EA031579B1

EA031579B1 - Archaea и полученные из них композиции липидов

Info

Publication number: EA031579B1
Application number: EA201391088A
Authority: EA
Inventors: Дирк Циммерманн; Хайко Патцельт; Эльке Майевски; Йорг-Хайно Захзе; Кристине Штолль
Original assignee: К + С Акциенгезелльшафт
Priority date: 2010-02-17
Filing date: 2011-02-16
Publication date: 2019-01-31
Also published as: DE102010008353A1; EP2625265A1; US20140084207A1; CA2824398A1; WO2011100955A1; DE102010008353B4; AR080202A1; AU2011217656A1; US20160265016A1; NZ612310A; AU2011217656B2; IL227349A0; EA201391088A1; CL2013002237A1; IL227349B; ZA201309758B

Abstract

Изобретение относится к микроорганизмам, в частности Archaea, которые благодаря культивированию при 25°С содержат ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве по меньшей мере 10% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью. В следующем аспекте данное изобретение относится к композиции липидов, которую можно получить из данных Archaea, в частности из класса Halomebacteria, в частности отряда Halobacteriales, в частности рода Halobacteriaceae, в частности вида Haloarcula или Haloferax. Данные композиции липидов, в частности липосом, отличаются наличием большого количества ненасыщенных липидов с простой эфирной связью. В следующем аспекте данное изобретение относится к способу получения данных ненасыщенных липидов с простой эфирной связью из упомянутых Archaea.

Description

Изобретение относится к микроорганизмам, в частности Archaea, которые благодаря культивированию при 25°С содержат ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве по меньшей мере 10% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью. В следующем аспекте данное изобретение относится к композиции липидов, которую можно получить из данных Archaea, в частности из класса Halomcbactcria. в частности отряда Halobacteriales, в частности рода Halobacteriaceae, в частности вида Haloarcula или Haloferax. Данные композиции липидов, в частности липосом, отличаются наличием большого количества ненасыщенных липидов с простой эфирной связью. В следующем аспекте данное изобретение относится к способу получения данных ненасыщенных липидов с простой эфирной связью из упомянутых Archaea.

Данное изобретение относится к микроорганизмам, а именно Archaea, которые благодаря культивированию при 25°С содержат ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве по меньшей мере 10% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью. В следующем аспекте данное изобретение относится к композициям липидов, которые можно получить из данных Archaea, в частности из их класса Halomebacteria, отряда Halobacteriales, рода Halobacteriaceae, в частности вида Haloarcula, например Haloferax. Данные композиции липидов, в частности липосом, отличаются наличием большого количества ненасыщенных липидов с простой эфирной связью. В следующем аспекте данное изобретение относится к способу получения данных ненасыщенных липидов с простой эфирной связью из упомянутых Archaea.

Уровень техники

Archaea, также обозначаемые как архебактерии, наряду с бактериями и эукариотами образуют один из трех доменов клеточных организмов. Archaea представляют собой одноклеточные организмы без клеточного ядра с чаще всего замкнутой молекулой ДНК. Archaea отличаются от бактерий существенными различиями в последовательности рибосомной 16S РНК, а также другими генетическими, физиологическими, структурными и, в частности, биохимическими признаками.

Многие виды Archaea приспособлены к экстремальным условиям окружающей среды. В группу Archaea попадают термофильные микроорганизмы, галофильные микроорганизмы, ацидофильные, а также алкалифильные микроорганизмы.

Хотя Archaea в некоторых областях имеют большое сходство с другими прокариотами - бактериями, они обладают многими неповторимыми свойствами. Одним из этих свойств является, например, строение клеточной оболочки Archaea. Она состоит из образованного фосфолипидами и гликолипидами двойного слоя (Bilayer) и находящегося поверх него кристаллического поверхностного слоя (S-Layer, или соответственно Surface-Layer). Archaea в противоположность бактериям не содержат муреин (пептидогликан), а варианты осуществления двойных слоев могут быть очень многообразны. Также различается состав клеточных мембран Archaea. У Bacteria и Eukaryota жирные кислоты через сложноэфирные связи связаны с глицерином. У Archaea обнаруживаются образованные соединениями глицерин-простой эфир двухслойные мембраны, а в их гидрофобных цепях происходящие из изопреновых элементов жирные спирты вместо простых жирных кислот. Кроме того, достойны внимания трансмембранные липиды, которые образованы из диолов с двойной длинной цепью, которые с двух сторон соединяют мембраны с глицерином с образованием простых эфирных связей диглицерин-тетраэфир и этим дополнительно стабилизируют мембрану. Так, например, гипертермофильные Archaea часто обладают такими стабилизированными мембранами с диглицерином - простым тетраэфиром. У галофильных Archaea S-Layer имеют стабилизирующую форму функцию. Все липиды мембран обычно представляют собой производное С₂₀С₂₀-диалкилглицерин-простого диэфира, sn-2,3-дифитанилглицерин-простой диэфир (археол).

