonders bevorzugt ist das anregende Feld das Licht eines Lasers. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung wird das Licht des Lasers durch ein optisches Element so gelenkt, dass zu verschiedenen Zeiten Nanopartikel in verschiedenen Teilvolumina des Reaktionsvolumens mit dem Licht angeregt werden. Das optische Element kann dazu beweglich angeordnet sein, z. B. kann das optische Element einen beweglichen Spiegel, einen räumlichen Modulator oder einen akustooptischen Modulator enthalten. Es kann auch der Laser selbst beweglich angeordnet sein. Die Bewegung der Probe kann auch so realisiert werden, dass das Reaktionsgefäß, das die Probe enthält, bewegt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführung wird sowohl der Laserstrahl als auch das Reaktionsgefäß bewegt. In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird die Probe im Reaktionsvolumen bewegt, so dass das Licht des Lasers zu verschiedenen Zeiten verschiedene Teilvolumina der Probe erfasst. Dies kann z. B. dadurch erreicht werden, dass die Probe in dem Reaktionsvolumen durchmischt wird, z. B. durch einen Magnetrührer. Das Reaktionsvolumen kann z. B. eine langgestreckte Form annehmen, z. B. ein Kanal oder einen Schlauch. Die Probe kann z. B. durch einen Kanal bewegt werden, wobei die Probe an einer oder mehreren Stellen einen Laserstrahl durchläuft. Besonders vorzugsweise fließt eine Probe durch einen Kanal und passiert n Positionen, an denen jeweils ein Laserstrahl auf die Probe in dem Kanal gerichtet ist, wobei durch den linearen Fluss der Probe durch die n Laserstrahlen eine PCR mit n Zyklen durchlaufen wird. So kann vorteilhafterweise das Verfahren mit einer geringen Anzahl von beweglichen Teilen ausgeführt werden. Durch die Verwendung eines Kanals ist auch eine Miniaturisierung, z. B. im Sinne eines Lab-on-a-Chip möglich. Vorzugsweise wird durch den Laserstrahl das Denaturieren erzeugt, während Elongations- und Annealingtemperatur durch globales Erhitzen erzeugt werden. Besonders bevorzugt ist die Elongations- gleich der Annealingtemperatur, so dass durch globales Erhitzen nur eine Temperatur gehalten werden muss. Auf diese Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise mit einem geringen Aufwand ausgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in dem Verfahren eine DNA-Polymerase verwendet, die thermolabil ist. In dem Fall, dass die Anregung der Nanopartikel zum Denaturieren verwendet wird, kann vermieden werden, dass das ganze Reaktionsvolumen hohen Temperaturen ausgesetzt wird. Es ist vielmehr möglich, nur die unmittelbare Umgebung der Nanopartikel auf die Denaturierungstemperatur zu bringen. Die DNA-Polymerasen, die sich nicht in dieser unmittelbaren Umgebung befinden, werden so keinen hohen Temperaturen ausgesetzt. Dadurch ist es möglich, auch DNA-Polymerasen zu verwenden, die nicht hitzestabil, also thermolabil sind. Somit besteht durch den Einschluss der thermolabilen DNA-Polymerasen eine größere Auswahl an Polymerasen für das erfindungsgemäße Verfahren. Durch die größere Auswahl an DNA-Polymerasen können die Reaktionsbedingungen in einem größeren Ausmaß verändert werden und gleichzeitig eine ausreichende Funktion der jeweiligen DNA-Polymerase aufrechterhalten werden. Damit die zu vervielfältigenden Nukleinsäuren an die negativ geladenen Oligonukleotide auf den Nanopartikeln binden können, kann es notwendig sein, Stoffe – insbesondere Salze – in der Probe in einer Konzentration zu verwenden, die die Funktion einer thermostabilen DNA-Polymerase negativ beeinflussen, was die Effizienz des Verfahrens senkt. Die größere Auswahl an DNA-Polymerasen – insbesondere solchen, die eine hohe Toleranz für Salze haben – kann so dazu führen, dass eine Steigerung der Effizienz des Verfahrens erreicht wird. Teil der größeren Auswahl an DNA-Polymerasen sind kleine DNA-Polymerasen wie z. B. das Klenow-Fragment und Phi29. In der Nähe der Nanopartikel können große thermostabile DNA-Polymerasen durch die aufgebrachten und gegebenenfalls bereits elongierten Primer eine sterische Hinderung erfahren. Dadurch kann es sein, dass die DNA-Polymerase nicht an die zu kopierende Nukleinsäure gelangt oder die DNA-Polymerase abbricht, bevor sie eine vollständige Kopie des Originals oder Komplements synthetisiert hat, was eine Verringerung der Effizienz des Verfahrens bedeutet. Die größere Auswahl an DNA-Polymerasen ermöglicht so eine Erhöhung der Effizienz des Verfahrens. Durch die größere Auswahl an DNA-Polymerasen stehen mit Vorteil auch Enzyme mit niedrigeren Herstellungskosten zur Verfügung. Die DNA-Polymerasen, die sich nicht in der unmittelbaren Umgebung der Nanopartikel befinden, erfahren eine geringere hitzebedingte Deaktivierung. Dadurch kann mit Vorteil eine geringere Menge an DNA-Polymerase in dem Verfahren eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind sowohl lösliche Primer als auch Primer auf Nanopartikeln in dem Reaktionsvolumen vorhanden. Die löslichen Primer sind nicht an Nanopartikel konjugiert, sondern liegen gelöst in der Probe vor. Die löslichen Primer haben vorzugsweise kleinere Ausmaße als die Nanopartikel-Primer-Konjugate und können in höherer Konzentration als die Nanopartikel-Primer-Konjugate vorliegen. Daher können die löslichen Primer einen besseren und schnelleren Zugang zu langen, doppelsträngigen Nukleinsäuren, wie z. B. genomischer DNA haben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden in einem ersten Schritt des Verfahrens die langen, doppelsträngigen Nukleinsäuren durch globales Erhitzen des gesamten Reaktionsvolumens denaturiert, woraufhin die gelösten Primer mit den Nukleinsäuren hybridisieren. Die PCR läuft dabei zunächst in einem oder mehreren Zyklen bei globalem Erhitzen ab, dabei synthetisiert die DNA-Polymerase die gewünschten, kurzen Kopien der langen, doppelsträngigen Nukleinsäuren. Danach wird die PCR fortgeführt, wobei auch lokales Erhitzen durch Anregung der Nanopartikel eingesetzt wird.
