DE102010008353A1

DE102010008353A1 - Archaea und daraus erhaltene Lipidzusammensetzungen

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Publication number: DE102010008353A1
Application number: DE102010008353A
Authority: DE
Inventors: Dirk Zimmermann; Elke Majewski; Prof. Dr. Patzelt Heiko; Dr. Sachse Jörg-Heino; Christine Stoll
Original assignee: K+S AG
Current assignee: K+S AG
Priority date: 2010-02-17
Filing date: 2010-02-17
Publication date: 2011-09-08
Anticipated expiration: 2030-02-18
Also published as: WO2011100955A1; AR080202A1; CA2824398A1; CL2013002237A1; IL227349A0; US20140084207A1; EA031579B1; AU2011217656B2; EA201391088A1; AU2011217656A1; IL227349B; ZA201309758B; US20160265016A1; EP2625265A1; DE102010008353B4; NZ612310A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen, genauer Archaea, die bei Kultivierung bei 25°C ungesättigte Etherlipide in Mengen von mindestens 10% bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipiden aufweisen. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Mikroorganismen innerhalb der Archaea, insbesondere aus solchen der Klasse Halomebacteria, insbesondere der Ordnung Halobacteriales, insbesondere der Familie Halobacteriaceae, insbesondere der Gattung Haloarcula bzw. Haloferax erhältlichen Lipidzusammensetzungen. Diese Lipidzusammensetzungen, insbesondere Liposomen, sind durch das Vorhandensein von großen Mengen an ungesättigten Etherlipiden gekennzeichnet. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung dieser ungesättigten Etherlipide aus den genannten Archaea.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen, genauer Archaea, die durch Kultivierung bei 25°C ungesättigte Etherlipide in Mengen von mindestens 10% bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipid(en) aufweisen. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf aus diesen Archaea, insbesondere aus solchen der Klasse Halomebacteria, der Ordnung: Halobacteriales, der Familie: Halobacteriaceae, insbesondere der Gattung Heloarcula bzw. Haloferax erhältliche Lipidzusammensetzungen. Diese Lipidzusammensetzungen, insbesondere Liposomen, sind durch das Vorhandensein von großen Mengen an ungesättigten Etherlipiden gekennzeichnet. in einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung dieser ungesättigten Etherlipide aus den genannten Archaea.
Stand der Technik
Archaea, auch als Archebakterien bezeichnet, bilden neben den Bacteria und den Eukaryota eine der drei Domänen zellulärer Lebewesen. Archaea sind einzellige Organismen ohne Zellkern mit einem meist in sich geschlossenen DNA-Molekül. Von den Bacteria unterscheiden sie sich durch deutliche Unterschiede in der Sequenz der ribosomalen 16S RNA, aber auch durch andere genetische, physiologische, strukturelle und insbesondere auch biochemische Eigenschaften.
Viele Arten der Archaea sind an extreme Milieubedingungen angepasst. In die Gruppe der Archaea fallen thermophile Mikroorganismen, halophile Mikroorganismen, acidophile aber auch alkaliphile Mikroorganismen.
Obwohl die Archaea in einigen Bereichen große Ähnlichkeit zu den anderen Prokaryoten, den Bacteria, aufweisen, besitzen sie viele einzigartige Eigenschaften. Eine hiervon zeigt sich zum Beispiel in dem Aufbau der Zellhülle der Archaea. Sie besteht aus einer von Phospho- und Glykolipiden gebildeten Doppelschicht (Bilayer), und einer darüber liegenden kristallinen Oberflächenschicht (S-Layer beziehungsweise Surface-Layer). Archaea enthalten im Gegensatz zu Bacteria kein Murein (Peptidoglycan) und können in der Ausgestaltung der Doppelschichten sehr vielfältig sein. Auch die Zusammensetzung der Archaea-Plasmamembran unterscheidet sich. In Bacteria und Eukaryota sind Fettsäuren über eine Ester-Bindung an Glycerin gebunden. Bei Archaea findet man eine mit Glycerol-Diethern aufgebaute doppelschichtige Membran und in deren hydrophoben Ketten aus Isopren-Einheiten stammende Fettalkohole, statt einfachen Fettsäuren. Bemerkenswert sind darüber hinaus die Transmembranlipide, die aus Diolen mit doppelt langen Ketten gebildet werden, die auf beiden Seiten der Membran mit Glycerin zu Diglycerol-Tetraethern verethert sind und damit die Membran zusätzlich stabilisieren. So besitzen zum Beispiel hyperthermophile Archaea häufig solche stabilisierte Membranen mit Diglycerol-Tetraethern. Bei halophilen Archaea haben die S-Layer eine formstabilisierende Funktion inne. Alle Membranlipide sind üblicherweise Derivate eines C₂₀-C₂₀-Dialkylglycerol-Diethers, des sn-2,3-Diphytanylglycerol-Diethers (Archaeol).
Phospholipide der halophilen Archaea enthalten als Hauptkomponente Phosphatidylglycerol-Phosphat-Methyl-Ester (PGP-Me), Phosphatidylglycerol-Phosphat (PGP), sowie als Komponenten mit üblicherweise geringeren Anteilen Phosphatidylglycerol (PG), Phosphatidylglycerolsulphat (PGS) und Phosphatidsäure (PA). Die Glycolipide beinhalten hauptsächlich Diglycosylarchaeol, welches einfach oder zweifach sulphatisiert sein kann, sulphatisiertes Triglycosylarchaeol (S-TGA), sowie Triglycosylarchaeol (TGA) und sulphatisiertes Tetraglycosylarchaeol (S-TeGA). Die Zuckereinheiten bestehen üblicherweise aus den Hexosen Glucose, Mannose oder Galactose Die Galaktosereste können sowohl als Furanose als auch als Pyranose vorliegen.