Фосфолипиды галофильных Archaea содержат в качестве основного компонента фосфатидилглицеринфосфатметил-сложный эфир (PGP-Me), фосфатидилглицеринфосфат (PGP), а также в качестве компонентов обычно с небольшим содержанием - фосфатидилглицерин (PG), фосфатидилглицеринсульфат (PGS) и фосфатидную кислоту (РА). Гликолипиды содержат преимущественно дигликозилархеол, который может быть один раз или дважды сульфатизирован, сульфатизированный тригликозилархеол (STGA), а также тригликозилархеол (TGA) и сульфатизированный тетрагликозилархеол (S-TeGA). Компоненты сахара состоят обычно из гексоз глюкозы, маннозы или галактозы. Остатки галактозы могут находиться как в виде фуранозы, так и в виде пиранозы.

Archaea, их составные части и их применение уже неоднократно описаны. Так, из WO 93/08202 известно образование стабильных липосом из экстрактов липидов Archaea. В указанной работе описаны новые изолированные из метаногенных и крайне галофильных представителей Archaea липиды с простой эфирной связью, например насыщенные липиды с простой эфирной связью, в частности производные С20-С20-диалкилглицерин-простого диэфира. Далее в данном документе описаны липосомы из Archaea, в частности липосомы, которые включают общий экстракт полярных липидов метаногенных Archaea и галофильных Archaea. В качестве области применения таких липосом можно упомянуть, с одной стороны, применение в качестве инструмента в исследовании и, с другой стороны, применение в качестве вспомогательного вещества или носителя для действующих веществ, инсектицидов, генетического материала или ферментов, а также в косметической области.

Косметические композиции, которые содержат инактивированные клетки или клеточные оболочки галофильных или галотолерантных микроорганизмов, раскрываются в WO 2004/103332. Данные косметические композиции, имеющие клеточные оболочки и соответственно инактивированные клетки, можно получить из биомассы или из экстракта, и в частности их получают из Archaea вида Halobacterium, а также из Bacteria вида Halobacillus, Micrococcus или Salinococcus. Описанные в данной работе инактивированные клетки или клеточные оболочки могут проявлять также фармацевтическое действие, такое как защита от воспалений, стимуляция защитных механизмов и т.д.

Способ характеристики липидов с простой эфирной связью, таких как гликолипиды, описан, например, в Qiu et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 2000, 14: 1586-1591. Там исследуют мембранные фосфолипиды или гликолипиды из галофильных Archaea с помощью HPLC/ES-MS. Для этого культиви

- 1 031579 руют культуры Halobacterium salinarium и анализируют липидные составляющие с помощью MS. Липиды включают как фосфолипиды, так и гликолипиды. При этом, например, описан фосфатидилглицеринфосфатметиловый сложный эфир с двойной связью в фитаниловой боковой цепи в качестве ненасыщенного липида с простой эфирной связью. Данное соединение, однако, находится только в очень небольшом количестве по сравнению с насыщенной формой. Такое же явление описано в Gibson et al., Systematic and Applied Microbiology, 2005, 28: 19-26. В данном документе описан анализ фосфолипидов Halorubrum lacusprofundi. Оказалось, что при росте при 25°С из микроорганизмов получают, по существу, насыщенные фосфатидилглицерины, фосфатидилглицеринсульфаты, фосфатидилглицеринфосфаты и фосфатидилглицеринфосфатметиловый сложный эфир. При культивировании при 12°С обнаруживаются, по существу, те же самые фосфолипиды и гликолипиды. Однако также оказалось, что при культивировании при 12°С также образуются ненасыщенные формы данных фосфолипидов и гликолипидов, имеющие до шести двойных связей. В культивированных при 25°С микроорганизмах обнаруживаются только следы данных ненасыщенных форм фософолипидов или гликолипидов.

При производстве биомассы и культивировании микроорганизмов обычно скорость размножения связана с температурой культивирования, что означает, что при более низких температурах микроорганизмы размножаются медленнее, и производство биомассы сокращается. Поэтому стремятся к культивированию при более высоких температурах для производства биомассы из микроорганизмов с важными свойствами. Archaea, которые при более высоких температурах, например при комнатной температуре, производят большее количество ненасыщенных липидов с простой эфирной связью, в уровне техники не описаны.