Kurzbeschreibung der Figuren
Es zeigen:
1 in einer schematischen Darstellung die erfindungsgemäßen Nanopartikel, die mit Füllmolekülen, Spacersequenzen, abasischen Modifikationen und Primersequenzen konjugiert sind;
2 in einer weiteren schematischen Darstellung die erfindungsgemäßen Nanopartikel, die mit Füllmolekülen, Spacersequenzen, abasischen Modifikationen und Primersequenzen konjugiert sind;
3 in einer schematischen Darstellung einen Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Laser, einem zweidimensionalen Spiegelscanner und einer Probe;
4 in einer schematischen Darstellung einen weiteren Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Laser, einem Spiegel und einer relativ zum Laserstrahl bewegten Probe;
5 in einer schematischen Darstellung einen weiteren Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Laser, einem eindimensionalen Spiegelscanner und einer eindimensional bewegten Probe;
6 in einer schematischen Darstellung die erfindungsgemäßen Nanopartikel und die erfindungsgemäßen Testsonden zum positiven Nachweis von DNA;
7 in einer schematischen Darstellung einen weiteren Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Laser, einem zweidimensionalen Spiegelscanner und Probenröhrchen in einem Wasserbad;
8 in zwei Diagrammen die Ergebnisse von Vervielfältigungsreaktionen mit globalem und lokalem Erhitzen mit Testsonden zum positiven Nachweis von DNA;
9 in schematischer Darstellung die erfindungsgemäßen Nanopartikel und die erfindungsgemäßen Testsonden mit terminierenden Modifikationen zum negativen Nachweis von DNA;
10 in einer schematischen Darstellung einen weiteren Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Laser, zwei Heizblöcken mit Aussparungen, Multiwellplatte und Folie sowie Streuscheibe und Photodiode;
11 in einem Diagramm die Ergebnisse von Vervielfältigungsreaktionen mit Testsonden zum negativen Nachweis von DNA; und
12 in einer schematischen Darstellung einen ersten Laser zum Anregen von Nanopartikeln in einem Probenröhrchen und einen zweiten Laser und eine Photodiode zur Messung der Transmission der Probe.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung anhand mehrerer Ausführungsbeispiele
1 zeigt ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren 1, das als PCR ausgeführt ist. In einem Reaktionsvolumen 2 sind erste Nanopartikel 3 enthalten. Die ersten Nanopartikel 3 weisen an ihrer Oberfläche Oligonukleotide 4 auf, wie in 1a gezeigt. Eine Sorte von Oligonukleotiden 4 enthalten jeweils als Teilsequenz eine Primersequenz 5 mit der Sequenz A und als weitere, optionale Teilsequenz eine Spacersequenz 6 S und eine optionale abasische Modifikation 7 zwischen Primersequenz 5 A und Spacersequenz 6 S. Die Spacersequenz 6 S dient dazu, die Primersequenz 5 weit genug von der Oberfläche der Nanopartikel 9 wegzuhalten, so dass eine zu vervielfältigende Nukleinsäure 1 mit einer besseren Effizienz an die Primersequenz 5 binden kann und die DNA-Polymerase 11 einen besseren Zugang zu der Primersequenz 5 finden kann. Die abasische Modifikation 7 verhindert das Überschreiben der Spacersequenz durch die Polymerase 11. Die Oligonukleotide 4 mit der Primersequenz 5 A sind z. B. mit einer Thiol-Bindung an der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 befestigt, so dass das 3'-Ende vom ersten Nanopartikel 3 abgewandt ist. Optional kann sich eine weitere Sorte von Oligonukleotiden 4 auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 befinden, dies sind die Füllmoleküle 10 F. Mit den Füllmolekülen 10 kann die Ladung der Nanopartikel 9 moduliert werden, so dass es nicht zu unerwünschten Aggregationen der Nanopartikel 9 kommt. Darüber hinaus können die Füllmoleküle 10 den Abstand der Primersequenzen 5 zueinander auf der Oberfläche der Nanopartikel 9 vergrößern, so dass die zu vervielfältigenden Nukleinsäuren 1 und die DNA-Polymerase 11 einen besseren Zugang zu den Primersequenzen 5 haben. Dies kann die Effizienz des Verfahrens erhöhen. Die Spacersequenz 6 ist dabei bevorzugt mindestens so lang wie die Füllmoleküle 10, so dass mit Vorteil die Primersequenzen 5 aus den Füllmolekülen 10 hervorragen.
In dem Reaktionsvolumen 2 befindet sich eine Probe 12, die die ersten Nanopartikel 3 aus 1a mit den Primersequenzen 5, Spacersequenzen 6, abasischer Modifikation 7 und Füllmolekülen 10 enthält und die darüber hinaus dNTPs und DNA-Polymerase 11 aufweist, zudem weitere, für eine PCR nötige Reagenzien. Eine nachzuweisende Nukleinsäure 1 kann in der Probe 12 vorhanden sein. In diesem Ausführungsbeispiel ist die nachzuweisende Nukleinsäure 1 ein DNA-Einzelstrang, der auch als Original 13 bezeichnet wird und eine Teilsequenz A sowie eine Teilsequenz B' aufweist. Das Original 13 kann auch noch weitere Teilsequenzen aufweisen, z. B. als Überhänge am 5'- oder 3'-Ende oder zwischen den beiden Teilsequenzen A' und B'. In 1b bindet das Original 13 mit seiner Teilsequenz A' an die Primersequenz 5 A auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3. In 1c ist gezeigt, dass eine DNA-Polymerase 11 an das Original 13 und die mit dem Original 13 hybridisierte Primersequenz 5 A bindet. Daraufhin synthetisiert die DNA-Polymerase 11 in einem Elongationsschritt, der in 1d gezeigt wird, ausgehend vom 3'-Ende der Primersequenz 5 A eine zum Original 13 komplementäre Nukleinsäure 1, die als Komplement 14 bezeichnet wird und die mit der Spacersequenz 6 auf der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 verbunden ist. In 1e wird der erste Nanopartikel 3 dann mit Licht bestrahlt, das von dem ersten Nanopartikel 3 aufgrund seiner plasmonischen oder materiellen Eigenschaften absorbiert wird und in Wärme umgewandelt wird. Die Wärme wird an die Umgebung des ersten Nanopartikels 3 abgegeben und ist im Bereich des Originals 13 und des mit ihm hybridisierten, neu synthetisierten Komplements 14 dazu ausreichend, dass das Original 13 von dem Komplement 14 denaturiert. Das Original 13 ist nunmehr erneut frei, wie in 1f dargestellt, so dass es an eine weitere Primersequenz 5 binden kann und weitere nanopartikelgebundene Komplemente 14 in weiteren Zyklen des Verfahrens synthetisiert werden können. Dabei entsteht ein linearer Anstieg der Konzentration der Komplemente 14 mit steigender Zyklenzahl.
In einer Ausführung des Verfahrens wird nach dem Verlängern der Primersequenz 5 auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3, bei der ein nanopartikelgebundenes Komplement 14 entsteht, ein freier Rückwärtsprimer 16 verwendet, der an das 3'-Ende des Komplements bindet. In 1g ist gezeigt, dass das bereits synthetisierte Komplement 14 mit den Teilsequenzen A und B, das über eine Spacersequenz 6 und eine abasische Modifikation 7 auf der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 verbunden ist, mit einem zuvor frei in der Probe 12 vorhandenen Primer 8 B' hybridisiert. Dabei hat der Primer 8 die Sequenz B' und ist mit der Teilsequenz B des Komplements 14 verbunden. Ausgehend vom Primer 8 mit der Sequenz B' synthetisiert die DNA-Polymerase eine Kopie des Originals 13. In 1g wird auch gezeigt, dass das Original 13 an eine weitere Primersequenz 5 A auf der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 gebunden hat und eine DNA-Polymerase 11 ausgehend von der Primersequenz 5 A ein weiteres Komplement 14 synthetisiert. Das Original 13, die Kopie des Originals 13 und die beiden mit dem ersten Nanopartikel verbundenen Komplemente 14 sind in 1h dargestellt. Eine nachfolgende Denaturierung durch Anregung der ersten Nanopartikel 3 führt dazu, dass das Original 13 und seine Kopie frei werden. Dabei können sowohl das Original 13 als auch seine Kopie in folgenden Schritten des Verfahrens als Vorlage zur Vervielfältigung dienen. Nach einer Wartedauer, die gegebenenfalls zur Hybridisierung von Original 13 und Kopien des Originals 13 mit Primersequenzen 5 A auf den ersten Nanopartikeln 3 und von freien Primern 8 B' mit auf den ersten Nanopartikeln 3 bereits elongierten Primersequenzen 5 nötig ist, kann mit einer weiteren Anregung der ersten Nanopartikel 3 der nächste Zyklus des Verfahrens durchgeführt werden. Vorzugsweise wird der Zyklus wiederholt, bis sich ausreichend viele verlängerte Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 befinden und/oder ausreichend viele Kopien des Originals 13 in der Probe 12 befinden, um einen Nachweis der erfolgten Vervielfältigung beziehungsweise des Vorhandenseins des Originals 13 in der Probe 12 durchführen zu können. Durch einen freien Primer 8 B' ist, wie in 1g und 1h gezeigt, eine exponentielle Vervielfältigung des Originals 13 möglich. In 1a bis 1f ist ohne diesen freien Primer 8 jedoch nur eine lineare Vervielfältigung des nanopartikelgebundenen Komplements 14 zu erreichen.