Archaea, deren Bestandteile und deren Verwendung wurden bereits verschiedentlich beschrieben. So ist aus der WO93/08202 die Bildung von stabilen Liposomen aus Lipidextrakten von Archaea bekannt. Dort werden neue, aus methanogenen und extrem halophilen Vertretern von Archaea isolierte Etherlipide beschrieben, z. B. gesättigte Etherlipide, insbesondere Derivate von C₂₀-C₂₀-Dialkylglycerol-Diethern. Beschrieben werden in diesem Dokument weiterhin Liposomen aus Archaea, insbesondere Liposomen, die den Gesamtextrakt der polaren Lipide von methanogenen Archaea und halophilen Archaea umfassen. Als Einsatzbereich solcher Liposomen werden einerseits die Verwendung als Werkzeug in der Forschung andererseits deren Einsatz als Adjuvanzien oder Träger von Wirkstoffen, Insektiziden, genetischen Materialien oder Enzymen, aber auch als Kosmetika genannt.
Kosmetische Zubereitungen, die inaktivierte Zellen oder Zellhüllen von halophilen oder halotoleranten Mikroorganismen beinhalten, werden in der WO2004/103332 offenbart. Diese kosmetischen Zubereitungen weisen Zellhüllen, beziehungsweise inaktivierte Zellen, erhältlich aus der Biomasse oder aus einem Extrakt, auf und werden insbesondere erhalten aus Archaea der Gattung Halobacterium aber auch aus Bacteria der Gattungen Halobacillus, Micrococcus oder Salinococcus. Die dort beschriebenen inaktivierten Zellen oder Zellhüllen können auch pharmazeutische Wirkungen aufzeigen, wie einen Schutz vor Entzündungsreaktionen, die Stimulation von Abwehrmechanismen etc.
Verfahren zur Charakterisierung von Etherlipiden, wie Glycolipiden sind zum Beispiel von Qiu et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 2000, 14: 1586–1591, beschrieben. Hierin werden Membranphospholipide oder Glycolipide aus halophilen Archaea mit Hilfe von HPLC/ES-MS untersucht. Dazu wurden Kulturen von Halobacterium salinarium kultiviert und die Lipidbestandteile mit Hilfe des MS analysiert. Die Lipide wiesen sowohl Phospholipide als auch Glycolipide auf. Dabei wurde zum Beispiel ein Phosphatidylglycerolphosphat-Methylester mit einer Doppelbindung in der Phytanyl-Seitenkette als ungesättigtes Etherlipid beschrieben. Dieses lag allerdings nur in sehr geringen Mengen im Vergleich zur gesättigten Form vor. Das gleiche Phänomen beschreibt Gibson et al., Systematic and Applied Microbiology, 2005, 28: 19–26. In diesem Dokument wurde die Analyse der Phospholipide von Halorubrum lacusprofundi beschrieben. Es zeigte sich, dass bei einem Wachstum bei 25°C im Wesentlichen gesättigte Phosphatidylglycerole, Phosphatidylglycerolsulphate, Phosphatidylglycerolphosphate und Phosphatidylglycerolphosphat-Methylester von den Mikroorganismen hergestellt werden. Bei einer Kultivierung bei 12°C wurden im Wesentlichen dieselben Phospho- und Glycolipide nachgewiesen. Allerdings zeigte es sich, dass bei Kultivierung bei 12°C auch ungesättigte Formen dieser Phospho- und Glycolipide mit bis zu sechs Doppelbindungen auftraten. Diese ungesättigten Formen der Phospho- bzw. Glycolipide wurden in bei 25°C kultivierten Mikroorganismen allerdings nur in Spuren nachgewiesen.
Bei der Produktion von Biomasse und Kultivierung von Mikroorganismen im Allgemeinen ist die Vermehrungsrate üblicherweise mit der Kultivierungstemperatur gekoppelt, das heißt bei niedrigeren Temperaturen vermehren sich die Mikroorganismen langsamer und die Biomassenproduktion ist reduziert. Daher ist eine Kultivierung bei höheren Temperaturen zur Produktion der Biomasse von Mikroorganismen mit relevanten Eigenschaften anzustreben. Archaea, die bei höheren Temperaturen, zum Beispiel Raumtemperatur, größere Mengen an ungesättigten Etherlipiden produzieren, sind im Stand der Technik nicht beschrieben.
Kurze Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt werden erfindungsgemäß Archaea bereitgestellt, die durch Kultivierung bei 25°C ungesättigte Etherlipide in einer Menge von mindestens 10%, bevorzugt mindestens 20% bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipiden, aufweisen.
Bei den Archaea handelt es sich bevorzugt um solche der Klasse Halomebacteria, der Ordnung Halobacteriales, der Familie Halobacteriaceae, insbesondere der Gattungen Haloarcula und Haloferax.
Insbesondere handelt es sich beiden in diesen Archaea vorkommenden Archaeolen um ungesättigte Archaeole mit vier oder sechs Doppelbindungen in den Kohlenwasserstoffketten, den Alkylketten, die üblicherweise ein C₂₀-C₂₀-Dialkylrest sind.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Lipidzusammensetzungen, wie Liposomen aber auch inaktivierte Zellen oder Zellhüllen, die ungesättigte Etherlipide in einer Menge von mindestens 10%, bevorzugt mindestens 20% bezogen auf die gesamte Menge an Etherlipiden aufweisen. Bevorzugt werden diese Lipidzusammensetzungen, wie Liposomen, inaktivierte Zellen und Zellhüllen aus den erfindungsgemäßen Archaea, insbesondere Haloarcula und Haloferax gewonnen.