Краткое описание изобретения

В первом аспекте данного изобретения предоставляются Archaea, которые при культивировании при 25°С содержат ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 20% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью.

В случае Archaea предпочтительно речь идет о Archaea класса Halomebacteiria, отряда Halobacteriales, рода Halobacteriaceae, в частности вида Haloarcula и Haloferax.

В частности, в случае происходящих из данных Archaea археол речь идет о ненасыщенных археолах с четырьмя или шестью двойными связями в углеводородной цепи, алкильной цепи, которая обычно представляет собой С₂₀-С₂₀-диалкильный радикал.

В следующем аспекте данное изобретение относится к композиции липидов, таких как липосомы, а также к инактивированным клеткам или клеточным оболочкам, которые содержат ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 20% по отношению ко всему количеству липидов с простой эфирной связью. Предпочтительно данные композиции липидов, таких как липосомы, инактивированные клетки и клеточные оболочки, получают из Archaea по изобретению, в частности из Haloarcula и Haloferax.

Наконец, данное изобретение относится к способу получения ненасыщенных липидов с простой эфирной связью, включающему культивирование Archaea по изобретению в питательной среде при температуре по меньшей мере 20°С, предпочтительно по меньшей мере 25°С, для того чтобы получить биомассу, содержащую данные липиды с простой эфирной связью.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показано содержание насыщенных и ненасыщенных липидов в Archaea по изобретению по сравнению со штаммом DSM5036, который упомянут у Gibson et al. Описано, что данный штамм имеет следы ненасыщенных липидов при культивировании при 25°С.

На фиг. 2 показан анализ липидов с простой эфирной связью штамма по изобретению, DSM22921.

На фиг. 3 показано обычное распределение ненасыщенных и насыщенных PG, а также насыщенных и ненасыщенных PGS в штаммах по изобретению.

Подробное описание изобретения

В первом аспекте предоставляются Archaea по изобретению, которые благодаря культивированию в питательной среде при 25°С содержат ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 20% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью в Archaea. Согласно данному изобретению впервые предоставляются Archaea, которые при экономически благоприятных условиях культивирования, а именно при культивировании при 25°С и даже при 30°С, содержат ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве, которое делает возможным коммерческое применение данных липидов с простой эфирной связью в композиции липидов и т.д.

До сих пор из описанных Archaea производили ненасыщенные липиды с простой эфирной связью только при культивировании при более низких температурных условиях, например при культивировании при 12°С. При экономически рациональных условиях культивирования при температуре культивирования от 20 до 25°С или выше можно было обнаружить только очень небольшое количество или соответственно следы данных ненасыщенных липидов с простой эфирной связью. Коммерческое применение данных микроорганизмов для использования придаваемых ненасыщенными липидами с простой эфирной

- 2 031579 связью свойств не было возможным.

В противоположность этому Archaea по изобретению содержат большое количество ненасыщенных липидов с простой эфирной связью по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью в Archaea.

Количество ненасыщенных липидов с простой эфирной связью составляет по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, в частности 25%, в частности 30% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью.

В предпочтительном варианте осуществления в случае Archaea по изобретению речь идет об Archaea класса Halomebacteria, в частности отряда Halobacteriales, в частности рода Halobacteriaceae. К данному роду Halobacteriaceae принадлежат виды Halobacterium, Haladaptatus, Halalkalicoccus, Haloarcula, Halobaculum, Halobiforma, Halococcus, Haloferax, Halogeometricum, Halomicrobium, Halopiger, Haloplanus, Haloquadraturn, Halorhabdus, Halorubrum, Halosimplex, Halostagnicola, Haloterrigena, Halovivax, Natrialba, Natrinema, Natronobacterium, Natronococcus, Natronolimnobius, Natronomonas или Natronorubrum.

Предпочтительно в случае Archaea речь идет об Archaea вида Haloarcula или Haloferax. В частности, предпочтительными являются Archaea вида Haloarcula с регистрационными номерами DSM22919 и DSM22920 и соответственно вида Haloferax с регистрационным номером DSM22921.

Это означает, что особенно предпочтительный вариант осуществления относится к Archaea со свойствами штаммов с упомянутыми регистрационными номерами, причем данные Archaea содержат по меньшей мере 20% ненасыщенных липидов с простой эфирной связью по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью.