In 2 ist eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt, in dem Nanopartikel 9 sich in einer Probe 12 befinden. Die Nanopartikel 9 weisen an ihrer Oberfläche Füllmoleküle 10 F auf. Ferner sind die Nanopartikel 9 mit Oligonukleotiden 4 konjugiert. Eine erste Sorte von Oligonukleotiden 4 bestehen aus einer Spacersequenz 6 S und einer Primersequenz 5 A und einer optionalen abasischen Modifikation 7 zwischen Primersequenz 5 A und Spacersequenz 6 S. Eine zweite Sorte von Oligonukleotiden 4 besteht aus einer Spacersequenz 6 S und einer Primersequenz 5 B' und einer optionalen abasische Modifikation 7 zwischen Primersequenz 5 B' und Spacersequenz 6 S. Das zu vervielfältigende Original 13 ist in diesem Ausführungsbeispiel ein einzelsträngiges DNA-Molekül mit den Teilsequenzen A, C und B (nicht gezeigt). Durch eine DNA-Polymerase 11 wurde ein zu dem Original 13 komplementärer Strang ausgehend von der Primersequenz B' auf der Oberfläche des Nanopartikels 9 synthetisiert, so dass, wie in 2a gezeigt, sich nun auf dem Nanopartikel 9 ein DNA-Einzelstrang mit der Sequenz S, B', C' und A' befindet. Zugleich ist in 2a zu sehen, dass durch eine DNA-Polymerase eine Kopie des Originals 13 ausgehend von der Primersequenz 5 A, die mit der Spacersequenz 6 S und der optionalen abasischen Modifikation 7 auf der Oberfläche des Nanopartikels 9 verbunden ist, synthetisiert wurde. Wie durch einen Pfeil in 2a gezeigt, hybridisiert die auf dem Nanopartikel 9 befestigte Kopie des Originals 13 mit ihrer Teilsequenz B an eine Primersequenz 5 B' auf der Oberfläche desselben Nanopartikels 9. Durch einen zweiten Pfeil in 2a ist gezeigt, dass das auf der Oberfläche des Nanopartikels 9 synthetisierte Komplement 14 mit seiner Teilsequenz A' an eine Primersequenz 5 A auf der Oberfläche desselben Nanopartikels 9 hybridisiert. Das Ergebnis der beiden genannten Hybridisierungen ist in 2b dargestellt. Dabei bilden sowohl das Original 13 als auch das Komplement 14 eine Schleife auf der Oberfläche des Nanopartikels 9. In 2c ist zu sehen, dass ausgehend von dem Primer 8 B' ein zu dem Original 13 komplementärer Strang synthetisiert wird, der über eine Spacersequenz 6 S mit der Oberfläche des Nanopartikels 9 verbunden ist. Durch eine weitere DNA-Polymerase 11 wird ausgehend von der Primersequenz 5 A eine Kopie des Originals 13 synthetisiert, die ebenfalls über eine Spacersequenz 6 mit der Oberfläche des Nanopartikels 9 verbunden ist. Die Synthese der Polymerase 11 endet jeweils an der abasischen Modifikation 7. Das Ergebnis der beiden Synthesen ist in 2d zu sehen. In dieser Ausführungsform befinden sich sowohl der Vorwärtsprimer 15 als auch der Rückwärtsprimer 16 auf demselben Nanopartikel 9. Auf diese Weise kann ein neu synthetisierter DNA-Strang zurück an einen Primer 8 auf demselben Nanopartikel 9 hybridisieren. Dies kann zu einer Beschleunigung des erfindungsgemäßen Verfahrens führen, da der neu synthetisierte DNA-Strang keine weiten Wege zurücklegen muss, um auf einen komplementären Primer 8 zu treffen. Vielmehr kann der neu synthetisierte DNA-Strang besonders schnell an einen komplementären Primer 8 auf der Oberfläche desselben Nanopartikels 9 binden, was besonders dadurch erleichtert wird, dass die lokale Konzentration der Primer 8 auf dem Nanopartikel 9 besonders hoch ist. Nach dem Anregen des Nanopartikels 9 in 2d, zum Beispiel durch einen Laser 17, dehybridisieren die Kopien des Originals 13 und die Kopien des Komplements 14, die jeweils über Spacersequenzen 6 optionale abasische Modifikation 7 auf der Oberfläche des Nanopartikels 9 befestigt sind. Daraufhin kann eine Kopie des Originals 13, die an einem Nanopartikel 9 befestigt, ist mit einem Komplement 14, das auf der Oberfläche eines anderen, identischen Nanopartikels 9 befestigt ist, hybridisieren. Durch die Hybridisierung werden die Nanopartikel 9 verbunden, so dass eine messbare Veränderung entsteht. Die messbare Veränderung kann zum Beispiel in einem Farbumschlag der Probe 12 bestehen. Durch die in 2a bis 2e dargestellte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, einen einfachen Test bereitzustellen, der zum Nachweis des Originals 13 dient.
In 3 ist ein Aufbau dargestellt, der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Der Aufbau enthält eine Lichtquelle 18, die in diesem Beispiel als Laser 17 ausgeführt ist und einen zweidimensionalen Spiegelscanner 19, der Licht von dem Laser 17 auf die Probe 12 lenken kann. Der zweidimensionale Spiegelscanner 19 kann dabei den Laserstrahl in zwei Dimensionen ablenken. Die Denaturierung in der Probe 12 geschieht in diesem Aufbau dadurch, dass ein Laserstrahl auf einen Teil der Probe 12 fokussiert wird. Im Laufe des Verfahrens wird der Laserstrahl so abgelenkt, dass er auf unterschiedliche Teile der Probe 12 trifft. In dem in 3 gezeigten Beispiel wird der Laserstrahl durch den Spiegelscanner 19 so abgelenkt, dass der Laserstrahl das Reaktionsvolumen 2, in dem sich die Probe 12 befindet, zeilenförmig abfährt. Der Weg, den der Laserstrahl zurücklegt wird in 3 in der Probe 12 gestrichelt dargestellt. Dadurch, dass zu jedem Zeitpunkt des Verfahrens nur Teile der Probe 12 angeregt werden, kann Laser 17 mit einer kleineren Leistung verwendet werden. Da Anregungen von unter einer Mikrosekunde ausreichen, um DNA mit Hilfe von optothermisch geheizten Nanopartikeln 9 zu denaturieren, kann bei typischen Fokusdurchmessern eines Lasers 17 von etwa 10 bis 100 μm ein Laserstrahl mit einer Geschwindigkeit von etwa 10 bis 100 m/s die Probe 12 abtasten und dabei an jedem Punkt, den der Laserstrahl überfährt, zu einer Denaturierung der DNA führen. Dies ermöglicht ein sehr schnelles Abtasten auch von großen Probenvolumina. Das komplette Abtasten einer Fläche von 1 cm² dauert z. B. bei einem Fokusdurchmesser von 78 μm und 128 Zeilen im Zeilenabstand von 78 μm und einer Zeilenlänge von 1 cm bei einer Geschwindigkeit des abtastenden Laserstrahls von 10 m/s nur 128 ms. Hat das Volumen z. B. eine Tiefe von 10 mm, kann so ein Volumen von 1 ml prozessiert werden (hierzu muss natürlich u. a. sichergestellt werden, dass die Intensität der Anregung über die gesamte Tiefe ausreichend hoch ist). Dies ist vorteilhafterweise wesentlich kürzer, als es ein Denaturierungsschritt durch globales Erhitzen in der Regel erfordern würde. Mit optischen Elementen wie z. B. einem in 3 gezeigten Spiegelscanner 19, der als galvanometrischer Scanner ausgeführt sein kann, und sogenannten F Theta Linsen können eine gute Homogenität der Fokusqualität und -größe über die gesamte abgetastete Probe 12 erreicht werden. Alternativ zu einem kontinuierlich emittierenden Laser 17 kann auch ein gepulster Laser 17 oder ein thermischer Strahler eingesetzt werden.