Schließlich richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Gewinnung von ungesättigten Etherlipiden umfassend das Kultivieren der erfindungsgemäßen Archaea in einem Kulturmedium bei einer Temperatur von mindestens 20°C. bevorzugt mindestens 25°C, um eine diese Etherlipide enthaltende Biomasse zu erhalten.
Kurze Beschreibung der Abbildung
zeigt die Anteile gesättigter und ungesättigter Lipide von erfindungsgemäßen Archaea im Vergleich zu dem Stamm DSM5036, wie er in Gibson et al. erwähnt wird. Für diesen Stamm wurden Spuren an ungesättigten Lipiden bei einer Kultivierung bei 25°C beschrieben.
zeigt eine Analyse der Etherlipide eines erfindungsgemäßen Stammes, DSM22921.
zeigt eine übliche Verteilung von ungesättigten und gesättigten PG sowie von gesättigten und ungesättigten PGS in den erfindungsgemäßen Stammen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt werden erfindungsgemäß Archaea bereitgestellt, die durch Kultivierung in einem Kulturmedium bei 25°C ungesättigte Etherlipide in einer Menge von mindestens 10%, bevorzugt mindestens 20%, bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipiden der Archaea aufweisen. Erfindungsgemäß werden zum ersten Mal Archaea bereitgestellt, die unter ökonomisch günstigen Kultivierungsbedingungen, nämlich einer Kultivierung bei 25°C und sogar bei 30°C ungesättigte Etherlipide in einer Menge enthalten, die eine kommerzielle Verwendung dieser Etherlipide in Lipidzusammensetzungen etc. ermöglichen.
Die bisher beschriebenen Archaea produzierten nur bei Kultivierung unter niedrigen Temperaturbedingungen, zum Beispiel durch eine Kultivierung bei 12°C, ungesättigte Etherlipide. Unter ökonomisch sinnvollen Kultivierungsbedingungen mit einer Kultivierungstemperatur von 20°C bis 25°C oder höher konnten nur sehr geringe Mengen beziehungsweise Spuren dieser ungesättigten Etherlipide nachgewiesen wenden. Eine kommerzielle Verwendung dieser Mikroorganismen zur Nutzung der durch die ungesättigten Etherlipide verliehenen Eigenschaften, ist nicht möglich.
Hingegen weisen die erfindungsgemäßen Archaea große Mengen an ungesättigten Etherlipiden bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipiden in den Archaea auf.
Die Menge an ungesättigten Etherlipiden beträgt mindestens 10%, bevorzugt mindestens 15%, wie mindestens 20%, insbesondere 25%, wie 30% bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Archaea erfindungsgemäß um solche der Klasse Halomebacteria, insbesondere der Ordnung Halobacteriales, insbesondere solche aus der Familie der Halobacteriaceae. Zu dieser Familie der Halobacteriaceae gehören die Arten der Gattungen Halobacterium, Haladaptatus, Halalkalicoccus, Haloarcula, Halobaculum, Halobiforma, Halococcus, Haloferax, Halogeometricum, Halomicrobium, Halopiger, Haloplanus, Haloquadratum, Halorhabdus, Halorubrum, Halosimplex, Halostagnicola, Haloterrigena, Halovivax, Natrialba, Natrinema, Natronobacterium, Natronococcus, Natronolimnobius, Natronomonas oder Natronorubrum.
Bevorzugt handelt es sich bei den Archaea um solche der Gattung Haloarcula oder Haloferax. Insbesondere bevorzugt sind solche der Gattung Haloarcula mit den Hinterlegungsnummern DSM22919 und DSM22920 beziehungsweise der Gattung Haloferax mit der Hinterlegungsnummer DSM22921.
Das heißt, eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft Archaea mit den Eigenschaften der Stämme mit den oben genannten Hinterlegungsnummern, wobei diese mindestens 20% ungesättigte Etherlipide bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipiden aufweisen.
Bevorzugt handelt es sich bei den Etherlipiden um solche der allgemeinen Formel I
wobei die Kohlenwasserstoffketten insgesamt eine bis acht Doppelbindungen
aufweisen und gegebenenfalls substituiert sein können, R¹ ein Zuckerenthaltender Rest, der gegebenenfalls substituiert sein kann, oder eine Phosphatidylgruppe
wobei R2 Wasserstoff oder ein Glycerinrest ist, wobei dieser Glycerinrest gegebenenfalls substituiert sein kann, bevorzugt substituiert mit einer Sulphatidyl- oder Phosphatidylgruppe, diese kann gegebenenfalls wiederum mit einer Alkylkette substituiert sein.
Diese ungesättigten Etherlipide weisen in ihren Kohlenwasserstoffketten, den C₂₀-C₂₀-Dialkylresten, insgesamt eine bis acht Doppelbindungen auf, bevorzugt eine, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Das heißt bei einem einfach ungesättigten Etherlipid der allgemeinen Formel I, wobei die Alkylketten eine Doppelbindung aufweisen, ist eine der C₂₀-Alkylketten einfach ungesättigt, während die zweite Alkylkette eine gesättigte Kohlenwasserstoffkette ist. Die Positionen der Doppelbindungen sind zum Beispiel an C(2), C(6), C(10) oder C(14), an einer oder an beiden Alkylketten. Mögliche Positionen der Doppelbindungen sind unter anderem in Gibson et al., dargestellt. Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei den Etherlipiden um Phospholipide, zum Beispiel Phosphatidsäure (PA). Ein weiteres bevorzugtes Etherlipid, das in ungesättigter Form in den erfindungsgemäßen Archaea vorliegt, ist Phosphatidylglycerol (PG), Phosphatidylglycerolphosphat (PGP) oder Phosphatidylglycerolsulphat (PGS).