Предпочтительно в случае липидов с простой эфирной связью речь идет о липидах общей формулы I

причем углеводородная цепь всего имеет до восьми двойных связей (⁼⁼⁼) и необязательно может быть замещена, R¹ представляет собой содержащий сахар радикал, который необязательно может быть замещен, или группу фосфатидила о η ¹¹

R²O-P—

I он причем R² представляет собой водород или радикал глицерина, причем данный радикал глицерина необязательно может быть замещен, предпочтительно замещен группами сульфатидила или фосфатидила, которые, в свою очередь, могут быть необязательно замещены алкильной цепью.

Данные ненасыщенные липиды с простой эфирной связью имеют в своей углеводородной цепи, в С₂₀-С₂₀-диалкильном радикале, всего от одной до восьми двойных связей, предпочтительно одну, две, три, четыре, пять или шесть двойных связей. Это означает, что у однократно ненасыщенного липида с простой эфирной связью общей формулы I, у которого алкильная цепь имеет двойную связь, одна С20алкильная цепь является однократно ненасыщенной, в то время как вторая алкильная цепь является насыщенной углеводородной цепью. Положение двойных связей может быть, например, у С(2), С(6), С(10) или С(14), в одной или обеих алкильных цепях. Возможные положения двойных связей, кроме того, представлены у Gibson et al. В частности, предпочтительно в случае липидов с простой эфирной связью речь идет о фосфолипидах, например о фосфатидной кислоте (РА). Следующими предпочтительными липидами с простой эфирной связью, которые находится в ненасыщенной форме в Archaea по изобретению, являются фосфатидилглицерин (PG), фосфатидилглицеринфосфат (PGP) или фосфатидилглицеринсульфат (PGS).

Данные упомянутые соединения при этом, прежде всего, находятся в насыщенной форме, а также в ненасыщенной форме в Archaea по изобретению. Данные соединения при этом могут иметь однократно или многократно ненасыщенные боковые цепи, например один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз или восемь раз ненасыщенные боковые цепи. Наконец, фосфолипиды могут находиться в форме димеров в виде кардиолипина.

Липиды с простой эфирной связью также могут находиться в виде ненасыщенных гликолипидов. Данные гликолипиды включают, в частности, ненасыщенные гликолипиды из группы, состоящей из моногликозилархеола (MGA), дигликозилархеола (DGA), дигликозилархеолсульфат сложного эфира (SDGA), дигликозилархеолдисульфат сложного эфира (S2-DGA), тригликозилархеола (TGA), тригликозилархеолсульфат сложного эфира (S-TGA), тетрагликозилархеолсульфат сложного эфира (S-TeGA), а также гликокардиолипина.

В одном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере часть ненасыщенных липидов с простой эфирной связью представляет собой ненасыщенный фосфатидилглицерин.

Хотя доля ненасыщенных липидов по отношению ко всему количеству липидов при повышении

- 3 031579 температуры, как и следовало ожидать, уменьшается, согласно данному изобретению удается увеличить абсолютное количество ненасыщенных липидов при увеличении температуры ферментации с 12 до 20°С, 25°С и, в частности, до 30°С, так как общий выход липидов при 30 и 25°С существенно выше, чем при 20°С или при 12°С. Таким образом, возможно получать ненасыщенные липиды с простой эфирной связью или соответственно композицию липидов, таких как липосомы, в большем экономически более выгодном объеме.

Далее, согласно данному изобретению получают клеточные оболочки или инактивированные клетки в форме чистой биомассы или в форме экстрактов. То есть известным способом полученные инактивированные клетки предоставляются в виде биомассы, которую получают непосредственно ферментацией. Альтернативно получают клеточные оболочки в форме биомассы или в форме экстракта. Специалистам известны способы получения клеточных оболочек из Archaea по изобретению.

В следующем аспекте данное изобретение относится к композициям липидов, в частности липосом, которые можно получить из Archaea по изобретению. Данные композиции липидов, в частности липосом, а также упомянутые клеточные оболочки или инактивированные клетки отличаются тем, что имеют содержание ненасыщенных липидов с простой эфирной связью по меньшей мере 10% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью. Предпочтительно данные композиции, инактивированные клетки и клеточные оболочки содержат ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, например 25%, в частности предпочтительно 30% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью.

Согласно данному изобретению композиции липидов, в частности липосом, а также клеточные оболочки или инактивированные клетки, содержащие ненасыщенные липиды с простой эфирной связью, предпочтительно можно получить из галофильных микроорганизмов Haloarcula sp. с регистрационным номером DSM22919, или DSM22920, или из Haloferax sp. с регистрационным номером DSM22921.