In 4 ist ein Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt, bei dem ein Laser 17, und ein Spiegel 20 unbeweglich angeordnet ist und der Laserstrahl des Lasers 17 durch den Spiegel 20 auf die Probe 12 gelenkt wird. Dabei ist die Probe 12 in zwei Dimensionen beweglich angeordnet, so dass durch Bewegung der Probe 12, die ganze Probe 12 oder große Teile der Probe 12 von dem Fokus des Lasers 17 erfasst werden können.
In 5 ist ein Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt, bei dem ein Laser 17 unbeweglich angeordnet ist und ein Spiegelscanner 19 den Laserstrahl des Lasers 17 in einer Richtung ablenken kann. Die Probe 12 ist dabei in einer Richtung beweglich angeordnet, so dass durch Bewegung des Spiegelscanners 19 und der Probe 12 die ganze Probe 12 oder große Teile der Probe 12 durch den Laserstrahl erfasst werden können.
Eine Möglichkeit zum Nachweis einer Nukleinsäure 1 durch erfindungsgemäße PCR ist in 6 dargestellt. Dabei befinden sich in einer Probe erste Nanopartikel 3, die an ihrer Oberfläche Füllmoleküle 10 F und erste Oligonukleotide 21 aufweisen. Die ersten Oligonukleotide 21 bestehen aus einer Spacersequenz 6 S und einer Primersequenz 5 A, wie in 6a gezeigt. Wenn ein Original 13 mit den Teilsequenzen A' und B' in der Probe 12 vorhanden ist, so hybridisiert das Original 13 auf die komplementäre Primersequenz 5 A auf einem der ersten Nanopartikel 3. Durch eine DNA-Polymerase 11 wird ausgehend von der Primersequenz 5 A das Komplement 14 mit den Teilsequenzen A und B geschrieben, so dass das Komplement 14 über die Spacersequenz 6 S mit der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 verbunden ist, wie in 6c gezeigt. In einem nächsten Schritt werden die in 6d gezeigten Testsonden 22 zur Probe gegeben. Die Testsonden 22 sind zweite Nanopartikel 23, die an ihrer Oberfläche Füllmoleküle 10 und zweite Oligonukleotide aufweisen. Die zweiten Oligonukleotide enthalten eine Spacersequenz 6 S und eine Testsequenz 5 B'. Die Testsequenz 5 B' kann mit der komplementären Teilsequenz B des Komplements 14 auf der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 hybridisieren, wie in 6f gezeigt. Dadurch werden erste Nanopartikel 3 und zweite Nanopartikel 23 verbunden, so dass eine messbare Veränderung entstehen kann. Wenn das Original 13 in der Probe 12 nicht vorhanden ist, so entsteht an der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 kein Komplement 14, wie in 6b zu sehen ist. Da sich auf den ersten Nanopartikeln 3 jedoch kein Komplement 14 befindet, können erste Nanopartikel 3 und zweite Nanopartikel 23 sich nicht verbinden und die messbare Veränderung entsteht nicht. Die Sequenz B' ist in dieser Ausführungsform komplementär zur Sequenz B, sie kann aber auch zu Teilen der Sequenz A komplementär sein. Die Spacersequenz 6 S auf den ersten Nanopartikeln 3 ist mit der Spacersequenz 6 S auf den zweiten Nanopartikeln 23 identisch. In einer weiteren Ausführungsform können jedoch auf den ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 23 auch unterschiedliche Spacersequenzen 6 verwendet werden. Es können auch mehrere unterschiedliche Spacersequenzen 6 auf derselben Sorte von Nanopartikeln verwendet werden. Die Puffer- und Hybridisierungsbedingungen, z. B. Temperatur, Salzkonzentrationen, Nanopartikelkonzentrationen, Konzentrationen sonstiger Pufferzusätze, pH-Wert, werden bevorzugt so gewählt, dass nur nach erfolgter Verlängerung der Primersequenz 5 A auf den ersten Nanopartikeln 3 eine Hybridisierung entstehen kann, die die ersten Nanopartikeln 3 mit den zweiten Nanopartikeln 23 verbindet. Die Verbindung der ersten Nanopartikel 3 mit den zweiten Nanopartikeln 23 kann z. B. als Rotverschiebung und Verbreiterung der Plasmonenresonanz im Extinktionsspektrum nachgewiesen werden. Die Verbindung kann auch z. B. durch Messung der Transmissionsänderung bei einer oder mehreren Wellenlängen nach optothermischer Anregung der Nanopartikel und hieraus resultierender Denaturierung der Nukleinsäuren 1, die die ersten Nanopartikel 3 mit den zweiten Nanopartikeln 23 verbinden, detektiert werden. Die Testsonden 22 können in einem speziellen Hybridisierungspuffer zur Verfügung gestellt werden, zu dem zumindest ein Teil der Probe 12, die die ersten Nanopartikel 3 enthält, nach dem Verfahrensschritt, der die Synthese des Komplements 14 ermöglicht, hinzugegeben wird. Die Testsonden 22 können auch bereits von Beginn des Verfahrens an in der Probe zusammen mit den ersten Nanopartikeln 3 vorliegen. In diesem Fall können die Testsonden 22 passiviert werden, so dass sie nicht als Primer 8 wirken. Das Passivieren der Testsonden 22 kann darin bestehen, dass die Primersequenz 5 auf den Testsonden 22 so gewählt wird, dass bei der Annealingtemperatur während der PCR keine Hybridisierung der genannten Primersequenz 5 mit dem Original 13 stattfindet, sondern erst nach anschließender Absenkung der Temperatur. Das Passivieren der Testsonden 22 kann auch so geschehen, dass die zweiten Oligonukleotide, die Teilsequenzen des Originals 13 enthalten, am 3'-Ende auf den zweiten Nanopartikeln 23 befestigt sind, so dass die DNA-Polymerase 11 die zweiten Oligonukleotide nicht verlängern kann. In diesem Fall können die zweiten Oligonukleotide an ihrem 5'-Ende frei sein oder mit den zweiten Nanopartikeln 23 verbunden sein. Die Testsonden 22 können auch dadurch passiviert sein, dass eine Basenmodifikation, z. B. mit Dideoxycytosin (ddC) am 3'-Ende der zweiten Oligonukleotide die Elongation verhindert.
In der Ausführung des Verfahrens, die in 6 gezeigt ist, werden erste Nanopartikel 3 aus Gold mit einem Durchmesser von 60 nm mit Oligonukleotiden 4 funktionalisiert (nach J. Hurst et al., Anal. Chem., 78(24), 8313–8318, 2006, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist). Dabei werden zu einem Teil Oligonukleotid 4 ID1 und als Füllmolekül 10 zu vier Teilen Oligonukleotid 4 ID2 eingesetzt. Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die ersten Nanopartikel 3 in einer Konzentration von 200 pM in einem PBS Puffer (20 mM PBS, 10 mM NaCl, 0,01% Tween 20, 0,01% Azid, 1 mM EDTA, pH 7,5) vor. Die Vervielfältigungsreaktion wird in einem Gesamtvolumen von 10 μl in 200 μl Probenröhrchen 24 durchgeführt (5 μl DreamTaq PCR Mastermix 2× (bezogen von Fermentas), 0,1 μl NaCl 5 M, 0,1 μl MgCl₂ 250 mM, 0,1 μl MgSO₄ 250 mM, 1 μl der funktionalisierten ersten Nanopartikel 200 pM, 1 μl Oligonukleotid 4 ID3 (als zu vervielfältigendes Original 13, dabei beträgt die zu bestimmende Konzentration des Originals 13 in dem Gesamtvolumen von 10 μl z. B. 0 pM, 10 pM, 20 pM oder 50 pM) gelöst in Wasser mit 100 nM Oligonukleotid 4 ID4 (Oligonukleotid 4 ID4 dient hierbei zur Absättigung von Oberflächen, z. B. während der Aufbewahrung des Original 13 vor der Reaktion), 2,7 μl Wasser).