Diese genannten Verbindungen liegen dabei sowohl in gesättigter vor allem aber auch in ungesättigter Form in den erfindungsgemäßen Archaea vorliegen. Diese Verbindungen können dabei einfach oder mehrfach ungesättigte Seitenketten aufweisen, wie z. B. einfach, zweifach, dreifach, vierfach, fünffach, sechsfach, siebenfach oder achtfach ungesättigte Seitenketten. Schließlich können die Phospholipide in Form von Dimeren als Cardiolipin vorliegen.
Die Etherlipide können auch als ungesättigte Glycolipide vorhanden sein. Diese Glycolipide schließen insbesondere ungesättigte Glycolipide der Gruppe Monoglycosyl-archaeol (MGA), Diglycosyl-archaeol (DGA), Diglycosyl-archaeolsulphatester (S-DGA), Diglycosyl-archaeol-disulphatester (S2-DGA), Triglycosylarchaeol (TGA), Triglycosyl-archaeol-sulphatester (S-TGA), Tetraglycosylarchaeol-sulphatester (S-TeGA) sowie Glycocardiolipine ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind zumindest ein Teil der ungesättigten Etherlipide ungesättigte Phosphatidylglycerole.
Obwohl der Anteil ungesättigter Lipide im Verhältnis zur Gesamtlipidmenge mit steigender Temperatur erwartungsgemäß abnimmt, gelingt es erfindungsgemäß die absolute Menge ungesättigter Lipide zu steigern, indem man die Fermentationstemperatur von 12°C auf 20°C, 25°C und insbesondere auf 30°C anhebt, da die Gesamtausbeute an Lipiden bei 30°C und 25°C deutlich höher ist als bei 20°C oder 12°C. Dadurch ist es möglich in größeren, wirtschaftlich besseren Umfang ungesättigte Etherlipide bzw. Lipidzusammenseztungen, wie Liposomen, zu erhalten.
Erfindungsgemäß werden weiterhin Zellhüllen oder inaktivierte Zellen in Form der reinen Biomasse oder in Form von Extrakten bereitgestellt. Das heißt, vorliegend werden durch bekannte Verfahren erhaltene inaktivierte Zellen als Biomasse bereitgestellt, welche direkt aus der Fermentation gewonnen werden. Alternativ werden Zellhüllen in Form von Biomasse oder in Form von Extrakten bereitgestellt. Dem Fachmann sind Verfahren zur entsprechenden Herstellung der Zellhüllen aus den erfindungsgemäßen Archaea bekannt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Lipidzusammensetzungen, insbesondere Liposomen, erhältlich aus den erfindungsgemäßen Archaea. Diese Lipidzusammensetzungen, insbesondere Liposomen, aber auch die oben genannten Zellhüllen oder inaktivierten Zellen zeichnen sich dadurch aus, dass sie einen Anteil von mindestens 10% ungesättigte Etherlipide bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipiden aufweisen. Bevorzugt enthalten die Zusammensetzungen, inaktivierten Zellen und Zellhüllen ungesättigte Etherlipide in einem Anteil von mindestens 15%, wie mindestens 20%, zum Beispiel 25%, insbesondere bevorzugt 30% bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipiden.
Die erfindungsgemäßen Lipidzusammensetzungen, insbesondere die Liposomen, aber auch die Zellhüllen oder inaktivierten Zellen enthaltend ungesättigte Etherlipide sind bevorzugt erhältlich aus den halophilen Mikroorganismen Haloarcula sp. mit der Hinterlegungsnummer DSM22919 oder DSM22920 oder aus Haloferax sp. mit der Hinterlegungsnummer DSM22921.
Die erfindungsgemäßen Lipidzusammensetzungen, insbesondere die Liposomen, aber auch die Zellhüllen oder inaktivierten Zellen zeichnen sich dadurch aus, dass sie in einem großen Anteil ungesättigte Etherlipide der hierin genannten Verbindungen in einem Anteil von mindestens 10%, bevorzugt 20%, bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipiden aufweisen. Dadurch können die vorteilhaften Eigenschaften ungesättigter Etherlipide genutzt werden. Das Anwendungsspektrum umfasst dabei die für Etherlipide bekannten Möglichkeiten, wie sie zum Beispiel in der WO2004/103332 oder der WO93/08202 beschrieben sind.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Gewinnung von ungesättigten Etherlipiden, insbesondere Etherlipiden gemäß der allgemeinen Formel I
wobei die Kohlenwasserstoffketten insgesamt eine bis acht Doppelbindungen
aufweisen und gegebenenfalls substituiert sein können, R¹ ein Zucker-enthaltender Rest, der gegebenenfalls substituiert sein kann, oder eine Phosphatidylgruppe
wobei R² Wasserstoff oder ein Glycerinrest ist, wobei dieser Glycerinrest gegebenenfalls substituiert sein kann, bevorzugt substituiert mit einer Sulphatidyl- oder Phosphatidylgruppe, diese kann gegebenenfalls wiederum mit einer Alkylkette substituiert sein; umfassend den Schritt des Kultivierens der erfindungsgemäßen Archaea in einem Kulturmedium bei einer Temperatur von mindestens 20°C, bevorzugt von mindestens 25°C.
