DE10028901A1 - Arminosäuresequenz - Google Patents
ArminosäuresequenzInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
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Description
1. Mit Hilfe der Aminosäuresequenz eines G Protein gekoppelten Rezeptors wurde durch
Homologiesuche in einer Datenbank ein potentielles Gen für einen neuen G Protein
gekoppelten Rezeptor auf dem humanen Chromosom 19 identifiziert. Aus der Gensequenz
wurden Oligonukleotide zur Amplifikation des potentiellen Rezeptorgens und dessen
abgeleiteter cDNA (mRNA) Sequenz hergestellt und für die PCR-Amplifikation des Gens und
der cDNA eingesetzt. Mittels dieser Primer konnte das intronlose Gen aus humaner
genomischer DNA kloniert und sequenziert werden. Weiterhin konnte mit anderen Primern
die cDNA für die volle kodierende Region des Gens aus einer humanen Gehirn-cDNA-Bank
hergestellt werden.
Sequenzierung des Gens und der cDNA ergaben folgende Eigenschaften des Gens: das Gen
(5640 Basenpaare) enthält (wie viele Gene von G Protein gekoppelten Rezeptoren) keine
Introns im kodiereneden Bereich. Der kodierende Bereich des Gens (Pos. 2501 bis 3694)
besteht aus einem offenem Leseraster von 1194 Basen und kodiert somit ein Protein von 398
Aminosäuren. Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt, daß es sich um einen
G Protein gekoppelten Rezeptor mit sieben transmembranalen Domänen handelt. Die
Aminosäuresequenz ist neu und bisher unbekannt und weist die beste Homologie (87%
Identität und 91% Homologie) zum (Endothel-differentiation-gene) Rezeptor EDG-8 der
Ratte auf. Dieser Rezeptor gehört zur Familie der Spingosin-1-Phosphat-Rezeptoren welche
u. a. wichtige Signalfunktionen auf im Gehirn und anderen Geweben vermitteln. Aufgrund der
Homologie unseres neuen Rezeptors zur Familie der EDG-Rezeptoren ist es
höchstwahrscheinlich, daß auch dieser Rezeptor zur Familie gehört und das humane
Gegenstück zum EDG-8-Rezeptor der Ratte ist. Erste funktionelle Untersuchungen mit dem
transfizierten Rezeptor bestätigen diese Annahme. Wir haben dem Rezeptor daher den Namen
hEDG-8 gegeben. Weiterhin gehören zu der zu patentierenden Sequenz 2500 Basen des 5'
nichttranslatierten Bereichs des Gens, welche vermutlich den Promotor (mit GC Boxen und
CAP Signalen) enthalten, sowie 1946 Basen des 3' nichttranslatierten Gen-Bereichs, welcher
mehrere typische Polyadenylierungssignale (AATAAA) im Bereich von 4500 bis 4800
enthält.
2. Die Expression dieses Gens wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und Primern
(sense: 5'GTATCTTGCCTCTCCAACAG 3';
antisense: 5'CTTGGGAAGACAGTCGTGG 3), welche die kodierende Region des Gens flankieren nachgewiesen. Dazu wurde folgendes Temperaturprogramm für die PCR verwendet: 94°C 1 min, 56°C 1 min, 72°C 3 min, 35 Zyklen. Wir konnten so die volle kodierende cDNA (offenes Leseraster) dieses Rezeptors aus einer humanen Gehirn-cDNA- Bank amplifizieren und klonieren. Hiermit ist die Expression der mRNA dieses Rezeptors in humanem Gehirn eindeutig bewiesen. PCR mit genomischer DNA und diesen Primern ergab eine Bande von identischer Größe und durch Sequenzierung wurde eindeutig bewiesen, daß das Gen intronlos ist. Weiterhin konnte durch Homologiesuche in Datenbanken von exprimierten Sequenzstücken humaner Gene (EST = expressed sequence tags) fünf exprimierte Sequenzen mit 100%iger Identität zu einem Sequenzstück der kodierenden Region des hEDG-8 Gens bzw. mRNA gefunden, welche aus humanen Multiple-Sklerose- Läsionen (3 ×), humaner Niere (1 ×) und humanem Adenokarzinom (1 ×) stammen. Das mehrfache Auffinden von ESTs des hEDG-8 Rezeptors aus Multiple-Sklerose-Läsionen zeigt, dass dieser Rezeptor in den Multiple-Sklerose-Läsionen stark exprimiert wird. Da EDG- Rezeptoren in Oligodendrozyten als Angriffspunkt neu zu entwickelnder Pharmaka gegen demyelinisierende Erkrankungen angesehen werden, ist der EDG-8 ein Rezeptor an welchem solche Pharmaka entwickelt werden können und an welchem dann auch diese Pharmaka angreifen.