Wie in 7 dargestellt, werden die Probenröhrchen 24 in einer Glasküvette 25 in einem Wasserbad 26 auf eine Temperatur von 65°C, was sowohl die Annealing- als auch die Elongationstemperatur darstellt, gebracht. Das Wasserbad 26 dient neben der Temperierung auch der besseren Einkopplung des Lasers 17 in die nicht-plane Oberfläche der Probenröhrchen 24. Das Wasser im Wasserbad 26 ermöglicht, dass der Brechungsindexunterschied zwischen dem Äußeren und dem mit PCR-Reaktionsmix gefüllten Inneren der Probenröhrchen 24 reduziert wird und somit eine Brechung des Laserstrahls und damit ein negativer Einfluss auf die Fokusqualität und -schärfe unterdrückt wird. Dadurch wird mit Vorteil das Einkoppeln des Lasers 17 verbessert. Der Laser 17, der zum Anregen der Nanopartikel dient, ist ein frequenzverdoppelter diodengepumpter Nd:YAg-Laser (Coherent Verdi V10), der bei einer Ausgangsleistung von 1,5 W mit einer F-Theta-Linse (Jenoptik, Brennweite 100 mm) hinter einem Spiegelscanner 19 (Cambridge Technologies, Pro Series 1) in die Probenröhrchen 24 im Wasserbad 26 fokussiert wird (Fokusdurchmesser circa 20 μm). Der Spiegelscanner 19 erlaubt, den Fokus zeilenweise durch die Probenröhrchen 24 zu bewegen, wie auch schon in 3 gezeigt, und somit das gesamte PCR-Reaktionsvolumen an der optothermischen Vervielfältigung zu beteiligen. Pro Probenröhrchen 24 werden 400 Zeilen mit einem Abstand von circa 12 μm bei einer Zeilengeschwindigkeit in dem Probenröhrchen 24 von circa 2 m/s mit dem Fokus abgefahren. Dies entspricht einem Zyklus im ersten Probenröhrchen 24. Anschließend werden nacheinander alle anderen Probenröhrchen 24 abgefahren, so dass jedes Probenröhrchen 24 einen Zyklus erfahren hat. Nach einer Wartedauer von 40 s nach dem Durchfahren des ersten Probenröhrchens 24 wird der nächste Zyklus gestartet und dies so oft wiederholt, bis jedes Probenröhrchen 24 insgesamt 25 Zyklen durchlaufen hat. Als Ausgangskonzentration des Originals 13 wird im ersten Probenröhrchen 24 0 pM, im zweiten Probenröhrchen 24 20 pM und im dritten Probenröhrchen 24 50 pM gewählt. Zur Negativkontrolle wird ein viertes Probenröhrchen 24 in das Wasserbad 26 eingesetzt, das ebenfalls das Original 13 in einer Konzentration von 50 pM aufweist, aber nicht vom Laserstrahl getroffen wird. Nachdem das erste, zweite und dritte Probenröhrchen 24 25 Zyklen durchlaufen hat, werden alle vier Probenröhrchen 24 aus dem Wasserbad 26 entfernt. Zur Untersuchung des Effektes der Laserzyklen und der Konzentration des Originals 13 dient eine Testsonde 22, die unter den gewählten Puffer- und Hybridisationsbedingungen nur auf die durch Verlängerung der nanopartikelgebundenen Primer 8 entstandenen Teilsequenzen hybridisieren kann. Dabei ist die Verlängerung der Primer 8 komplementär zum Original 13, wie in 6c gezeigt. Zur Herstellung der Testsonden 22 werden zweiten Nanopartikel 23 aus Gold mit einem Durchmesser von 60 nm mit Oligonukleotiden 4 funktionalisiert (nach J. Hurst, supra). Dabei wird zu einem Teil Oligonukleotid 4 ID5 und als Füllmolekül 10 zu vier Teilen Oligonukleotid 4 ID2 eingesetzt. Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die zweiten Nanopartikel 23 in einer Konzentration von 200 pM in einem PBS Puffer (20 mM PBS, 10 mM NaCl, 0,01% Tween 20, 0,01% Azid, 1 mM EDTA, pH 7,5) vor. Für die Hybridisierung der Oligonukleotide 4 auf den ersten Nanopartikeln 3 mit den Oligonukleotiden 4 auf den zweiten Nanopartikeln 23 wird ein modifizierter Phosphatpuffer eingesetzt (13 mM PBS, 200 mM NaCl, 0,02% Tween 20, 1 mM EDTA, 20 mM Natriumcitrat, 1 μg/ml PVP10, pH 7,5). 10 μl Hybridisierungsansatz enthalten 2,25 μl des modifizierten Phosphatpuffers, 3 μl Formamid, 2 μl NaCl 5M, 0,25 μl der 200 pM Testsonden-Lösung und 2,5 μl der entsprechenden PCR-Lösung aus der optothermischen Vervielfältigung, die die ersten Nanopartikel 3 enthält. Falls in dem Probenröhrchen eine ausreichende Menge des Originals 13 mit der Sequenz ID3 vorlag, so wird auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 das Oligonukleotid 4 mit der Sequenz ID1 verlängert und kann mit dem Oligonukleotid 4 mit der Sequenz ID5 auf der Oberfläche der Testsonde 22 hybridisieren, wie in 6f dargestellt. Der Nachweis dieser Hybridisierung erfolgt mittels optothermischer Anregung der Nanopartikel (nach EP 2162549 , dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist). Die Probenröhrchen 24 werden dazu, wie in 12 dargestellt, mit Pulsen eines ersten Lasers 28 beschossen (50 μs Pulsdauer, 532 nm Wellenlänge, circa 700 mW Spitzenleistung, Fokusdurchmesser circa 30 μm). Hierdurch werden die Nanopartikel optothermisch erhitzt und geben Wärme an ihre Umgebung ab. Falls erste Nanopartikel 3 und zweite Nanopartikel 23 durch die Hybridisierung von Oligonukleotiden 4, wie in 6f dargestellt, verbunden sind, so werden sie durch den Laserpuls getrennt. Dies kann durch einen in 12 dargestellten zweiten Laser 29 (Wellenlänge hier 630 nm, Leistung 5 mW kontinuierlich) nachgewiesen werden, dessen Fokus (30 μm Durchmesser) mit dem Fokus des ersten Lasers 28, der vorzugsweise ausschließlich zum Dehybridisieren genutzt wird, überlagert wird und der die Extinktion vor und nach dem Laserpuls des ersten Lasers 28 abfragt. Der optische Pfad auf dem die Extinktionsänderung optothermisch induziert und gemessen wird beträgt circa 2 mm. Die Intensität des durch diese Schicht transmittierten Lichts des zweiten Lasers 29 wird mit einer Photodiode 30 gemessen. Aus der Differenz des Photodiodenstromes vor und nach dem Puls wird die optothermisch induzierte Transmissionsänderung bestimmt, die durch das Dehybridisieren der verlängerten ersten Oligonukleotide und zweiten Oligonukleotide zwischen den Nanopartikeln und das darauffolgende Auseinanderdiffundieren der Nanopartikel erzeugt wird.