Bevorzugt werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren Archaea gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, insbesondere Archaea, wie solche der Gattungen Haloarcula und Haloferax. Besonders bevorzugt werden zur Gewinnung der ungesättigten Etherlipide die Stämme DSM22919, DSM22920 beziehungsweise DSM22921 verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Kultivierung der Archaea bei einer Temperatur von mindestens 20°C, bevorzugt von mindestens 25°C erfolgt. Die Kultivierungstemperatur kann dabei 30°C oder höher, wie 37°C oder höher sein. Nach Kultivierung weisen die kultivierten Archaea eine Menge an ungesättigten Etherlipiden von mindestens 10%, oder mindestens 15%, bevorzugt mindestens 20%, wie mindestens 25% oder mindestens 30% bezogen auf die gesamte Menge an Etherlipiden in den Archaea auf.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich im Weiteren dadurch aus, dass bei der Kultivierung der Archaea durch Zugabe von nicht weniger als 5% (v/v) Inokulum die „Lag”-Phase übersprungen wird. Das Inokulum kann bei einer höheren Temperatur, als der Kultivierungstemperatur zur Gewinnung der Biomasse, wie bei mindestens 30°C, vorzugsweise bei 37°C erzeugt werden, während die Kultivierung bei den erfindungsgemäß niedrigeren Temperaturen durchgeführt wird.
Im Weiteren wurde überraschender Weise gefunden, dass die Ausbeute an ungesättigten Lipiden am Ende der exponentiellen Wachstumsphase – nach 3–4 Tagen Fermentationsdauer – höher ist, als wenn man die Fermentation bis in die stationäre Phase – welches der maximalen Biomasse-Ausbeute entsprechen wurde – ausdehnt. Daher wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Kultivierung der Archaea bevorzugt bis zum Ende der exponentiellen Wachstumsphase, wie z. B. 3–4 Tage Fermentationsdauer bei 25°C, durchgeführt. Entsprechend wird bevorzugt die Biomasse bereits vor Erreichen der stationären Phase geerntet.
Zur Gewinnung der ungesättigten Etherlipide umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin den Schritt der Extraktion der Biomasse mit einem organischen Lösungsmittel zum Abtrennen der Lipide.
Diese Extraktion ist insbesondere eine, bei der Chloroform alleine oder gemischt mit zum Beispiel Methanol und gegebenenfalls Wasser verwendet wird. Zur Auftrennung der Phasen wird bevorzugt ein Gemisch aus Chloroform und Wasser eingesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform findet anschließend ein Auftrennen der Lipide zum Beispiel mittels einer Kieselgelsäule statt. Dieser Schritt kann ein Vorkonditionieren der Säule mit zum Beispiel Chloroform beinhalten, um weitere Bestandteile der nach organischer Extraktion erhaltenen Fraktion, wie zum Beispiel Farbstoffe, abzutrennen. Die Glycolipidfraktion wird bevorzugt mit Hilfe von zum Beispiel Aceton von der Kieselgelsäule eluiert. Anschließend kann die Phospholipidfraktion z. B. mit einem Alkohol, wie Methanol von der Kieselgelsäule eluiert werden. Dem Fachmann sind entsprechende Verfahren bekannt.
Die Trennung der einzelnen ungesättigten Etherlipide kann mit Hilfe von bekannten Verfahren erfolgen. Beispielhaft sei hier ein Chromatografieverfahren genannt.
Entsprechend können dann die ungesättigten Etherlipide getrennt oder in Fraktionen unterschiedlicher ungesättigter Etherlipide erhalten werden.
Des Verfahren zur Extraktion der Lipide aus der Zellmasse der Archaea, insbesondere der halophilen Archaea und der Nachweis mittels LC-MS basiert auf Modifikationen des in Gibson et al., beschriebenen Verfahrens.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die präparative Gewinnung von ungesättigten Etherlipiden aus den erfindungsgemäßen Archaea.
Die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Archaea erlaubt die Gewinnung von ungesättigten Etherlipiden beziehungsweise Lipidzusammensetzungen einschließlich Zellhüllen und inaktivierten Zellen enthaltend die ungesättigten Etherlipide in Mengen von mindestens 10% bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipiden. Überraschend wurde festgestellt, dass im Gegensatz zu den Ausführungen in zum Beispiel Gibson et. al., ungesättigte Etherlipide auch unter Kultivierungsbedingungen von mindestens 20°C, bevorzugt mindestens 25°C in großen Mengen erhalten werden können. Dadurch wird eine kommerzielle Nutzung dieser ungesättigten Etherlipide möglich.
Die erfindungsgemäßen Archaea sind insbesondere solche aus der Gruppe der halophilen Archaea mit den Eigenschaften der hinterlegten Stämme DSM22919, DSM22920 beziehungsweise DSM22921.
Im Folgenden wird die Erfindung mit Hilfe von Beispielen näher erläutert, ohne dass die Erfindung auf diese beschränkt wird.
Quelle und Kultivierungsbedingungen der Archaea
Die drei erfindungsgemäßen Archaea-Stämme DSM22919, DSM22920 und DSM22921 wurden von salzhaltigen Standorten des Werkes Sigmundshall der K + S Kali GmbH gewonnen. DSM5036 wurde von der DSMZ GmbH, Braunschweig erhalten.

