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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtastung einzelner Bereiche in der Scanmikroskopie. Wobei die interessierende Bereiche über das gesamte Bildfeld verteilt sind. Dabei kann unter Beibehaltung der Scanbewegung schnell zwischen den einzelnen interessierenden Bereichen gewechselt werden. Dabei kann die Scanbewegung durch eine geeignete Bewegung eines Scanspiegels durchgeführt werden.
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Des weiteren betrifft die Erfindung eine Anordnung zur Strahlsteuerung in der Scanmikroskopie.
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Hinzu kommt, dass die Erfindung ein Scanmikroskop betrifft, das eine Anordnung zur Strahlsteuerung umfasst, die es erlaubt unter Beibehaltung der Scanbewegung schnell zwischen den einzelnen interessierenden Bereichen zu wechseln. Das Scanmikroskop kann auch als konfokales Mikroskop ausgestaltet sein. Im besonderen wird im Scanmikroskop von einem Beleuchtungssystem erzeugten Lichtstrahl unter Zwischenschaltung mehrerer optischer Mittel über ein Objekt führt und mindestens einen Detektor, der über die mehreren optischen Mittel ein vom Objekt ausgehendes Licht empfängt.
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In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so daß ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt, wobei sowohl schnelle resonante als auch langsamere (genauere) nichtresonante Galvanometer-Stellelemente zum Einsatz kommen. Um eine Probe in der Objektebene abzutasten ist es wichtig, daß die Drehachsen der Spiegel in oder zumindest nahe bei einer zur Fokusebene konjugierten Ebene liegen, die auch als Fourierebene bezeichnet wird. Eine mögliche Strahlablenkeinrichtung, die die Anforderungen an eine telezentrische Abbildung erfüllt, ist beispielsweise aus der
DE 196 54 210 A1 bekannt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Aus der Scanning-Ophthalmoskopie sind weitere Beispiele für die Verwendung von Strahlablenkeinrichtungen bekannt:
In
DE 197 33 995 A1 weist dabei das Scanning-Ophthalmoskop die Möglichkeit auf, während der Untersuchung den abzuscannenden Bereich in Größe und Position zu verändern.
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In
US 5 430 509 A wird ein Scanning-Ophthalmoskop mit drei oder mehr hintereinandergeschalteten Mitteln zur Durchführung der Scanbewegung offenbart.
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Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
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Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so daß man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.
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Idealerweise beschreibt die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt einen das gesamte Bildfeld ausfüllenden Mäander. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann bei konstanter y-Position diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u. s. w.). Bei hohen Strahlablenkgeschwindigkeiten kommt es auf Grund der Massenträgheit der ablenkenden bewegten Bauteile, beispielsweise der Galvanometerwelle und der Spiegel, zu Abweichungen von der Idealbahn. Tatsächlich beschreibt die Scanbahn des Lichtstrahles bei brauchbaren Scanraten (> 100 Hz) eine Sinuskurve, was sogar eine Korrektur der sich daraus ergebenden Abweichungen vom Idealfall nötig werden lässt.
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Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in festen Zeitabständen während des Abtastvorganges gemessen und so Rasterpunkt für Rasterpunkt abgetastet. Der Messwert muss eindeutig der dazugehörigen Scanposition zugeordnet werden, um aus den Messdaten ein Bild erzeugen zu können. Zweckmäßiger Weise werden hierfür die Zustandsdaten der Verstellelemente der Strahlablenkeinrichtung laufend mitgemessen oder, was allerdings weniger genau ist, direkt die Steuersolldaten der Strahlablenkeinrichtung verwendet.
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Bei einigen mikroskopischen Anwendungen ist der Benutzer nur an Informationen über einzelne Bereiche innerhalb des Bildfeldes interessiert, während die umgebenden Probenbereiche nicht interessieren. Die interessierenden Bereiche sollen darüber hinaus möglichst schnell hintereinander abgetastet werden.
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Mit den bekannten Anordnungen ist eine Abtastung einzelner interessierender Probenbereiche nur eingeschränkt möglich. Eine Abtastung des gesamten Bildfeldes und anschließende Selektion der Daten der interessierenden Bereiche ist hinsichtlich der geforderten schnellen aufeinanderfolgenden Informationsgewinnung über die interessierenden Bereiche wenn überhaupt nur eingeschränkt einsetzbar.