antisense: 5'CTTGGGAAGACAGTCGTGG 3), welche die kodierende Region des Gens flankieren nachgewiesen. Dazu wurde folgendes Temperaturprogramm für die PCR verwendet: 94°C 1 min, 56°C 1 min, 72°C 3 min, 35 Zyklen. Wir konnten so die volle kodierende cDNA (offenes Leseraster) dieses Rezeptors aus einer humanen Gehirn-cDNA- Bank amplifizieren und klonieren. Hiermit ist die Expression der mRNA dieses Rezeptors in humanem Gehirn eindeutig bewiesen. PCR mit genomischer DNA und diesen Primern ergab eine Bande von identischer Größe und durch Sequenzierung wurde eindeutig bewiesen, daß das Gen intronlos ist. Weiterhin konnte durch Homologiesuche in Datenbanken von exprimierten Sequenzstücken humaner Gene (EST = expressed sequence tags) fünf exprimierte Sequenzen mit 100%iger Identität zu einem Sequenzstück der kodierenden Region des hEDG-8 Gens bzw. mRNA gefunden, welche aus humanen Multiple-Sklerose- Läsionen (3 ×), humaner Niere (1 ×) und humanem Adenokarzinom (1 ×) stammen. Das mehrfache Auffinden von ESTs des hEDG-8 Rezeptors aus Multiple-Sklerose-Läsionen zeigt, dass dieser Rezeptor in den Multiple-Sklerose-Läsionen stark exprimiert wird. Da EDG- Rezeptoren in Oligodendrozyten als Angriffspunkt neu zu entwickelnder Pharmaka gegen demyelinisierende Erkrankungen angesehen werden, ist der EDG-8 ein Rezeptor an welchem solche Pharmaka entwickelt werden können und an welchem dann auch diese Pharmaka angreifen.
3. Die von der cDNA Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Rezeptors ist 398
Aminosäuren lang. Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz ergibt eine putative
Sekundärstruktur des Proteins als integrales Membransprotein mit 7 transmembranalen
Domänen. Das Protein enthält eine potentielle N-Glykosylierungstelle im N-terminalen
Bereich (Aminosäure Positionen 20). Weiterhin sind in der Aminosäuresequenz sechs
potentielle Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen (Aminosäure Positionen 22, 100, 146,
237, 309 und 363) enthalten, deren fakultative Phosphorylierung (sofern sie intrazellulär
lokalisiert sind) an der Modulation der Rezeptorfunktion beteiligt sein können. In Position 79,
309, 340 und 361 der Aminosäuresequenz befinden sich potentielle Caseinkinase II
Phosphorylierungsstellen. Von Aminosäureposition 121 bis 137 findet sich ein typisches
Aminosäure-Motiv der Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren.
4. Einordnung und potentielle Funktionen des zu patentierenden Rezeptors und seines
Gens (bzw cDNA; mRNA):
Der Rezeptor gehört zur großen Genfamile der G-Protein ekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Innerhalb dieser Großfamile zählt er zur Sub-Famile der "Klasse A Rhodopsin-ähnlichen" Rezeptoren. Er besitzt sehr hohe Homologie zur Familie der EDG-Rezeptoren insbesondere zum EDG-8 der Ratte, und stellt somit den humanen EDG-8-Rezeptor dar, welcher bisher unbekannt war.
Der Rezeptor gehört zur großen Genfamile der G-Protein ekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Innerhalb dieser Großfamile zählt er zur Sub-Famile der "Klasse A Rhodopsin-ähnlichen" Rezeptoren. Er besitzt sehr hohe Homologie zur Familie der EDG-Rezeptoren insbesondere zum EDG-8 der Ratte, und stellt somit den humanen EDG-8-Rezeptor dar, welcher bisher unbekannt war.
EDG-Rezeptoren werden in unterschiedlichen neuronalen und peripheren Geweben exprimiert,
und den einzelnen Rezeptoren kommen verschiedene Funktionen in diesen Geweben durch
Kopplung an unterschiedliche second messenger Wege zu. EDG-Rezeptoren sind am
Zellwachstum, der Zell-Differenzierung und -Aufrechterhaltung wesentlich beteiligt. Die
Rezeptoren sind an wichtigen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt
und spielen eine Rolle bei der Zell-Proliferation, Zell-Entwicklung, Zell-Differenzierung,
Zell-Migration, Zell-Apoptose und Zell-Plastizität. Der hier von uns beschriebene humane
hEDG-8 Rezeptor wird stark in Multiple-Sklerose-Läsionen exprimiert (und in der Niere und
in Adenokarcinomen) und spielt mit höchster Wahrscheinlichkeit eine wichtige Rolle bei der
Pathogenese bzw neuen Therapiemöglichkeiten der Multiplen Sklerose und andrer
demyelinisierender Erkrankungen.
Der von uns klonierte Rezeptor kann rekombinant exprimiert und funktionell untersucht
werden. An transfizierten Zellen, welche diesen Rezeptor exprimieren bzw an
Plasmamembranen solcher Zellen, können Pharmaka getestet werden, welche Agonisten oder
Antagonisten an diesem Rezeptor sind. Solche Studien können als "high throughput
screening" für eine Vielzahl an Chemikalien, Naturstoffen und Pharmaka durchgeführt
werden (z. B. Agonisten-induzierte [355]GTP-gamma S Bindung oder second messenger
assays oder Bindungsstudien mit Radioliganden)und zur Entwicklung neuer, spezifischer
Pharmaka, welche an diesem Rezeptor angreifen genutzt werden.