Die Kultivierung der im Beispiel verwendeten halophilen Archaea zur Herstellung von ungesättigten Etherlipiden wurde wie folgt durchgeführt: Nährmedium DSMZ Nr. 372 (modifiziert).

Hefeextrakt	5 g
Caseinhydrolysat	5 g
Natrium-L-Glutamat-Monohydrat	1 g
Trinatriumzitrat	3 g
NaCl	200 g
KCl	2 g
MgSO₄·7H₂O	20 g
FeCl₂·6H₂O	36 mg
Manganchlorid-Stammlösung	1 ml
Extran^® AP31 (Entschäumer)	200 μl
Aqua deionisata Manganchlorid-Stammlösung	ad. 1000 ml
MnCl₂·4H₂O	36 mg
Aqua deionisata	ad. 100 ml

Der pH-Wert des Nährmediums wurde mit KOH auf 7,0 bis 7,2 eingestellt, und das Medium wurde für 20 min bei 121°C autoklaviert.
Die Kultur wurde unter sterilen Bedingungen in 25 ml Nährmedium inokuliert und in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben auf einem Kreisschüttler bei ca. 120 rpm bei 37°C für 7 Tage inkubiert. Anschließend wurde die Kultur in 225 ml Nährmedium überführt und für weitere 7 Tage bei 37°C mit 120 rpm auf einem Kreisschüttler inkubiert. Das erhaltene Inokulum wurde in 4.750 ml Nährmedium mit der oben genannten Zusammensetzung überführt und mit einem Magnetrührer mit 650 rpm bei 25°C für weitere 4 Tage inkubiert. Die Kultur wurde mit circa 3,8 Umin wassergereinigter und befeuchteter Raumluft über eine Membranpumpe mittels steriler Silikon-Ringschlauchbelüftungseinheit belüftet. Die so gewonnene Biomasse wurde von dem Nährmedium durch Zentrifugation (7.000 rpm, 6.566 g) für 20 Minuten abgetrennt. Das Zellpellet wurde mit 20 ml Basalsalz-Waschlösung gewaschen und erneut bei 6.566 g für 20 Minuten zentrifugiert.
Gegebenenfalls wurde dieses erhaltene Biomasse-Pellet dann bei –80°C bis zur weiteren Verarbeitung eingefroren. Basalsalzwaschlösung