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Besser ist die Lösung, die einzelnen interessierenden Bereiche sequentiell abzutasten. Es ist prinzipiell möglich, die Strahlablenkeinrichtung so anzusteuern, daß jeder der interessierenden Bereiche für sich beispielsweise mäanderförmig abgetastet wird und die nicht interessierenden Umgebungsbereiche nicht abgetastet werden. Diese Vorgehensweise ist jedoch nur dann möglich, wenn die Strahlablenkeinrichtung es erlaubt, den Abtastlichtstrahl gezielt zu steuern und gezielt auf einzelne Punkte im Bildfeld zu lenken.
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Insbesondere bei der Verwendung resonant arbeitender Strahlablenkeinrichtungen, die beispielsweise auf der Verwendung von resonanten Galvanometern oder Mikrospiegeln beruhen, ist dies nicht möglich; denn diese Strahlablenkeinrichtungen arbeiten ausschließlich mit der jeweiligen baulich bedingten Resonanzfrequenz. Ein „Parken” des Lichtstrahles in einem Bereich des Bildfeldes ist nicht möglich. Auch bei schnell ablenkende nicht resonant arbeitende Strahlablenkeinrichtungen treten hinsichtlich der gezielten Positionierbarkeit Schwierigkeiten auf, da die Stellelemente aufgrund ihrer Trägheit nur verzögert auf ein Ansteuersignal reagieren.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren Abtastung mikroskopischer Präparate mit einem Lichtstrahl anzugeben, die die aufgezeigten Probleme löst.
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Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst mit folgenden Schritte:
- • Aufnehmen eines Voransichtsbildes;
- • Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs im Voransichtsbild;
- • Verschieben des Scanfeldes auf den interessierenden Bereich mittels einer ersten Strahlablenkeinrichtung; und
- • Aufnehmen eines Bildes durch mäanderförmiges Abtasten des interessierenden Bereichs mit einer zweiten Strahlablenkeinrichtung,
dadurch gekennzeichnet, dass die erste und die zweite Strahlablenkeinrichtung mit je zwei Strahlablenkmodulen ausgestaltet sind und dass die Strahlablenkmodule durch einen kardanisch aufgehängten Spiegel oder einen Mikrospiegel oder einen Akusto-Optischen-Deflektor oder einen Galvanometerspiegel oder ein resonant schwingendes Spiegelsystem gebildet sind.
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Erfindungsgemäß ist erkannt worden, daß man auf die Verwendung von schnellen oder resonanten Strahlablenkeinrichtungen nicht zu verzichten braucht, wenn man das von der ersten Strahlablenkeinrichtung überstrichene Scanfeld mit Hilfe einer weiteren geeigneten Strahlablenkeinrichtung, die eine exakte Positionierung erlaubt, innerhalb des Bildfeldes auf die interessierenden Bereiche verschiebt.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es eine Anordnung zur Strahlsteuerung in einem Scanmikroskop zu schaffen, die es ermöglicht schnell zwischen mehreren interessierenden Bereichen einer Probe zu wechseln und dabei nach einem konstanten Muster Information von interessierenden Bereichen zu sammeln.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Anordnung zur Strahlsteuerung in einem Scanmikroskop wobei das Scanmikroskop Mittel zum Aufnehmen und Darstellen eines Voransichtsbildes und eine Mikroskopoptik umfasst und wobei die Anordnung
- • Mittel zum Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs im Voransichtsbild;
- • eine erste Strahlablenkeinrichtung zum Verschieben des Scanfeldes auf den interessierenden Bereich; und
- • eine zweite Strahlablenkeinrichtung zur mäanderförmigen Abtastung innerhalb des Scanfeldes umfasst,
dadurch gekennzeichnet, dass die erste und die zweite Strahlablenkeinrichtung mit je zwei Strahlablenkmodulen ausgestaltet sind und dass die Strahlablenkmodule durch einen kardanisch aufgehängten Spiegel oder einen Mikrospiegel oder einen Akusto-Optischen-Deflektor oder einen Galvanometerspiegel oder ein resonant schwingendes Spiegelsystem gebildet sind.