In 8a ist die relative Transmissionsänderung gezeigt, die durch den Laserpuls des ersten Lasers 28 und die hierdurch entstehende Dehybridisierung der Oligonukleotide 4 zwischen den ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 23 erzeugt wird und Maß für das Vorhandensein von Gold-DNA-Gold-Bindungen in dem Probenröhrchen 24 ist. Unterhalb des Diagramms in 8a ist in einer ersten Zeile die Anzahl der durchlaufenen Zyklen zu sehen. In einer zweiten Zeile, die unterhalb der ersten Zeile liegt, ist die Konzentration des Originals 13 in pM im Probenröhrchen 24 vor der Durchführung der Vervielfältigung dargestellt. Gezeigt sind auf der rechten Seite des Diagramms in 8a im Abschnitt B von links nach rechts das erste, zweite und dritte Probenröhrchen 24, das jeweils 25 optothermische Zyklen durchlaufen hat sowie das vierte Probenröhrchen 24 ohne optothermische Behandlung. Hier ist deutlich zu sehen, dass die gemessene Transmissionsänderung als Indikator für Gold-DNA-Gold-Bindungen mit steigender Konzentration des Originals 13 vor der Vervielfältigung ansteigt, wenn die 25 Zyklen durchlaufen wurden. Für das erste Probenröhrchen 24 ohne Original 13 und das vierte Probenröhrchen 24 ohne optothermische Behandlung ist nur eine geringe Transmissionsänderung zu beobachten. Dies zeigt, dass hier keine Verlängerung der Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 stattgefunden hat und somit auch keine Bindung zur Testsonde 22 möglich ist. Lediglich nach dem Durchlaufen der optothermischen Zyklen und bei Vorhandensein des Originals 13 kann es zu einer Verlängerung der Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 durch die DNA-Polymerase 11 kommen, was zu einer Verbindung der ersten Nanopartikel 3 mit den zweiten Nanopartikeln 23 und schließlich zu einer Transmissionsänderung als Folge der optothermisch induzierten Trennung der Nanopartikel führt.
Als Vergleich ist in 8a im Abschnitt A auf der linken Seite das Ergebnis eines analogen Experimentes zu sehen, bei dem das Erhitzen der DNA jedoch nicht lokal durch optothermische Anregung der Nanopartikel 9, sondern global für das gesamte Reaktionsvolumen 2 in einem herkömmlichen Thermocycler (Labnet Multi Gene II) erfolgt. Hier werden von links nach rechts das erste bis vierte Probenröhrchen 24 gezeigt, deren Inhalt identisch zu dem im vorigen Absatz beschriebenen Experiment ist. Erstes, zweites und drittes Probenröhrchen 24 wurden einem klassischen PCR-Protokoll unterzogen (93°C für 1 s, 53°C für 20 s, 35 Zyklen). Wie bei der optothermischen Erhitzung ist auch hier zu sehen, dass je mehr Original 13 vor der Vervielfältigung in dem jeweiligen Probenröhrchen 24 vorhanden war, desto größer die gemessene Transmissionsänderung ausfällt, die durch den Laserpuls und die hierdurch dehybridisierende DNA zwischen den ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 23 erzeugt wird und das Maß für das Vorhandensein von Gold-DNA-Gold-Bindungen in der Lösung ist. Das vierte Probenröhrchen 24, das zwar 50 pM des Originals 13 enthält, aber nicht zyklisch erhitzt wurde, zeigt nahezu keine Transmissionsänderung. Hier wurde also nicht in einem ausreichenden Umfang Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 verlängert.
8b zeigt ein ähnliches Experiment mit globaler Erhitzung des gesamten Reaktionsvolumens 2, jedoch bei konstanter Konzentration des Originals 13 im Probenröhrchen 24 von 10 pM vor der Vervielfältigung (zweite Zeile unterhalb des Diagramms) und ansteigender Zyklenzahl (erste Zeile unterhalb des Diagramms). Hier ist deutlich zu sehen, dass mit steigender Zyklenzahl auch die gemessene Transmissionsänderung größer wird, ein klares Zeichen dafür, dass umso mehr Primer auf den ersten Nanopartikeln 3 verlängert werden, je mehr Zyklen durchlaufen werden und somit ein klares Zeichen dafür, dass der Ursprung des gemessenen Signals tatsächlich die erfolgte Elongation der Oligonukleotide 4 auf den ersten Nanopartikeln 3 durch die DNA-Polymerase 11 ist.
Eine weitere Möglichkeit, die erfolgte Vervielfältigung nachzuweisen, ist in 9 dargestellt. 9a und 9c fassen die exponentielle Vervielfältigung unter Verwendung eines gelösten Rückwärtsprimers 16 B' zusammen, wie sie schon in 1a bis 1h gezeigt ist. Zusätzlich befinden sich in der Probe 12 Testsonden 22. Die Testsonden 22 bestehen in diesem Ausführungsbeispiel aus zweiten Nanopartikeln 23, die auf ihrer Oberfläche neben optionalen Füllmolekülen 10 F auch mit der Testsequenz 31 A' funktionalisiert sind. Optional kann zwischen der Testsequenz 31 A' und der Oberfläche der zweiten Nanopartikel 23 noch eine Spacersequenz 6 S sein, die nicht identisch mit der Spacersequenz 6 S auf den ersten Nanopartikeln 3 aus 1 oder 9a sein muss und eine optionale abasische Modifikation 7 zwischen Testsequenz A' und Spacersequenz 6 S. Die Testsequenz A' ist zumindest zu einem Teil der Primersequenz 5 A auf den ersten Nanopartikeln 3 komplementär. Die Testsequenz A' tritt gegenüber der Primersequenz 5 A in Konkurrenz mit den in dem Verfahren in 1a bis 1h gebildeten Kopien des Originals 13 mit der Teilsequenz A'. Das heißt, wenn viele Kopien des Originals 13 vorhanden sind, dann sind die Primersequenzen 5 A auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 bereits mit den Teilsequenzen A' der Kopien des Originals 13 besetzt. Die Primersequenzen 5 A können dann nicht oder nur in geringem Umfang mit den Testsequenzen A' auf den zweiten Nanopartikeln 23 hybridisieren. Damit werden die ersten Nanopartikel 3 mit den zweiten Nanopartikeln 23 nicht oder nur in einem geringem Ausmaß verbunden. Wie in 9c dargestellt, sind die elongierten Primersequenzen 5 A auf den ersten Nanopartikeln 3 hybridisiert mit dem Original 13 und seinen Kopien und bilden damit starre, doppelsträngige DNA, die ein sterisches Hindernis darstellen kann, auch dadurch wird ein Verbinden von ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 23 bei hoher Zahl von Kopien des Originals 13 verhindert. Bei Abwesenheit oder geringer Zahl von Original 13 und Kopien des Originals 13, liegen die ersten Nanopartikel 3 überwiegend mit unbesetzten Primersequenzen 5 A vor, wie in 9b gezeigt. Nun können die Testsequenzen 31 der Testsonden 22 mit den unbesetzten Primersequenzen 5 A auf den ersten Nanopartikeln 3 hybridisieren. Dabei werden die ersten mit den zweiten Nanopartikeln 23 verbunden, wie in 9b gezeigt. In dieser Ausführungsform ist das Ausmaß der Verbindung von ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 23 umso schwächer, je mehr Kopien des Originals 13 durch die Vervielfältigungsreaktion entstanden sind, was wiederum von der Konzentration des Originals 13 zu Beginn der Vervielfältigungsreaktion abhängt. Die Puffer- und Hybridisierungsbedingungen (z. B. Temperatur, Salzkonzentrationen, Nanopartikelkonzentrationen und -größen, Konzentrationen sonstiger Pufferzusätze, pH-Wert) werden so gewählt, dass bei erfolgter spezifischer Verlängerung der Primersequenz 5 A und erfolgter Synthese von Kopien des Originals 13 eine möglichst effiziente Unterdrückung der Hybridisierung der Primersequenzen 5 A mit den Testsequenzen 31 A' stattfindet. Zugleich werden die genannten Bedingungen so gewählt, dass bei nicht erfolgter Vervielfältigung eine möglichst effiziente Hybridisierung der Primersequenzen 5 A mit den Testsequenzen 31 A' entsteht. Die aus der Hybridisierung resultierende Verbindung von ersten Nanopartikeln 3 mit zweiten Nanopartikeln 23 kann z. B. als Rotverschiebung und Verbreiterung der Plasmonenresonanz im Extinktionsspektrum nachgewiesen werden oder durch Messung der Transmissionsänderung bei einer oder mehreren Wellenlängen nach optothermischer Anregung der Nanopartikel und hieraus resultierender Denaturierung der nanopartikelverbindenden DNA. Alternativ kann der Nachweis beziehungsweise eine Quantifizierung der in dem Verfahren erzeugten Kopien des Originals 13 z. B. auch durch PCR, Realtime-PCR, quantitative Realtime-PCR, Gel-Elektrophorese oder mittels farbstoffgelabelten Sonden erfolgen. Die Testsonden 22 können passiviert werden, so dass sie nicht als Primer 8 wirken. Das Passivieren der Testsonden 22 kann darin bestehen, dass die Testsequenz 31 auf den Testsonden 22 so gewählt wird, dass bei der Annealingtemperatur während der PCR keine Hybridisierung der genannten Testsequenz 31 mit dem Original 13 stattfindet, sondern erst nach anschließender Absenkung der Temperatur. Das Passivieren der Testsonden 22 kann auch so geschehen, dass die Testsequenzen 31 am 3'-Ende auf den zweiten Nanopartikeln 22 befestigt sind, so dass die DNA-Polymerase 11 die Testsequenzen nicht verlängern kann. In diesem Fall können die Testsequenzen 31 an ihrem 5'-Ende frei sein oder mit den zweiten Nanopartikeln 23 verbunden sein. Die Testsonden 22 können auch dadurch passiviert sein, dass eine Basenmodifikation, z. B. mit Dideoxycytosin (ddC) am 3'-Ende der Testsequenzen 31 die Elongation verhindert. Die Testsonden 22 können auch erst nach Abschluss der optothermischen Vervielfältigungsreaktion zur Probe 12 hinzugegeben werden.