NaCl 200 g

KCl 2 g

MgSO₄·7H₂O 20 g

Aqua deionisata ad. 1000 ml
Extraktion
Zu einem Zellpellet von ca. 30 g Masse werden in einer 250 mL-Schottflasche 120 mL Extraktionslösung (CHCl₃/MeOH/H₂O, 5/10/4, v/v/v) zugegeben und die Flasche verschlossen. Nach kräftigem Schütteln bis zum vollständigen Resuspendieren des Zellpellets wird die Schottflasche für 15 min in ein gekühltes Ultraschallbad gestellt. Mit einem Messzylinder werden 32 mL Chloroform und 32 mL HPLC-Wasser zugegeben. Die Schottflasche wird erneut verschlossen und kräftig geschüttelt. In diesem Schritt bildet sich nach Zentrifugation ein 3-Phasen-System (Chloroformphase/Zellbestandteile/wässrige Phase).
Nach Zentrifugation bei ca. 2500 U/min (ca. 1900 g) für 10 min bei ca. 4°C wird mit einer Einwegspritze mit langer Edelstahlkanüle die untere Phase (ca. 60 mL Chloroform) entnommen und in eine 100 mL-Schottflasche überführt. Zur isolierten Chloroform-Phase wird ein Löffel wasserfreies Natriumsulfat zugefügt, die Flasche verschlossen und kräftig geschüttelt.
Nach Zentrifugation bei Ca. 3000 U/min für 5 min bei 4°C wird der flüssige Überstand abdekantiert bzw. Reste mit einer Pasteurpipette abgenommen und in einen 100 mL Rundkolben überführt. Das Chloroform wird bei 30°C im Vakuum auf ca. 1/3 des Ausgangsvolumens eingeengt.
Aufreinigung des Rohextraktes mittels Silica-Gel-Säule
Eine Festphasen-Säule „BAKERBOND Silica Gel” (5 g Säulenbett) wird in eine Stativhalterung eingespannt und mit Chloroform vorkonditioniert. Hierzu werden 20 mL Chloroform mit einer Pipette aufgegeben und ohne Über- oder Unterdruck durchlaufen gelassen.
Herstellung der Chloroform-Fraktion zur Gewinnung von Farbstoffen
Der oben erhaltene Chloroformextrakt (ca. 20 mL; auf die Säule können bis zu 100 mL aufgegeben werden) wird auf die Festphasen-Säule aufgegeben. Der Extrakt sickert nun langsam, ohne Unter- oder Überdruck ein. Eine Braunglasflasche wird unter die Säule gestellt und zur Elution werden 20 mL Chloroform auf die Säule gegeben. Nachdem das gesamte Lösungsmittel durchgelaufen ist, werden mit einer Einwegspritze (und Säulenadapter) ca. 50 mL Luft langsam durch die Säule gedrückt, um Chloroformreste noch in die Braunglasflasche zu spülen.
Herstellung der Aceton-Fraktion zur Gewinnung von Glycolipiden
Eine weitere Braunglasflasche wird unter die Säule gestellt und 20 mL Aceton werden auf die Säule aufgegeben. Wenn das gesamte Elutionsmittel durchgelaufen ist, werden mit einer Einwegspritze ca. 50 mL Luft langsam durch die Säule gedrückt, um Acetonreste noch in die Braunglasflasche zu spülen.
Herstellung der Methanol-Fraktion zur Gewinnung von Phospholipiden
Eine weitere Braunglasflasche wird unter die Säule gestellt und 90 mL Methanol werden auf die Säule aufgegeben. Wenn das gesamte Elutionsmittel durchgelaufen ist, werden mit einer Einwegspritze ca. 50 mL Luft langsam durch die Säule gedrückt, um Methanolreste noch in die Braunglasflasche zu spülen.
Messung

Die Messung der Lipid-Fraktionen erfolgte mittels LC-ESI-MS. Chromotographie-Bedingungen

System:	Varian 320-MS
Vorsäule:	RP18
Trennsäule:	Varian Polaris RP18, 150 × 2 mm, 3 μm
Temp. Säule:	30°C
Fließmittel:	Methanol/Wasser/NH₄-Ac, 94/4/2 (v/v/v)
Gradient:	ohne, isokratisch
Fluss:	0,3 mL/min
Detektion:	Massenspektrometer
Injektionsvolumen:	5–20 μL (μl-pickup-Methode)
Laufzeit:	60 min

Massenspektrometrische Detektion

Ion Source:	ESI
Scan mode:	Centroid
SIM width:	0.700 amu total
Detector:	EDR
	Turn off source at the end of run

Segments:	1
CID Gas:	Off
Scan time requested:	1.520 Sec.
Peak width selection:	Q1 Peak width 1.00
	Q3 Peak width 1.50
ESI needle voltage negative:	–4500.00
ESI shield voltage negative:	–600.00
Drying gas temperature:	300.00
API housing temperature:	50.00
Nebulizer gas pressure:	55.00
Drying gas pressure:	18.00
6 Port valve:	”MS”
Data collection:	ON

In der ist ein typisches Ergebnis der Analyse der Etherlipide, hier der PG, im erfindungsgemäßen Stamm DSM22921 gezeigt. Es sind alle Formen von ungesättigten PG mit einer bis sechs Doppelbindungen nachweisbar.
In der ist hierzu der Lipidanteil gesättigter und ungesättigter Lipide in erfindungsgemäßen Archaea und den im Gibson et al., beschriebenem Stamm DSM5036 dargestellt. Wie deutlich zu erkennen ist, ist der Anteil an ungesättigten Lipiden bei den erfindungsgemäßen Stämmen wesentlich höher als im bekannten Archaea-Stamm.
Die genauere Analyse der ungesättigten Etherlipide ist für PG und PGS in der dargestellt. Wie dargestellt sind in allen aufgeführten Stämmen die gezeigten ungesättigten Formen nachweisbar.
In der sind die Anteile •der ungesättigten Etherlipide nach Herstellung der jeweiligen Biomasse bei verschiedenen Temperaturen dargestellt. Deutlich ist zu erkennen, dass auch bei höheren Kultivierungstemperaturen die erfindungsgemäßen Archaea ungesättigte Phospholipide in großen Mengen herstellen.
Weiterhin wunden Untersuchungen zur Abhängigkeit der Fermentationszeit durchgeführt. Die Kultivierung erfolgte, wie oben beschrieben, mit unterschiedlicher Dauer. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde Biomasse mit den oben beschriebenen Verfahren geerntet und auf ihren Lipidgehalt hin analysiert. Die Ergebnisse sind in der dargestellt. Zu erkennen ist, dass der Anteil an ungesättigten Etherlipiden in der Wachstumsphase (Tag 3 bis 4) über den Anteil an ungesättigten Etherlipiden in der. stationären Phase hinausgeht. Bevorzugt wird daher die Ernte der Biomasse vor Beginn der stationären Phase durchgeführt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 93/08202 [0006]
WO 2004/103332 [0007, 0034]
WO 93/02202 [0034]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Qiu et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 2000, 14: 1586–1591 [0008]
Gibson et al., Systematic and Applied Microbiology, 2005, 28: 19–26 [0008]
Gibson et al. [0015]
Gibson et al. [0026]
Gibson et al. [0044]
Gibson et. al. [0046]
et al., beschriebenem [0063]