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In einer besonderen Ausführungsform ist erfindungsgemäß eine Abbildungsoptik zwischen den Strahlablenkeinrichtungen vorgesehen, um das Prinzip der telezentrischen Abtastung zu gewährleisten.
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Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, Scanmikroskop zu schaffen, das eine schnelle sequentielle Abtastung von interessierenden Probenbereichen ermöglicht.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Scanmikroskop, das
- • Mittel zum Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs im Voransichtsbild;
- • eine erste Strahlablenkeinrichtung zum Verschieben des Scanfeldes auf den interessierenden Bereich; und
- • eine zweite Strahlablenkeinrichtung zur mäanderförmigen Abtastung innerhalb des Scanfeldes umfasst,
dadurch gekennzeichnet, dass die erste und die zweite Strahlablenkeinrichtung mit je zwei Strahlablenkmodulen ausgestaltet sind und dass die Strahlablenkmodule durch einen kardanisch aufgehängten Spiegel oder einen Mikrospiegel oder einen Akusto-Optischen-Deflektor oder einen Galvanometerspiegel oder ein resonant schwingendes Spiegelsystem gebildet sind.
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Die Erfindung hat den Vorteil, dass man auf die Verwendung von schnellen oder resonanten Strahlablenkeinrichtungen nicht zu verzichten braucht, wenn man das von der ersten Strahlablenkeinrichtung überstrichene Scanfeld mit Hilfe einer zweiten geeigneten Strahlablenkeinrichtung, die eine exakte Positionierung erlaubt, innerhalb des Bildfeldes auf die interessierenden Bereiche verschiebt. Idealerweise beschreibt die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt eine Rechteckkurve (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann bei konstanter y-Position diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u. s. w.). Die Abtastbahn weicht bei zunehmend höherer Abtastgeschwindigkeit mehr und mehr von der Rechteckform ab. Dieses Phänomen ist im Wesentlichen auf die Massenträgheit der bewegten Elemente zurückzuführen. Bei schnellem Abtasten ähnelt die Abtastbahn eher einer Sinuskurve. Das Scanfeld wird dabei derart von dem Lichtstrahl überstrichen, dass die Umkehrpunkte der sinusförmigen Bahn außerhalb des interessierenden Bereichs liegen. Somit beschreibt der Abtastlichtstrahl auf dem interessierenden Bereich annähernd geradlinige Bahnen.
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In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
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1 eine schematische Darstellung der Auswahl der interessierenden Bereiche
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2 eine schematische Darstellung des Verlaufs der Abtastbahn
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3 ein Scanmikroskop mit der erfindungsgemäßen Anordnung
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4 ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop,
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5 eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Scanmikroskops und
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6 eine weitere Ausführungsform des Scanmikroskops mit einer erfindungsgemäßen Anordnung.
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1 zeigt einen PC 1 mit einem Monitor 3 und einer Cursorsteuerung 5. In einer Ausbildungsform ist die Cursorsteuerung 5 eine Computermaus. Weitere Möglichkeiten für eine Cursorsteuerung 5 sind z. B. ein Joystick, ein Trackball oder jede andere denkbare Einrichtung zur Cursorsteuerung. Auf dem Monitor wird ein Voransichtsbild 7 des gesamten Bildfeldes 19 dargestellt. Mit Hilfe des Computermaus werden an Hand des Mauszeigers 9 die Bildausschnitte 11, 13 der interessierenden Bereiche 27, 29 markiert. Die Markierung ist Form vom Umrandungslinien 15, 17 dargestellt.
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2 zeigt eine schematische Darstellung des Verlaufs der Abtastbahn, die sich aus den Teilabtastbahnen 21, 23 und 25 zusammensetzt. Die Teilabtastbahnen 21 und 25 werden von einer schnellen, resonanten Strahlablenkeinrichtung verursacht, während die Teilabtastbahn 23 von einer Strahlablenkeinrichtung zur gezielten Positionierung verursacht ist. Der interessierende Bereich 27 wird von der Teilabtastbahn 21 durchzogen, während der interessierende Bereich 29 von der Teilabtastbahn 25 durchzogen wird. Es werden folglich sequentiell die Scanfelder 31 und 33 abgetastet. Durch die Verschiebung der Scanfelder 31, 33 mit Hilfe der zweiten Strahlablenkeinrichtung zur gezielten Positionierung wir die Teilabtastbahn 23 überstrichen.