Согласно данному изобретению композиции липидов, в частности липосом, а также клеточные оболочки или инактивированные клетки отличаются тем, что они в большом количестве содержат ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в виде упомянутых соединений, с содержанием по меньшей мере 10%, предпочтительно 20% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью. Вследствие этого можно использовать полезные свойства ненасыщенных липидов с простой эфирной связью. При этом область применения включает известные для липидов с простой эфирной связью возможности, которые, например, описаны в WO 2004/103332 или в WO 93/08202.

В следующем аспекте данное изобретение относится к способу получения ненасыщенных липидов с простой эфирной связью, в частности липидов с простой эфирной связью общей формулы I

причем углеводородные цепи всего содержат от одной до восьми двойных связей и необязательно могут быть замещены,

R¹ представляет собой содержащий сахар радикал, который необязательно может быть замещен, или группу фосфатидила

О о ¹¹

R²O-P— I он причем R² представляет собой водород или радикал глицерина, причем радикал глицерина необязательно может быть замещен, предпочтительно замещен группами сульфатидила или фосфатидила, которые, в свою очередь, могут быть замещены алкильной цепью; включающему стадии культивирования Archaea по изобретению в питательной среде при температуре по меньшей мере 20°С, предпочтительно по меньшей мере 25°С.

Предпочтительно в способе по изобретению применяют Archaea по изобретению, в частности такие Archaea, как Archaea вида Haloarcula и Haloferax. Особенно предпочтительно для получения ненасыщенных липидов с простой эфирной связью применяют штаммы DSM22919, DSM22920 и соответственно DSM22921.

Способ по изобретению отличается тем, что культивирование Archaea происходит при температуре по меньшей мере 20°С, предпочтительно по меньшей мере 25°С. При этом температура культивирования может быть 30°С или выше, в частности 37°С или выше. После культивирования культивированные Archaea содержат ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве по меньшей мере 10% или по меньшей мере 15%, предпочтительно по меньшей мере 20%, в частности по меньшей мере 25% или по меньшей мере 30% по отношению ко всему количеству липидов с простой эфирной связью в Archaea.

Далее, способ по изобретению отличается тем, что при культивировании Archaea благодаря добавлению не менее 5% (об./об.) инокулята пропускается лаг-фаза. Инокулят может быть получен при бо

- 4 031579 лее высокой температуре, чем температура культивирования для получения биомассы, например при по меньшей мере 30°С, предпочтительно при 37°С, в то время как культивирование проводят согласно данному изобретению при более низкой температуре.

Далее, было неожиданно обнаружено, что выход ненасыщенных липидов в конце экспоненциальной фазы роста - после 3-4 дней ферментации - выше, чем когда продлевают ферментацию до стационарной фазы, которая соответствует максимальному выходу биомассы. Поэтому в способе по изобретению предпочтительно проводить культивирование Archaea до конца экспоненциальной фазы роста, например на протяжении 3-4 дней ферментации при 25°С. Соответственно предпочтительно биомассу собирают перед достижением стационарной фазы.

Далее, для получения ненасыщенных липидов с простой эфирной связью способ по изобретению включает стадию экстракции биомассы с органическим растворителем для отделения липидов.

При данной экстракции в частности применяют только хлороформ или его смесь, например, с метанолом и при необходимости с водой. Для разделения фаз предпочтительно применяют смесь из хлороформа и воды. В предпочтительном варианте осуществления последующее отделение липидов происходит, например, с помощью колонки с силикагелем. Данная стадия может включать предварительное кондиционирование колонки, например, хлороформом для того, чтобы отделить компоненты полученной после органической экстракции фракции, например красящие вещества. Фракция гликолипидов предпочтительно элюируется из колонки с силикагелем с помощью, например, ацетона. Затем может элюироваться из колонки с силикагелем фракция фосфолипидов, например, со спиртом, в частности с метанолом. Специалистам известны соответствующие способы.

Отделение отдельных ненасыщенных липидов с простой эфирной связью может происходить с помощью известных способов. Например, можно упомянуть способ хроматографии.

Соответственно можно получать ненасыщенные липиды с простой эфирной связью отдельно или в виде фракций различных ненасыщенных липидов с простой эфирной связью.

Способ экстракции липидов из клеточного вещества Archaea, в частности галофильных Archaea, и подтверждение с помощью LC-MS основываются на модификации описанного у Gibson et al. способа.

Способ по изобретению делает возможным препаративное получение ненасыщенных липидов с простой эфирной связью из Archaea по изобретению.

Производство Archaea по изобретению позволяет получать ненасыщенные липиды с простой эфирной связью и соответственно композиции липидов, включая клеточные оболочки и инактивированные клетки, содержащие ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве по меньшей мере 10% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью. Неожиданно было установлено, что в противоположность осуществлению, например, у Gibson et al., ненасыщенные липиды с простой эфирной связью также можно получать при температуре культивирования по меньшей мере 20°С, предпочтительно по меньшей мере 25°С в большом количестве. Вследствие этого возможно коммерческое применение данных ненасыщенных липидов с простой эфирной связью.