Claims

Archaea, dadurch gekennzeichnet, dass diese bei Kultivierung bei 25°C ungesättigte Etherlipide in einer Menge von mindestens 10% bevorzugt mindestens 20% bezogen auf die Gesamtmenge an Etherlipiden, aufweisen.
Archaea gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese aus der Klasse der Halomebacteria, wie aus der Ordnung der Halobacteriales, insbesondere aus der Familie der Halobacteriacae stammen.
Archaea gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese aus den Gattungen Haloarcula oder Haloferax stammen.
Archaea gemäß einer der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um solche der Gattung Haloarcula mit den Hinterlegungsnummern DSM22919 und DSM22920 oder der Gattung Haloferax mit der Hinterlegungsnummer DSM22921 handelt.
Archaea nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die enthaltenen ungesättigten Etherlipide solche der allgemeinen Formel (I) sind,
wobei die Kohlenwasserstoffketten insgesamt eine bis acht Doppelbindungen
aufweisen und gegebenenfalls substituiert sein können, R¹ ein Zucker-enthaltender Rest, der gegebenenfalls substituiert sein kann, oder eine Phosphatidylgruppe
wobei R² Wasserstoff oder ein Glycerinrest ist, wobei dieser Glycerinrest gegebenenfalls substituiert sein kann, bevorzugt substituiert mit einer Sulphatidyl- oder Phosphatidylgruppe, diese kann gegebenenfalls wiederum mit einer Alkylkette substituiert sein.
Archaea nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei diese mindestens eine Art von ungesättigten Etherlipiden der allgemeinen Formel (I) aufweisen und wobei diese mindestens eine Art an ungesättigten Etherlipiden mit vier oder sechs Doppelbindungen in den Kohlenwasserstoffresten aufweisen.
Archaea nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das ungesättigte Etherlipid eines der allgemeinen Formel (I) mit R¹ einer Phosphatidylgruppe mit R₂ einem Glycerinrest, ist und zumindest ein Teil der ungesättigten Etherlipide Archaeolphosphatidylglycerol ist.
Archaea gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei diese in Form von Zellhüllen oder inaktivierten Zellen, in Form der reinen Biomasse und/oder in Form von Extrakten vorliegen.
Lipidzusammensetzung, insbesondere Liposomen, umfassend den Gesamtextrakt der Etherlipide von Archaea nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Lipidzusammensetzung, insbesondere Liposomen nach Anspruch 9 enthaltend ungesättigte Etherlipide erhältlich von einem halophilen Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer DSM22919, DSM22920 beziehungsweise DSM22921.
Verfahren zur Gewinnung von ungesättigten Etherlipiden gemäß der allgemeinen Formel I
wobei die Kohlenwasserstoffketten insgesamt eine bis acht Doppelbindungen
aufweisen und gegebenenfalls substituiert sein können, R¹ ein Zucker-enthaltender Rest, der gegebenenfalls substituiert sein kann, oder eine Phosphatidylgruppe
wobei R² Wasserstoff oder ein Glycerinrest ist, wobei dieser Glycerinrest gegebenenfalls substituiert sein kann, bevorzugt substituiert mit einer Sulphatidyl- oder Phosphatidylgruppe, diese kann gegebenenfalls wiederum mit einer Alkylkette substituiert sein; umfassend den Schritt des Kultivierens von Archaea nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in einem Kulturmedium bei einer Temperatur von mindestens 20°C, bevorzugt von mindestens 25°C um diese Etherlipide enthaltende Biomasse zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Ernte der Biomasse vor Erreichen der stationären Phase durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Inokulum in einer Menge von mindestens 5% (v/v) dem Kulturmedium zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Inokulum bei mindestens 30°C kultiviert wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Kultivieren mit einem der Stämme DSM22919, DSM22920 oder DSM 22921 erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, weiterhin umfassend den Schritt der Extraktion der Biomasse mit einem organischen Lösungsmittel zum Abtrennen der Lipide.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, weiterhin umfassend den Schritt des Auftrennens der Lipide mittels Kieselgelsäule.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, weiterhin umfassend den Schritt der Reinigung oder Aufkonzentrierung der Lipide mittels HPLC.