Für die in 9 dargestellte Ausführung des Verfahrens werden erste Nanopartikel 3 aus Gold mit einem Durchmesser von 60 nm mit Oligonukleotiden 4 funktionalisiert, wie schon in dem in 6 gezeigten Ausführungsbeispiel, jedoch nun mit Oligonukleotiden ID6. Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die ersten Nanopartikel 3 in einer Konzentration von 200 pM in einem PBS Puffer (5 mM PBS, 10 mM NaCl, 0,01% Tween 20, pH 7,5) vor. Zur Herstellung der Testsonden 22 werden zweiten Nanopartikel 23 aus Gold mit einem Durchmesser von 10 nm mit Oligonukleotiden 4 ID7 funktionalisiert (nach J. Hurst, supra), die mit Dideoxycytosin (ddC) am 3'-Ende terminiert sind. Nach Funktionalisierung und 6 Waschschritten liegen die zweiten Nanopartikel 23 in einer Konzentration von 8 nM in einem PBS Puffer (5 mM PBS, 10 mM NaCl, 0,01% Tween 20, pH 7,5) vor. Die Vervielfältigungsreaktion wird in einem Gesamtvolumen von 20 μl in einer Multiwellplatte 32 mit transparentem Boden (geliefert von Greiner Bio One) durchgeführt (4 μl Apta Taq Mastermix 5× mit MgCl2 (bezogen von Roche), 2 μl NaCl 450 mM, 2 μl MgCl2 90 mM, 2 μl Tween 20 1%ig, 2 μl Tetramethylammoniumchlorid, 50 mM, 2 μl Wasser, 2 μl der funktionalisierten ersten Nanopartikel 200 pM, 1 μl der funktionalisierten zweiten Nanopartikel 8 nM, 1 μl Oligonukleotid 4 ID8 als gelöster Rückwärtsprimer und 2 μl Targetsequenz als zu vervielfältigendes Original 13. Dabei befinden sich im Gesamtvolumen z. B. 2E7, 2E6, 2E5, 2E4, 2E3, 2E2 Kopien genomischer DNA des Bakteriums E. coli (Escherischia coli), das als Teilsequenz das Original 13 enthält in der Probe 12, bzw. 2E7 Kopien genomischer DNA des Bakteriums MRSA (Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus), das das Original 13 nicht enthält in der Probe 12. Die genomische DNA von Escherischia coli und MRSA wurde zuvor mit einem kommerziellen Extraktionskit (Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit) aus E. coli Bakterien bzw. MRSA-Bakterien extrahiert. Die so gewonnene genomische DNA wurde zur Lagerung eingefroren und vor Einsetzen in die Vervielfältigungsreaktion für 10 Minuten bei 99°C hitzebehandelt.
Wie in 10 dargestellt, wird die Multiwellplatte 32 mit einer Transparenten Folie 33 (geliefert von Carl Roth) verschlossen. Die Multiwellplatte 32 wird von unten mit einem ersten Heizblock 34 in Verbindung gebracht, der Aussparungen 35 derart enthält, dass der Laser 17 ungehindert den transparenten Boden der Multiwellplatte erreichen kann. Durch Temperierung des ersten Heizblockes 34 kann die globale Probentemperatur eingestellt werden, die sowohl Annealing- als auch die Elongationstemperatur darstellt. Die Folie 33 wird mit einem zweiten Heizblock 36 in Verbindung gebracht, der ebenfalls Aussparungen 35 derart enthält, dass sich der Laser nach durchqueren der Probe ungehindert ausbreiten kann. Der zweite Heizblock 36 soll verhindern, dass ein Teil der Probe an der Folie 33 kondensieren kann. Die Temperatur des zweiten Heizblockes 36 wird vorzugsweise mindestens so hoch gewählt wie die des ersten Heizblockes 34, besonders vorzugsweise mindestens 5°C höher und ganz besonders vorzugsweise mindestens 10°C höher als die des ersten Heizblocks. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel beträgt die Temperatur des ersten Heizblockes 62°C, die des zweiten Heizblockes 80°C Unter diesen Bedingungen findet keine Hybridisierung zwischen Testsequenz 24 und Primersequenz 5 statt, somit werden erste Nanopartikel 3 und zweite Nanopartikel 23 nicht miteinander verbunden und die Primersequenz 5 wird für die Vervielfältigungsreaktion nicht blockiert. Bei geringeren Temperaturen, die z. B. während des Mischens der Reaktionskomponenten herrscht, können die ersten Nanopartikel 23 und die Primersequenzen 5 teilweise oder ganz durch die Testsequenzen 31 und die Testsonden 22 blockiert und somit vor unspezifischen Bindungen und Hybridisierungen geschützt sein. Dies kann vorteilhaft für die Spezifität der Vervielfältigungsreaktion genutzt werden. Der Laser 17, der zum Anregen der Nanopartikel dient, ist ein frequenzverdoppelter diodengepumpter Nd:YAg-Laser (Excel, Laser-Quantum), der bei einer Ausgangsleistung von 1,8 W mittels eines Teleskops ca. 3fach aufgeweitet und dann mit einer telezentrischen F-Theta-Linse (Qioptiq, Brennweite 100 mm) hinter einem Spiegelscanner 19 (Cambridge Technologies, Pro Series 1) in die Multiwellplatte 32 fokussiert wird (Fokusdurchmesser circa 20 μm). Der Spiegelscanner 19 erlaubt, den Fokus zeilenweise durch die Multiwellplatte 32 zu bewegen, wie auch schon in 3 gezeigt, und somit das gesamte PCR-Reaktionsvolumen an der optothermischen Vervielfältigung zu beteiligen. Pro Well werden 250 Zeilen mit einem Abstand von circa 15 μm bei einer Zeilengeschwindigkeit im Well von circa 8 m/s mit dem Fokus abgefahren. Dies entspricht einem Zyklus im ersten Well. Anschließend werden nacheinander alle anderen Wells abgefahren, so dass jedes Well einen Zyklus erfahren hat. Nach einer Wartedauer von 3 s nach dem Durchfahren des ersten Wells wird der nächste Zyklus gestartet und dies so oft wiederholt, bis jedes Well insgesamt 210 Zyklen durchlaufen hat.