Archaea по изобретению представляют собой, в частности, Archaea из группы галофильных Archaea со свойствами, соответствующими зарегистрированным штаммам DSM22919, DSM22920 и DSM22921.

Далее данное изобретение разъясняется более подробно с помощью примеров без того, чтобы данное изобретение ограничивалось данными примерами.

Источник и условия культивирования Archaea.

Три Archaea по изобретению - штаммы DSM22919, DSM22920 и DSM22921 получали в солесодержащей среде хранения от предприятия Werkes Sigmundshall der K+S Kali GmbH. DSM5036 получали от фирмы DSMZ GmbH, Брауншвейг.

Культивирование применяемых в примере галофильных Archaea для получения ненасыщенных липидов с простой эфирной связью проводили следующим образом:

Питательная среда DSMZ номер 372 (модифицированная)

Дрожжевой экстракт	5 г
Гидролизат казеина	5 г
Натрия-Ь-глутамат-моногидрат	1 г
Тринатрийцитрат	3 г
NaCl	200 г
КС1	2 г
MgSO₄ ·7Η₂Ο	20 г
FeCl₂·6Η₂Ο	3 6 мг
Хлорид марганца - основной раствор	1 мл
Extran® АР31 (пеногаситель)	200 мкл
Деионизированная вода	До 1000 мл
Хлорид марганца - основной раствор
МпС1₂ -4Н₂О	3 6 мг
Деионизированная вода	До 100 мл

- 5 031579 pH-Wert питательной среды с помощью KOH устанавливали от 7,0 до 7,2, и среду 20 автоклавировали при 121°С.

Культуру при стерильных условиях инокулировали в 25 мл питательной среды и в 100 мл колбе Эрленмеера на виброкруге при примерно 120 об/мин при 37°C инкубировали 7 дней. Затем культуру переносили в 225 мл питательной среды и еще 7 дней инкубировали при 37°C и 120 об/мин на виброкруге. Полученный инокулят помещали в 4750 мл питательной среды с приведенным выше составом и с магнитной мешалкой при 650 об/мин при 25°C еще 4 дня инкубировали. Культуру промывали водой примерно 3,8 л/мин и продували увлажненным воздухом посредством мембранного насоса с помощью стерильного силиконового кольцевого шланга для продувания. Таким образом полученную биомассу отделяли от питательной среды центрифугированием (7000 об/мин, 6566 г) 20 мин. Клеточный центрифугат промывали 20 мл основным солевым промывочным раствором и снова 20 мин центрифугировали 6566 г. При необходимости данный полученный центрифугат биомассы затем при -80°С до последующей переработки замораживали.

Основной солевой промывочный раствор

NaCl	200 г
КС1	2 г
MgSO₄ ·7Η₂Ο	20 г
Деионизированная вода	До 1000 мл

Экстракция.

К клеточному центрифугату массой примерно 30 г в 250 мл мерную бутылку с крышкой добавляли 120 мл экстракционного раствора (CHCl₃/МеОН/Н₂О, 5/10/4, об./об./об.), и бутылку закрывали. После сильного встряхивания до полного ресуспендирования клеточного цетрифугата бутылку на 15 мин помещали в охлажденную ультразвуковую баню. С помощью мерного цилиндра добавляли 32 мл хлороформа и 32 мл HPLC-воды. Мерную бутылку с крышкой снова закрывали и сильно встряхивали. На данной стадии после центрифугирования образовывалась 3-фазная система (фаза хлороформа/клеточные компоненты/водная фаза).

После центрифугирования при примерно 2500 об/мин (примерно 1900 г) в течение 10 мин при примерно 4°С одноразовым шприцем с длинной стальной канюлей отбирали нижнюю фазу (примерно 60 мл хлороформа) и переносили в 100 мл мерную бутылку с крышкой. Для изолирования фазы хлороформа добавляли одну ложку обезвоженного сульфата натрия, закрывали бутылку и сильно встряхивали.

После центрифугирования при примерно 3000 об/мин в течение 5 мин при 4°С жидкую фракцию декантировали, а остаток отбирали с помощью пипетки Пастера и переносили в 100 мл круглодонную колбу. Хлороформ при 30°С в вакууме сгущали примерно на 1/3 от исходного объема.

Очищение неочищенного экстракта с помощью колонки с силикагелем.