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3 zeigt schematisch ein konfokales Scanmikroskop. Der von einem Beleuchtungssystem
35 kommende Lichtstrahl
37 wird von einem Strahlteiler
39 über den Umlenkspiegel
41 zur ersten Strahlablenkeinrichtung
43 zur gezielten Positionierung reflektiert, die einen nicht gezeigten kardanisch aufgehängten Scanspiegel beinhaltet und zur Verschiebung des Scanfeldes in einer zur Beleuchtungsrichtung senkrechten Ebene dient. Über eine Zwischenabbildung mit Hilfe einer Abbildungsoptik
47, die ein Zwischenfokusebene
45 erzeugt, gelangt der Lichtstrahl
37 zur zweiten Strahlablenkeinrichtung
49, die als K-Spiegel (siehe
DE 196 54 210 ) ausgeführt ist und zwei nicht gezeigte resonante Galvanometer beinhaltet. Die zweite Strahlablenkeinrichtung
49 dient zur mäanderförmigen Abtastung innerhalb des Scanfeldes. Die Größe eines Scanfeldes kann durch Festlegung der Auslenkwinkel der Galvanometer variiert werden. Der Lichtstrahl
37 wird folglich über die Scanlinse
55, die Optik
57 und durch die Mikroskopoptik
51 hindurch über bzw. durch die Probe
53 geführt. Der Lichtstrahl
37 wird bei nicht transparenten Objekten
15 über die Objektoberfläche geführt. Bei biologischen Proben (Präparaten) oder transparenten Proben kann der Lichtstrahl
37 auch durch die Probe
53 geführt werden. Dies bedeutet, dass aus verschiedenen Fokusebenen der Probe
53 nacheinander durch den Fokus des Lichtstrahls
37 abgetastet werden. Das von der Probe
53 ausgehende Detektionslicht
59 gelangt auf umgekehrtem Lichtweg über die erste und die zweite Strahlablenkeinrichtung
43,
49 zurück zum Strahlteiler
39, passiert diesen, um anschließend mit Detektor
61 nachgewiesen zu werden. Der Detektor
61 umfasst einen Photomultiplier, der die detektieren Lichtinformationen in elektrische Signale übersetzt. Die nachträgliche Zusammensetzung der Signale und Zuordnung zu den jeweiligen Abtastpositionen ergibt dann ein dreidimensionales Bild des interessierenden Bereichs
27,
29 der Probe
53. Das bei einem konfokalen Scanmikroskop üblicherweise vorgesehene Beleuchtungspinhole
63 und das Detektionspinhole
65 sind der Vollständigkeit halber schematisch eingezeichnet. Weggelassen sind wegen der besseren Anschaulichkeit hingegen einige optische Elemente zur Führung und Formung der Lichtstrahlen. Diese sind einem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann hinlänglich bekannt.
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4 zeigt ein konfokales Scanmikroskop mit einer ersten Strahlablenkeinrichtung 67 zur gezielten Positionierung, die. Zur schnellen Abtastung des Scanfeldes ist die zweite Strahlablenkeinrichtung 72 vorgesehen, die aus einem ersten und einem zweiten Strahlablenkmodul 71 und 75 gebildet ist. Beide Strahlablenkmodule 71 und 75 können z. B. je einen resonant schwingenden Mikrospiegel beinhalten. Zwischen der ersten Strahlablenkeinrichtungen 67, und dem ersten und zweiten Strahlablenkmodul 71 und 75 sind zur Aufrechterhaltung des telezentrischen Prinzips die Abbildungsoptiken 69, 73 vorgesehen.