Es werden 6 Wells untersucht, die in 11 von links nach rechts dargestellt sind. Das erste Well enthält als Kontrolle in der Probe 2E7 Kopien genomischer DNA des Bakteriums MRSA (Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus), das das Original 13 nicht enthält. In den zweiten bis sechsten Wells liegen in der Probe 2E7, 2E6, 2E5, 2E4, 2E3, bzw. 2E2 Kopien genomischer DNA des Bakteriums E. coli, das als Teilsequenz das Original 13 enthält, vor. Nachdem alle sieben Wells jeweils 210 Zyklen durchlaufen haben und die optothermische Vervielfältigungsreaktion beendet ist, wird die Temperatur des ersten Heizblocks 34 auf 52°C reduziert, die des zweiten Heizblocks 36 auf 62°C. Unter diesen Bedingungen kann eine Hybridisierung zwischen Testsequenz 24 und Primersequenz 5 stattfinden, wenn keine oder nur wenige Originale 13 in der Probe vorhanden waren und somit die Primersequenzen 5 nicht oder nur in geringem Umfang durch Kopien des Originals 13 blockiert werden. In diesem Fall werden erste Nanopartikel 3 und zweite Nanopartikel 23 miteinander verbunden, wie in 9b dargestellt. Wenn viele Kopien des Originals 13 vorhanden sind, dann sind die Primersequenzen 5 A auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 bereits mit den Teilsequenzen A der Kopien des Originals 13 besetzt. Die Primersequenzen 5 A können dann nicht oder nur in geringem Umfang mit den Testsequenzen A' auf den zweiten Nanopartikeln 23 hybridisieren. Damit werden die ersten Nanopartikel 3 mit den zweiten Nanopartikeln 23 nicht oder nur in einem geringem Ausmaß verbunden. Wie in 9c dargestellt, sind die elongierten Primersequenzen 5 A auf den ersten Nanopartikeln 3 hybridisiert mit dem Original 13 und seinen Kopien und bilden damit starre, doppelsträngige DNA, die ein sterisches Hindernis darstellen kann, auch dadurch wird ein Verbinden von ersten Nanopartikeln 3 und zweiten Nanopartikeln 23 bei hoher Zahl von Kopien des Originals 13 verhindert. Der Nachweis der Hybridisierung erfolgt mittels optothermischer Anregung der Nanopartikel (nach EP 2162549 , dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist). Die Wells werden dazu, wie in 10 dargestellt, mit Pulsen eines Lasers 17 beschossen (50 μs Pulsdauer, 532 nm Wellenlänge, circa 1 W Spitzenleistung, Fokusdurchmesser circa 20 μm). Hierdurch werden die Nanopartikel optothermisch erhitzt und geben Wärme an ihre Umgebung ab. Falls erste Nanopartikel 3 und zweite Nanopartikel 23 durch die Hybridisierung von Oligonukleotiden, wie in 9b dargestellt, verbunden sind, so werden sie durch den Laserpuls getrennt. Dies kann dadurch nachgewiesen werden, dass der Laser 17 bei geringer Leistung (ca. 50 mW kontinuierlich) die Extinktion vor und nach dem intensiven Laserpuls des Lasers 17 abfragt. Der optische Pfad auf dem die Extinktionsänderung optothermisch induziert und gemessen wird beträgt circa 1 mm. Die geringe Leistung während der Extinktionsmessung verhindert das Dehybridisieren der Primersequenz 5 und der Testsequenz 31, das nur durch den intensiven Laserpuls induziert werden soll. Die Verwendung von nur einem Laser sowohl zur Extinktionsmessung als auch zur optothermischen Dehybridisierung erspart vorzugsweise Kosten und eine Überlappung zweier Laserfoki. Die Intensität des durch diese Schicht transmittierten Lichts des Lasers 17 wird mit einer Photodiode 30 gemessen, nachdem das transmittierte Licht des Lasers 17 an einer Streuscheibe 27 gestreut wird. Dabei erreicht die Streuscheibe, dass ein Teil des Licht, das durch die verschiedenen Wells transmittiert wurde, stets auf den Detektor fällt. Aus der Differenz des Photodiodenstromes vor und nach dem Puls wird die optothermisch induzierte Transmissionsänderung bestimmt, die durch das Dehybridisieren der Primersequenz 5 und der Testsequenz 24 zwischen den Nanopartikeln 8 und das darauffolgende Auseinanderdiffundieren der Nanopartikel 8 erzeugt wird. Das Ergebnis der optothermisch induzierten Änderung der Transmission ist in 11 dargestellt. Der erste Balken zeigt die Messung eines Wells mit genomischer DNA des Bakteriums MRSA, das das Original 13 nicht als Teilsequenz enthält in der Probe. Hier sind die Primersequenzen nicht durch Kopien des Originals besetzt, somit verbinden sich erste Nanopartikel 3 und zweite Nanopartikel 23 miteinander und eine deutliche Transmissionsänderung ist detektierbar. Die folgenden Balken zeigen die Messungen der Wells, die genomische DNA des Bakteriums E. coli enthalten, die als Teilsequenz das Original 13 enthält. Hier ist die Unterdrückung der Hybridisierung und somit die Unterdrückung der Transmissionsänderung um so größer ist, je mehr genomische DNA des Bakteriums E. coli, das als Teilsequenz das Original 13 enthält in der Probe 12 ist.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
Bezugszeichenliste

1: Nukleinsäure
2: Reaktionsvolumen
3: erste Nanopartikel
4: Oligonukleotid
5: Primersequenz
6: Spacersequenz
7: Abasische Modifikation
8: Primer
9: Nanopartikel
10: Füllmolekül
11: DNA-Polymerase
12: Probe
13: Original
14: Komplement
15: Vorwärtsprimer
16: Rückwärtsprimer
17: Laser
18: Lichtquelle
19: Spiegelscanner
20: Spiegel
21: erste Oligonukleotide
22: Testsonde
23: zweite Nanopartikel
24: Probenröhrchen
25: Glasküvette
26: Wasserbad
27: Streuscheibe
28: erster Laser
29: zweiter Laser
30: Photodiode
31: Testsequenz
32: Multiwellplatte
33: Folie
34: erster Heizblock
35: Aussparung
36: zweiter Heizblock

Sequenzen

/iSp9/ = abasische Modifikation Spacer9
/ddC = Dideoxycytidine

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren (1) in einer Probe (12), wobei das Verfahren einen Vervielfältigungsschritt zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren und einen Testschritt zum Bestimmen der Konzentration der Produkte des Vervielfältigungsschritts umfasst und wobei entweder der Probe (12) in dem Testschritt keine Stoffe zugeführt werden oder der Testschritte nach dem Ende des Vervielfältigungsschritts beginnt und wenigstens einem Teil der Probe in dem Testschritt Stoffe zugeführt werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Vervielfältigen mittels einer Polymerase-Kettenreaktion erfolgt, bei der ein Zyklus bestehend aus den Schriften Denaturierung, Annealing und Elongation wiederholt durchlaufen wird, wobei bei wenigstens einem der Durchläufe die Zyklusdauer t_c kürzer als 40 Sekunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Stoffe Reaktionspartner sind, die die Reaktionsbedingungen für den Testschritt verbessern.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Vervielfältigen Nanopartikel (9) verwendet werden, die jeweils mit mindestens einem Oligonukleotid konjugiert sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine globale Temperatur der Probe (12) während des Testschritts unterschiedlich zu einer globalen Temperatur des Vervielfältigungsschritts ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine globale Temperatur der Probe (12) während des Testschritts im Wesentlichen gleich zu einer globalen Temperatur des Vervielfältigungsschritts ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Testschritt zur Bestimmen der Konzentration der Produkte des Vervielfältigungsschritts Testsonden (22) verwendet werden, die einen Nanopartikel (23) aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel (23) der Testsonden (22) eine andere Größe als Nanopartikel (9) aufweisen, die im Vervielfältigungsschritt zum Vervielfältigen der Nukleinsäuren (1) verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Nanopartikel (8) in einem Reaktionsvolumen (2) durch Anregung Wärme an ihre Umgebung übertragen.