Твердофазную колонку BAKERBOND Silica Gel (5 г основа колонки) закрепляют на штативе и предварительно кондиционируют хлороформом. Для этого пипеткой добавляют 20 мл хлороформа и оставляют проходить без повышенного или пониженного давления.

Получение фракции хлороформа для извлечения красящих веществ.

Полученный, как указано выше, экстракт хлороформа (примерно 20 мл; в колонку можно загружать до 100 мл) загружают в твердофазную колонку. Экстракт стекает медленно без повышенного или пониженного давления. Бутылку из коричневого стекла ставят под колонку и для элюирования в колонку добавляют 20 мл хлороформа. После того как весь растворитель проходит, одноразовым шприцем (с помощью переходника для колонки) примерно 50 мл воздуха медленно пропускают через колонку для того, чтобы остаток хлороформа выдавить в бутылку из коричневого стекла.

Получение фракции ацетона для извлечения гликолипидов.

Следующую бутылку из коричневого стекла ставят под колонку и в колонку загружают 20 мл ацетона. Когда все элюирующее средство проходит через колонку, одноразовым шприцем через колонку медленно пропускают примерно 50 мл воздуха для того, чтобы остатки ацетона выдавить в бутылку из коричневого стекла.

Получение фракции метанола для извлечения фосфолипидов.

Следующую бутылку из коричневого стекла ставят под колонку и в колонку загружают 90 мл метанола. Когда все элюирующее средство проходит через колонку, одноразовым шприцем через колонку медленно пропускают примерно 50 мл воздуха для того, чтобы остатки метанола выдавить в бутылку из коричневого стекла.

Измерения.

Определение фракций липидов происходило с помощью LC-ESI-MS.

Условия хроматографии.

- 6 031579

Система:

Varian 320-MS

Предварительная колонка:	RP18
Разделительная колонка:	Varian Polaris RP18, 150*2 мм, 3 мкм
Температура колонки:	30°С
Элюент:	Метанол/вода/ЫН₄-Ас, 94/4/2 (об./об./об.)
Градиент:	Без, изократический
Поток:	0,3 мл/мин
Обнаружение:	Масс-спектрометр
Объем впрыскивания:	5-20 мкл (мкл-pickup способ)
Время прохождения:	60 мин

Обнаружение с помощью масс-спектрометрии.

Источник ионов: ESI

Режим сканирования:	Центроидный
Ширина SIM:	Всего 0,700 а.е.м.
Детектор:	EDR Выключение источника после

завершения прогона

Сегменты:

Газ CID:

Выключено

Требуемое время сканирования:

1,520 с

Выбор ширины пика:

Ширина пика Q1 1,00

Ширина пика Q3 1,50

Напряжение на иглах

ESI, отрицательное:

-4500,00

Напряжение на защитном экране

-600,00

ESI, отрицательное:

Температура сушильного газа:

300,00

Температура корпуса API:

50,00

Давление распыляемого газа:

55,00

Давление сушильного газа:

18,00

Клапан с отверстиями:

Получение данных:

На фиг. 2 показаны типичные результаты

Включено анализа липидов с простой эфирной связью, в данном случае PG, в штамме по изобретению DSM22921. Обнаруживаются все формы ненасыщенных PG с количеством двойных связей до шести.

На фиг. 1 представлено содержание насыщенных и ненасыщенных липидов в Archaea по изобретению и в описанном у Gibson et al., штамме DSM5036. Явно видно, что содержание ненасыщенных липидов в штамме по изобретению существенно выше, чем у известных штаммов Archaea.

Подробный анализ ненасыщенных липидов с простой эфирной связью для PG и PGS представлен на фиг. 3. Как показано, во всех полученных штаммах обнаруживаются указанные ненасыщенные фор мы.

На фиг. 4 показано содержание ненасыщенных липидов с простой эфирной связью после получения соответствующих биомасс при различных температурах. Явно видно, что при более высоких температурах культивирования Archaea по изобретению получают ненасыщенные фосфолипиды в большем количестве.

Далее, проводили исследование зависимости от продолжительности ферментации. Проводили культивирование, как описано выше, с различной продолжительностью. В различные моменты биомассу собирали описанным выше способом и анализировали содержание липидов. Результаты представлены на фиг. 5. Видно, что содержание ненасыщенных липидов с простой эфирной связью в фазе роста (дни от 3 до 4) превышает содержание ненасыщенных липидов с простой эфирной связью в стационарной фазе. Поэтому предпочтительно производят сбор биомассы перед началом стационарной фазы.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Микроорганизм Archaea, отличающийся тем, что он относится к классу Halomebacteria, семейству Halobacteriacae, и при культивировании при 25°С содержит ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве по меньшей мере 10% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью, причем указанные ненасыщенные липиды с простой эфирной связью имеют общую формулу (I)

- 7 031579 причем углеводородные цепи всего имеют от одной до восьми двойных связей где

R¹ представляет собой содержащий сахар радикал или группу фосфатидила

О η и r²O-pI он где R² представляет собой водород или остаток глицерина, причем остаток глицерина может быть замещен группами сульфатидила или фосфатидила, которые, в свою очередь, могут быть замещены алкильной цепью, где содержащий сахар радикал содержит моногликозил- (MG), дигликозил- (DG), дигликозилсульфат сложного эфира (S-DG), дигликозилдисульфат сложного эфира (S2-DG), тригликозил (TG), тригликозилсульфат сложного эфира (S-TG), тетрагликозилсульфат сложного эфира (S-TeG) или гликокардиолипин.
2. Микроорганизм Archaea по п.1, отличающийся тем, что он содержит ненасыщенные липиды с простой эфирной связью в количестве по меньшей мере 20% по отношению к общей массе липидов с простой эфирной связью.
3. Микроорганизм Archaea по п.1 или 2, отличающийся тем, что он относится к роду Haloarcula или Haloferax.
4. Микроорганизм Archaea по п.3, отличающийся тем, что он относится к Archaea рода Haloarcula с регистрационным номером DSM22919 и DSM22920.
5. Микроорганизм Archaea по п.3, отличающийся тем, что он относится к Archaea рода Haloferax с регистрационным номером DSM22921.
6. Микроорганизм Archaea по любому из пп.1-5, содержащий по меньшей мере один вид указанных ненасыщенных липидов с простой эфирной связью с четырьмя или шестью двойными связями в указанном углеводородном радикале.
7. Микроорганизм Archaea по любому из пп.1-6, где R¹ представляет собой группу фосфатидила, a R² представляет собой остаток глицерина, а по меньшей мере часть указанных ненасыщенных липидов с простой эфирной связью представляет собой археолфосфатидилглицерин.
8. Косметическая композиция, содержащая экстракт липидов с простой эфирной связью из микроорганизма Archaea по любому из пп.1-7.
9. Композиция по п.8, где липиды представляют собой липосомы.
10. Композиция по п.8, содержащая ненасыщенные липиды с простой эфирной связью, полученные из микроорганизмов Archaea рода Haloarcula с регистрационным номером DSM22919, DSM22920 или рода Haloferax с регистрационным номером DSM22921.
11. Способ получения ненасыщенных липидов с простой эфирной связью общей формулы (I) причем углеводородные цепи всего имеют от одной до восьми двойных связей и способны быть замещенными, где

R¹ представляет собой содержащий сахар радикал или группу фосфатидила

О η и

R2Q-PI он где R² представляет собой водород или остаток глицерина; где содержащий сахар радикал содержит моногликозил- (MG), дигликозил- (DG), дигликозилсульфат сложного эфира (S-DG), дигликозилдисульфат сложного эфира (S2-DG), тригликозил (TG), тригликозилсульфат сложного эфира (S-TG), тетрагликозилсульфат сложного эфира (S-TeG) или гликокардиолипин, включающий стадию добавления инокулята микроорганизмов Archaea по любому из пп.1-7 к культуральной среде и культивирование его при температуре по меньшей мере 20°С, для того чтобы получить биомассу, содержащую липиды с простой эфирной связью;

стадию экстракции полученной биомассы с органическим растворителем для отделения липидов;

стадию отделения липидов с помощью колонки с силикагелем;

стадию очистки или концентрирования липидов.
12. Способ по п.11, где R² представляет собой остаток глицерина, причем глицерин замещен группами сульфатидила или фосфатидила, которые, в свою очередь, могут быть замещены алкильной цепью.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что культивирование микроорганизмов Archaea в питательной среде происходит при температуре по меньшей мере 25°С.
14. Способ по любому из пп.11-13, отличающийся тем, что биомассу собирают перед достижением

- 8 031579 стационарной фазы.
15. Способ по любому из пп.11-14, отличающийся тем, что к питательной среде добавляют инокулят в количестве по меньшей мере 5% (об./об.).
16. Способ по одному из пп.11-15, отличающийся тем, что инокулят культивируют по меньшей мере при 30°С.
17. Способ по одному из пп.11-16, отличающийся тем, что культивируют микроорганизмы, принадлежащие к штаммам DSM22919, DSM22920 или DSM22921.
18. Способ по одному из пп. 11-17, где стадию очистки или концентрирования липидов выполняют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

Содержание липидов при 25°С

100