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5 zeigt ein konfokales Scanmikroskop mit insgesamt vier Strahlablenkmodule 77, 79, 81, 83, die auf jeweils zwei Strahlablenkeinrichtungen 78 und 82 verteilt sind. Die Strahlablenkmodule 77 und 81 lenken in x-Richtung ab, während die Strahlablenkmodule 79 und 83 in y-Richtung ablenken. Die Strahlablenkeinrichtung 78 dient zur Positionierung des Scanfeldes 31, 33. Sie beinhaltet z. B. nicht resonant arbeitende Galvanometer. Die Strahlablenkeinrichtung 82 arbeitet resonant und dient zur mäanderförmigen Abtastung des Scanfeldes 31, 33. Die Strahlablenkmodule 77, 79 und 81, 83 sind nahe den zur Fokusebene der Mikroskopoptik 51 konjugierten Ebenen 89 bzw. 87 angeordnet. Zur Wahrung des telezentrischen Prinzips ist die Abbildungsoptik 85 vorgesehen.
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6 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel eines konfokalen Scanmikroskops. Zur Positionierung des Scanfeldes 31, 33 dient hier der kardanisch aufgehängte, nicht resonant angetriebene Spiegel 91. Der in y-Richtung ablenkende, von einem resonanten Galvanometer angetriebene Spiegel 93 und der in x-Richtung ablenkende, von einem resonanten Galvanometer angetriebene Spiegel 95 sind zur Wahrung des telezentrischen Abtastprinzips nahe der zur Fokusebene der Mikroskopoptik 51 konjugierten Ebene 99 angeordnet. Zwischen Spiegel 93 und 91 befindet sich die Abbildungsoptik 98, die aus den Optiken 97 und 101 zusammengesetzt ist und die im Drehpunkt des Spiegels 91 eine weitere zur Fokusebene der Mikroskopoptik 51 konjugierte Ebene 99 erzeugt. Die zweite Strahlablenkeinrichtung 94 besteht in diesem Ausführungsbeispiel aus den Spiegeln 93 und 95.
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Die erste Strahlablenkeinrichtung 43, 67, 78 und/oder zweite Strahlablenkeinrichtung 49, 72, 82, 94 beinhaltet unter anderem einen kardanisch aufgehängte Spiegel oder einen Mikrospiegel oder einen Akusto-Optischen-Deflektor oder einen Galvanometerspiegel oder ein resonant schwingendes Spiegelsystem.
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Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- PC
- 3
- Monitor
- 5
- Cursorsteuerung
- 7
- Voransichtsbild
- 9
- Mauszeiger
- 11
- Bildausschnitt
- 13
- Bildausschnitt
- 15
- Umrandungslinie
- 17
- Umrandungslinie
- 19
- Bildfeld
- 21
- Teilabtastbahn
- 23
- Teilabtastbahn
- 25
- Teilabtastbahn
- 27
- interessierender Bereich
- 29
- interessierender Bereich
- 31
- Scanfeld
- 33
- Scanfeld
- 35
- Beleuchtungssystem
- 37
- Lichtstrahl
- 39
- Strahlteiler
- 41
- Umlenkspiegel
- 43
- erste Strahlablenkeinrichtung
- 45
- Zwischenfokusebene
- 47
- Abbildungsoptik
- 49
- zweite Strahlablenkeinrichtung
- 51
- Mikroskopoptik
- 53
- Probe
- 55
- Scanlinse
- 57
- Optik
- 59
- Detektionslicht
- 61
- Detektor
- 63
- Beleuchtungspinhole
- 65
- Detektionspinhole
- 67
- erste Strahlablenkeinrichtung
- 69
- Abbildungsoptik
- 71
- erstes Strahlablenkmodul
- 72
- zweite Strahlablenkeinrichtung
- 73
- Abbildungsoptik
- 75
- zweites Strahlablenkmodul
- 77
- erstes Strahlablenkmodul
- 78
- erste Strahlablenkeinrichtung
- 79
- zweites Strahlablenkmodul
- 81
- erstes Strahlablenkmodul
- 82
- zweite Strahlablenkeinrichtung
- 83
- zweites Strahlablenkmodul
- 85
- Abbildungsoptik
- 87
- konjugierte Ebene
- 89
- konjugierte Ebene
- 91
- Spiegel
- 93
- Spiegel
- 94
- zweite Strahlablenkeinrichtung
- 95
- Spiegel
- 97
- Optik
- 98
- Abbildungsoptik
- 99
- konjugierte Ebene
- 101
- Optik