Die von uns beschriebene Gensequenz kann ferner genutzt werden zur Identifizierung von
Mutationen oder Polymorphismen welche die Funktion des Rezeptors oder die Expression des
Gens beeinflussen bei Gesunden und bei erkrankten Patienten. Solche Informationen können
dann zur Diagnose von Krankheiten und eventuell auch zu einer Gentherapie eingesetzt
werden. Die funktionelle Charakterisierung des von uns beschriebenen 5' Bereichs des Gens
(Promotor) kann genutzt werden, um neue Substanzen zu finden welche die Expression dieses
Gens in positiver oder negativer Weise beeinflussen.
Claims (17)
1. Dieses Patent soll sich erstrecken auf folgende Daten, Techniken und Anwendungen und
Entwicklungen:
Das dargestellte Gen inclusive des 5' und 3' nichttranslatierten Bereichs.
Das dargestellte Gen inclusive des 5' und 3' nichttranslatierten Bereichs.
2. Transkriptionsfaktoren, RNA Polymerasen und Pharmaka sowie Chemikalien die die
Expresssion des Gens in positiver oder negativer Weise beeinflussen.
3. Die von dem Gen transkribierte messenger RNA inclusive davon abgeleitete
Spleißvarianten und Isoformen.
4. Die von der mRNA oder von dem intronlosen Gen abgeleitete cDNA.
5. Das von der mRNA (oder dem Gen oder der cDNA) abgeleitete oder hergestellte Protein.
6. Antikörper oder Antiseren, welche gegen einzelne oder mehrere Epitope des Proteins oder
gegen das ganze Protein hergestellt werden.
7. Monoklonale Antikörper oder Antiseren, die gegen einzelne oder mehrere Epitope des
Proteins oder gegen das ganze Protein hergestellt werden.
8. Expressionssysteme (eukaryotische Zellinien, Hefezellen, Xenopus Oocyten,
Baculovirussysteme, Insektenzellsysteme, bakterielle Expressionssysteme), welche das
genannte Protein exprimieren (nativ oder recombinant).
9. Ligand Bindungsstudien und Screening-Assays an nativen oder recombinanten Rezeptoren
oder Zellen oder Zellmembranen, welche diesen Rezeptor enthalten.
10. Transgene Tiere und knock-out Tiere, welche diesen Rezeptor oder die entsprechende
Speziesvariante in veränderter Dichte oder gar nicht exprimieren.
11. Methoden der Gentherapie, welche sich auf diesen Rezeptor bzw sein Gen oder seine
mRNA (cDNA) erstrecken und deren Entwicklung und Anwendung.
12. Sense- und Antisense-Oligonukleotide, welche von diesem Gen abgeleitet wurden sowie
deren Anwendung.
13. Die Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die mit diesem Rezeptor in direkter oder
indirekter Weise in Verbindung stehen.
14. Methoden zur Diagnose von Erkrankungen, die mit diesem Rezeptor (oder dessen Gen,
mRNA) in direkter oder indirekter Weise in Verbindung stehen wie z. B.
Hybridisierungstechniken, Sequenzierung, SSCP, RFLP, Northern Blot, Southern Blot,
Western Blot, Expressions-Arrays, Antikörper, Mutationsanalysen.
15. Die Benutzung der Informationen zur Entwicklung neuer Pharmaka, Verbindungen und
Chemikalien und die Evaluierung vorhandener Pharmaka, Verbindungen und Chemikalien
sowie zur Entwicklung neuer Technologien oder Evaluierung vorhandener Technologien.
16. Das Patent soll sich auch erstrecken auf die Punkte 1. bis 15. für modifizierte Proteine und
Gen-, cDNA- und mRNA-Sequenzen (Aminosäureaustausche, Basenaustausche).
17. Diagnostische, therapeutische und gentherapeutische Verfahren und Pharmaka zur
Therapie und Diagnose der multiplen Sklerose und anderer demyelinisierenden Erkrankungen
welche mit diesem Gen bzw dem von diesem Gen kodierten Rezeptor in Zusammenhang
stehen.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2000128901 DE10028901A1 (de) | 2000-06-10 | 2000-06-10 | Arminosäuresequenz |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2000128901 DE10028901A1 (de) | 2000-06-10 | 2000-06-10 | Arminosäuresequenz |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10028901A1 true DE10028901A1 (de) | 2001-12-20 |
Family
ID=7645443
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2000128901 Withdrawn DE10028901A1 (de) | 2000-06-10 | 2000-06-10 | Arminosäuresequenz |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE10028901A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8791100B2 (en) | 2010-02-02 | 2014-07-29 | Novartis Ag | Aryl benzylamine compounds |
-
2000
- 2000-06-10 DE DE2000128901 patent/DE10028901A1/de not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8791100B2 (en) | 2010-02-02 | 2014-07-29 | Novartis Ag | Aryl benzylamine compounds |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |