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Technisches
Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Biomaterialien, und, spezieller,
betrifft sie Biomaterialien unter Verwendung einer Copolymer-Zusammensetzung mit
einer hervorragenden biologischen Abbaubarkeit als Grundlage und
mit Aufweisen hervorragender Depot- und Abbaueigenschaften, wie
Polypeptide oder dergleichen, die eine biologische Aktivität aufweisen
und kontinuierlich während
einer vorgeschriebenen Lebensspanne in vivo freigesetzt werden können.
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Stand der
Technik
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Polypeptide,
welche Hormone sind, die in einer geringen Menge im lebenden Körper vorhanden sind
und deren Wirken darin sind bereits bekannt. Nachdem solche Polypeptide
nun als Ergebnis der Fortentwicklung der Bruttechnik in den letzten
Jahren in großen
Mengen hergestellt werden können,
anstatt durch Isolierung kleiner Mengen durch Extraktion oder dergleichen
aus dem lebenden Körper,
nehmen sie nun eine wichtige Stellung auf verschiedenen Gebieten
der Anwendung am lebenden Körper ein.
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Die
Stabilität
der Polypeptide in vivo ist jedoch gering und deswegen muß ihre Dosis
und Häufigkeit
der Verabreichung groß sein,
um Wirkung zu erreichen, weswegen Nebenwirkung und physische und
seelische Belastungen bei den Patienten groß werden. Vor solch einem Hintergrund
hat ein Bedarf an zweckmäßigen Materialien
bestanden, die den Wirkstoff in einer ausreichenden Menge während einer
vorgegebenen Zeitspanne freisetzen, weswegen viele Forschungen ausgeführt worden
sind.
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Zum
Beispiel sind aliphatische Polyester aus einer Hydroxycarbonsäure wie
Polymilchsäure,
ein Copolymer aus Milchsäure
mit Glykolsäure,
Polyhydroxybuttersäure
und Poly (ε-Caprolacton),
die eine biologische Aktivität
in vivo als Grundlagenstruktur aufweisen und auch Polymere wie ein
Copolymer aus einer Kombination der oberen mit p-Dioxanon oder Trimethylencarbonat
bekannt.
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Jedoch,
die Affinität
dieser hydrophoben Polymere zu einem Polypeptid, das eine ziemlich
große Hydrophilität hat, ist
klein und es besteht das Problem, dass die anfängliche Elution der Polypeptide von
der Oberfläche
der Polymermatrix groß ist.
Zusätzlich
ist da das Bestimmungsgrad-Verhältnis
zwischen der Elution des Polypeptids und der Wasseraufnahme in das
Polymer; das Polymer wird unabhängig
von der Polymermatrix eluiert, wodurch kein proportionales Verhältnis zwischen
der geforderten Freisetzungsdauer und der Abbauzeit in vivo besteht und
solch ein Polymer ist als Depot-Biomaterial nicht geeignet. Sogar
im Fall eines Polymers mit niedrigem Molekulargewicht wie einem
Oligomer dauert sein Verschwinden durch Abbau mehr als einen Monat und
das bewirkt eine Beeinträchtigung
umgebender Gewebe. Auf diese Weise erzeugt deren Anwendung noch
ein Problem.
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Außerdem ist
in dem aliphatischen Polyester die Endgruppe eine Carboxylgruppe
und deshalb wird im Fall eines basischen Polypeptids die Endgruppe
mit dem Polypeptid über
eine Ionenbindung zusammenwirken usw., wodurch noch ein weiteres Problem besteht,
dass das Polypeptid nicht innerhalb einer erwarteten Zeitspanne
freigesetzt wird.
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Anstelle
von solch einem hydrophoben Polymer ist die Verwendung von Collagen,
Gelatine, Albumin, Fibrin, Hyaluronsäure, Alginsäure usw., die eine Hydrophilität aufweisen,
ebenfalls erforscht worden. Jedoch, weil diese Materialien natürliche sind,
sind ihre Zusammensetzung, Molekulargewicht, Wasserspeichervermögen usw.
nicht konstant. Da ist noch ein Problem im Hinblick auf die Immunologie,
dass während
des Reinigungsverfahrens die Substanzen, die Antigenität besitzen,
nicht vollständig
entfernt werden können.
Noch ein anderes Problem ist, dass die Freisetzungszeit des Polypeptids
aus der Polymermatrix kurz ist.
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Demgemäß haben
zur Lösung
der oben angegebenen Probleme Copolymere, die sowohl hydrophobe,
als auch hydrophile Eigenschaften aufweisen, ein Milchsäure/Glykolsäurecopolymer
oder Polymilchsäure
mit Polyethylenglykol, Polypropylenglykol und Pluronic als die Materialien,
die keine Verunreinigungen im Grundstoff aufweisen, keine Nebenwirkungen
haben und geringe Beeinflussung auf die umgebenden Zellen haben,
nun öffentliche
Aufmerksamkeit erreicht und es wurden verschiedene Forschungen darüber ausgeführt.
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Als
Beispiel für
solch eine Technik offenbart die Japanische Offenlegungsschrift
Sho-58/191714 ein Verfahren, bei dem ein Pfropf-Blockpolymer, dessen
Zahlenmittel des Molekulargewichts 5.000 ist und welches in der
Lage ist, ein Hydrogel durch Absorption von Wasser als Verhalten
in Wasser oder in vivo zu bilden, als pharmazeutische oder veterinärmedizinische
Zusammensetzung verwendet wird. In diesem Stand der Technik ist
erwähnt,
dass ein Polymer, welches durch Polymerisation von Polyethylenglykol
mit einem Molekulargewicht von 6.000 oder 20.000 und D,L-Laktid
oder Glykolid erhalten wird, durch Absorption von Wasser innerhalb
von 4 bis 24 Stunden zum Gel wird. Jedoch, weil dieses Polymer so
ein großes
hydrophiles Segment hat, schwillt das Polymer an und seine Gestalt
wird bröckelig
und deswegen ist die Regelung zwischen der Wirkstofffreisetzung
und dem Abbau des Polymers schwierig.
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Als
Stand der Technik haben die in der vorliegenden Sache angegebenen
Erfinder in der Japanischen Offenlegungsschrift Hei-02/203861 ein
Biomaterial offenbart, in welchem ein Reaktionsprodukt aus Polymilchsäure oder
ein Milchsäure/Glykolsäure-Copolymer
mit Polyethylenglykol Träger
für ein
knochenmorphogenetisches Protein ist. Jedoch, obwohl dieses Material
ein Polymer ist, welches sowohl hydrophile als auch hydrophobe Eigenschaften
aufweist, wenn es in Wasser bei niedriger Temperatur dispergiert
wird, wird es, wenn es erhitzt wird, davon abgetrennt und da ist
noch das Problem, dass das besagte Material schwierig in der Handhabung
ist, weil es in einer pastösen
oder wachsartigen Form vorliegt. In einer anderen Japanischen Offenlegungsschrift
Hei-03/45265 haben die gegenwärtigen
Erfinder die Hafteigenschaft der Materialien verbessert durch Verschneiden
von (1) einem Milchsäure/Glykolsäure-Copolymer
und (2) einem Reaktionsprodukt eines Milchsäure/Glykolsäure-Copolymers mit Polyethylenglykol.
Jedoch kommen die Eigenschaften, die den beiden Polymeren anhaften,
beim Verhältnis
der Wirkstofffreisetzung und dem Abbau des Polymers stark durch,
weswegen ein befriedigendes Ergebnis noch nicht erreicht werden
konnte.
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Weiterhin
haben Ronnenberger, B. et al. die Verwendung eines Triblock-Copolymers
aus einem Milchsäure/Glykolsäure-Copolymer
mit Polyethylenglykol, das ein Molekulargewicht von 1.000 – 10.000 hat,
als Biomaterial offenbart (J. biomed. Mater. Res., 30, 31, (1996)).
Dieses Polymer ist mittels Methylenchlorid zu einem Film gemacht
worden, seine Handhabung ist gut und die Streuung seines Molekulargewichts,
welche durch Teilen des Gewichtsmittels des Molekulargewichts durch
das Zahlenmittel des Molekulargewichts erhalten wird, ist 1,80 – 2,86.
Jedoch erscheint in einem Polymer, in dem die Streuung des Molekulargewichts
breiter ist als größer 1,8
der Einfluß durch
aliphati sche Polyester stärker
und deswegen ist das Polymer wegen der geringen Ausgeglichenheit
zwischen der Wirkstofffreisetzung und dem Abbau des Polymers nicht
geeignet als Depot-Biomaterial.
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In
der
EP 0 885 617 A2 wird
ein Implantatmaterial mit einer Träger-Wirkstoff-Kombination beschrieben, wobei
als Trägerkomponente
oligomere Ester (mit einem sehr niedrigen Molekulargewicht) aus
mehrwertigen Alkoholen und α-Hydroxysäuren verwendet
werden.
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Die
US-4,942,035 beschreibt
Zusammensetzungen, die pharmakologisch aktive Polypeptide und pharmakologisch
verträgliche
Blockcopolymere (unvernetzte Blockcopolymere, vernetzte oder Propfcopolymere),
mit einem mittleren Molekulargewicht von 5.000 enthalten. Auch die
darin beschriebenen Copolymere sind in der Lage, durch Absorption
von Wasser ein Hydrogel zu bilden.
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Wie
oben erwähnt,
sind bisher viele Studien bezüglich
der Methode durchgeführt
worden, wo der Wirkstoff wie ein Polypeptid in einem Biomaterial
enthalten ist und viele darauf basierenden Vorschläge sind
erhalten worden, und gegenwärtig
ist irgendein befriedigendes Biomaterial in Bezug auf die Wirkstofffreisetzung
und auch in Bezug auf Abbaubarkeit, Sicherheit und praktischen Wert
des Materials noch nicht gefunden worden.
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Um
die oben erwähnten
Probleme zu lösen, haben
die gegenwärtigen
Erfinder eine intensive Forschung zum Entwickeln von Biomaterialien
durchgeführt,
welche biologisch abbaubar sind, sowohl hydrophobe, als auch hydrophile
Eigenschaften besitzen, teilweise ausgezeichnete Eigenschaften bezüglich der
Depotwirkung von Polypeptiden aufweisen, biologische Aktivität besitzen,
keine xenobiotische Reaktion in vivo zeigen und keine Beeinträchtigung der
umgebenden Gewebe bewirken.
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Zur
Lösung
dieser Aufgabe schlägt
die Erfindung ein polymeres Wirkstoffdepot-Biomaterial mit den Merkmalen
des Anspruchs 1 vor. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Biomaterials
finden sich in den Ansprüchen
2 bis 4.
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Die
gegenwärtigen
Erfinder haben herausgefunden, dass ein Copolymer, das durch die
Reaktion von Milchsäure
und/oder Glykolsäure
und p-Dioxanon mit Polyethylenglykol als Hauptbestandteile erhalten
wird, als ausgezeichnetes Biomaterial zur Lösung des oben erwähnten Problems
benutzt werden kann, wenn es als Träger für Polypeptide verwendet wird.
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Ein
erfindungsgemäßes polymeres
Wirkstoffdepot-Biomaterial zur Verabreichung von Polypeptid-Wirkstoff
besteht aus einem Copolymer, das durch die Reaktion von Milchsäure und/oder
Glykolsäure
und p-Dioxanon mit
Polyethylenglykol als Hauptbestandteile hergestellt ist. Dabei ist
der Polypeptid-Wirkstoff in dem Copolymer enthalten und das Verhältnis von
Milchsäure
und/oder Glykolsäure
(A) zu p-Dioxanon (B) und Polyethylenglykol (C) liegt in Bezug auf
ihr Molverhältnis
(A:B:C) innerhalb eines Bereiches von 26–60:4–25:25–70. Das eingesetzte Polyethylenglykol
besitzt ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von 600 bis 20.000.
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Ein
solches Copolymer kann leicht durch die Reaktion von D,L-Laktid
und p-Dioxanon mit Polyethylenglykol, das eine oder mehrere Hydroxylgruppe(n)
besitzt, in Gegenwart eines Katalysators hergestellt werden. Da
resultierende Copolymer ist ein Blockpolymer, das aus Milch säure-, Dioxanon-
und Ethylenoxid-Einheiten besteht.
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Wenn
das Molekulargewicht des eingesetzten Polyethylenglykols weniger
als 600 beträgt,
hat das resultierende Copolymer eine Fließfähigkeit, wenn es in einem Bereich
hergestellt wird, wo der Gehalt an Ethylenoxideinheiten hoch ist,
während, wenn
es in einem Bereich hergestellt wird, wo der besagte Gehalt an Ethylenoxideinheiten
niedrig ist, werden Biomaterialien, welche eine gewünschte Freisetzungsrate
haben, nicht erhalten. Andererseits, wenn das Molekulargewicht mehr
als 20.000 beträgt,
wird eine schlimme Beeinträchtigung
des lebenden Körpers
bewirkt und das wird nicht bevorzugt.
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Beispiele
des während
der Reaktion verwendeten Katalysators sind Zinn-2-ethylhexanoat,
Dibutylzinndilaurat, Zinn(II)-chlorid, Zinn(IV)-chlorid, Diethylzink,
basisches Zinkcarbonat, Titantetrapropoxid, Tributylzinnmethoxid,
Dibutylzinnoxid und Aluminiumisopropoxid.
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Eine
andere Art der Copolymerisationsreaktion ist, dass, nachdem ein
Laktid zuerst mit p-Dioxanon durch eine Ringöffnungs polymerisation copolymerisiert
wird, oder, nachdem ein Copolymer durch eine direkte wasserabspaltende
Polykondensation von Milchsäure
mit p-Dioxanon hergestellt wird, Polyethylenglykol und ein Katalysator
zur Veresterung hinzu gegeben werden, damit die Reaktion durchgeführt werden
kann. In diesem Fall können
Phosphorsäure,
Benzolsulfonsäure,
ein Ionenaustauscherharz vom Säuretyp
usw. als Katalysator für
die Veresterung verwendet werden. Im Fall einer Ringöffnungspolymerisation
ist, obwohl die Materialien im geschmolzenen Zustand polymerisiert
werden können, es
ebenfalls möglich,
die Polymerisation in einem Lösungsmittel
durchzuführen,
welches zum Auflösen des
Monomers oder des Polymers fähig
ist. Die dafür verwendete
Milchsäure
kann eine D-, L- und DL-Substanz oder ein Gemisch daraus sein.
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Es
ist erforderlich, dass die Gesamtmenge an Milchsäure und/oder Glykolsäure, p-Dioxanon und
Polyethylenglykol 80 Gewichtsprozent oder mehr beträgt, und,
wenn das innerhalb eines solchen Bereiches ist, andere Komponenten/Materialien
zu dem Copolymer dazugegeben werden können. Zum Beispiel kann bei
der Herstellung des Copolymers die Reaktion durch Zugeben anderer
Hydroxycarbonsäure
wie Trimethylencarbonat, polyfunktionellem Polyol wie Ethylenglykol,
Glykol, Glycerin, Saccharose und Polypropylenglycol usw. zu den
Materialien durchgeführt
werden, obwohl ihre Menge weniger als 20 Gewichtsprozent der Gesamtmenge
des Copolymers beträgt.
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Wenn
das Molverhältnis
von Polyethylenglykol (C) zu Milchsäure und/oder Glykolsäure (A)
und p-Dioxanon; (B) weniger als 25 beträgt, ist die Abbaurate des resultierenden
Copolymers außerordentlich niedrig,
sogar wenn das Verhältnis
von Milchsäure und/oder
Glykolsäure
(A) zu p-Dioxanon (B) zu einer Erweiterung geändert wird. Andererseits zeigt,
wenn das besagte Molverhältnis
mehr als 70 beträgt,
das resultiernde Copolymer eine starke Wasserlöslichkeit und ist nicht als
Gegenstand für
das Biomaterial geeignet. Zusätzlich
liegt das Molverhältnis
von Milchsäure
und/oder Glykolsäure
(A) zu p-Dioxanon (B) innerhalb eines Bereiches von 2660:4-25 und,
wenn das Verhältnis
außerhalb
dieses Bereiches liegt, wird die Abbaurate des Biomaterials niedrig
und weiterhin wird sprödes
Hydrogel gebildet, wodurch das Produkt nicht als Biomaterial geeignet
ist.
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Das
Copolymer, welches durch Copolymerisation gewonnen wird, wird einer
Behandlung zur Reindarstellung unterworfen und bei einer derartigen Reinigungsbehandlung
kann ein Verfahren, bei dem das Copolymer in Aceton, Chloroform
usw. aufgelöst und
dann ein 6- bis 10-faches Volumen an Ether, Petrolether usw. zu
der Menge des Copolymers zugefügt
wird, wobei das Copolymer ausfällt,
ein Verfahren, bei dem das Copolymer in einer 10-fachen Menge Wasser
bei etwa 5°C
dispergiert wird und die Dispersion erhitzt wird, wobei sich das
Copolymer abtrennt, usw. angewandt werden. Als Ergebnis einer solchen
Reinigungsbehandlung können
Polymere und Homopolymere mit niedrigem Molekulargewicht, welche
Verunreinigungen darstellen, aus dem Copolymer entfernt werden und
zusätzlich
kann nicht umgesetztes Polyethylenglykol entfernt werden, weil das
Polyethylenglykol im oben erwähnten
Lösungsmittel
oder in einer für
die Reindarstellung verwendeten wässrigen Schicht löslich ist.
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Das
Zahlenmittel des Molekulargewichts des derart gewonnenen Copolymers
liegt innerhalb eines Bereiches von 2.300 bis 47.000 und die Molekulargewichtsstreuung,
die durch Dividieren des Gewichtsmittels des Molekulargewichts durch
das Zahlenmittel des Molekulargewichts erhalten wird, liegt innerhalb
eines Bereiches von 1,04 bis 1,50. Das Copolymer hat sowohl hydrophobe,
als auch hydrophile Eigenschaften wie Biomaterial und, insbesondere wenn
eine biologisch aktive Substanz wie ein Polypeptid darin aufgenommen
wird, kann eine stabile Freisetzung in vivo behauptet werden.
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Das
Polypeptid, welches eine biologisch aktive Substanz ist, kann als
solches in einem der Fälle verwendet
werden, wo es in Wasser löslich
ist, aber schwer löslich
darin ist. Beispiele für
die Arten von Polypeptiden sind Nervenwachstumsfaktor, Epidermwuchsfaktor,
Fibroblastwachstumsfaktor (FGF), Thrombozytenwachstumsfaktor, Koloniestimulierungsfaktor,
Erytropoietin, Interleukin-1, -2 und -3, Interferon -α, -β und -γ, Knorpelfaktor,
Knorpelwachstumsfaktor, Knochenwachstumsfaktor, knochenmorphogenetisches
Protein, Beckenwachstumsfaktor, Umwandlungs-Wachstumsfaktor, Insulin
und Prostaglandin. Andere Beispiele sind luteinisierendes Hormon,
Releasinghormonantagonist, Somatostatin und Derivate davon, Wachstumshormon,
Prolaktin, adrenokortikotropes Hormon, Melanotropin, Thyreotropin-releasing-Hormon
und Salze und Derivate davon, Thyreotropin-stimulisierendes Hormon,
luteinisierendes Hormon, follikelstimulisierendes Hormon, Vasopressin
und Derivate davon, Oxytocin, Calcitonin, Parathormon, Glukagon,
Gastrin, Sekretin, Cholecystokinin, Angiotensin, Human-Laktohormon,
Human-Chorionic-Gonadotropin, Enkephalin und Derivate davon, Endorphin,
Kyotorphin, Tuftsin, Thymopoietin II, Thymosin, Thymostimulin, thymic
humoral factor, Serumthymusfaktor und Derivate davon, ebenso wie
andere Thymusfaktoren, Tumornekrosefaktor, Koloniestimulierungsfaktor,
Motilin, Neurotensin, Caerulein, Urokinase, Asparaginase, Kallikrein, Substanz
P, Blutgerinnungsfaktoren VIII und IX, Lysozymchlorid, Polymyxin
B, Colistin, Gramicidin und Bacitracin. Es ist weiter möglich, dass
das Copolymer zusammen mit antiinflammatorischen Mitteln, Antibiotika,
Antitumormitteln, immunsuppressiven Mitteln usw. verwendet wird
und getränkt
oder gemischt wird mit porösem
Hydroxyapatit, Bio-Glas, Ceravital, Tricalciumphosphat, Tetracalciumphosphat,
Calciumaluminat usw., wodurch ein Komplexeffekt erreicht wird.
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Unter
den hierin oben aufgelisteten Polypeptiden ist das Polypeptid, welches
am meisten für
die Biomaterialien, welche die vorliegende Erfindung betreffen,
geeignet ist, knochenmorphogenetisches Protein. Dieses knochenmorphogenetische Protein wird üblicherweise
BMP genannt und ist eine Substanz, welche außerzellulär auf unreife Mesenchymtyp-Zellen
einwirkt und den Genotyp in Chondrozyten und Osteoblaste aufteilt,
wobei Knorpel und Knochen induziert werden. Gegenwärtig sind
BMP 1 bis 13 bestimmt worden. Das BMP, welches in der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, kann eine der Substanzen sein, die mittels
einem genetischen Rekombinationsverfahren und mittels Isolierung
und Reindarstellung aus Dunn's
Osteosarkom hergestellt werden (Takaoka, K., Biomedical Research,
2 (5), 466–471
(1981)), aber es gibt keine besondere Begrenzung für das Verfahren
zur Herstellung desselben.
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Verfahren
zur Herstellung der Biomaterialien gemäß der vorliegenden Erfindung
können
mit herkömmlichen
Mitteln zum Einbringen der Droge zum Einschluß in ein Copolymer durchgeführt werden. Zum
Beispiel wird ein Copolymer zuerst in einem Lösungsmittel, welches leicht
verdampfend ist, aufgelöst
oder dispergiert, dann das Polypeptid gleichmäßig darin dispergiert und das
gebrauchte Lösungsmittel
daraus entfernt. In Betracht als dafür gebrauchbare Lösungsmittel
kommen Aceton, Methylenchlorid, Chloroform, Ethanol usw., die bevorzugt
werden, und, abhängig
von der Art des Gebrauchs des Biomaterials, kann eines von diesen
Lösungsmitteln
allein oder zwei oder mehrere von ihnen gemeinsam verwendet werden.
Ein anderes Verfahren ist, dass ein Copolymer zu einer wässrigen
Lösung
eines Polypeptids zugegeben wird, und nachdem das Polypeptid als
Ergebnis vom Anschwellen des Copolymers adsorbiert ist, wird es
gefriergetrocknet. Noch ein anderes Verfahren ist, dass eine Emulsion
eines Copolymers vermischt mit einem Polypeptid und Wasser hergestellt
wird und das Lösungsmittel
aus der Emulsion entfernt wird, um Mikrokapseln herzustellen. Es
ist auch möglich,
es mittels Vermischen eines Polypeptids mit einem Copolymer, welches
verflüssigt
ist, durch Erwärmen
herzustellen. Es ist weiter möglich,
ein Copolymer mit einem niedrigen Molekulargewicht, das aus einer
Flüssigkeit
resultiert, zu verwenden, dann ein Polypeptid damit zu mischen und
ein Produkt zur Aufrechterhaltung der flüssigen Eigenschaft zu verwenden.
Zusätz lich
kann ein in der vorliegenden Erfindung verwendetes Copolymer durch
den Gebrauch eines Autoklaven, γ-Bestrahlung,
Ethylenoxidgas usw., falls und wenn nötig, sterilisiert werden.
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Die
vorliegende Erfindung soll jetzt weiter durch die folgenden Beispiele
veranschaulicht werden, obwohl die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
Wenn es vorkommmt, steht % in allen Fällen für Gewichtsprozent, es sei denn,
es wäre
anderweitig angegeben.
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Beispiel 1
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In
ein 50-ml Reaktionsgefäß wurden
20g DL-Laktid, 9,3g p-Dioxanon und 10,4g Polyethylenglykol mit einem
Zahlenmittel des Molekulargewichts von 4.000 (ein von Kishida Kagaku
KK hergestelltes Reagenz) gegeben, dann 52μl einer 8%-igen Lösung von
Zinnoctanoat in Diethylether dazu hinzugegeben und das Gemisch wurde
bei –48°C gefroren.
Nach dem Einfrieren wurde es im Vakuum bei 1mmHg für eine Stunde
vakuumiert, versiegelt, bei 145°C
für 7 Stunden
reagieren gelassen und weiter bei 160°C für 9 Stunden reagieren gelassen.
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Das
Reaktionsprodukt wurde in 100ml Aceton unter Erwärmen gelöst und 550ml Diethylether Zugegeben,
um einen durchscheinenden Niederschlag zu ergeben. Dieser wurde
bei –45°C für 30 Minuten
gekühlt
und das abgeschiedene Polymer im Vakuum bei 70°C getrocknet.
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Nach
der Trocknung im Vakuum wurden 35g eines Copolymers erhalten. Das
Copolymer wurde einer Messung des Molekulargewichts mittels einer Gelpermeation-Chromatographie
(GPC) unterzogen, wobei des Zahlenmittel des Molekulargewichts 9.900 war,
das Gewichtsmittel des Molekulargewichts war 11.900 und die Molekulargewichtsstreuung
war 1,2. Als das Molverhältnis von
Milchsäure,
Dioxanon und Polyethylenglykol mittels 1H-NMR
bestimmt wurde, wurde herausgefunden, dass es 43:13:44 war. Die Glasübergangstemperatur,
die mittels einem Differentialscanning-Kalorimeter (DSC) gemessen
wurde, war –7,9°C.
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Das
resultierende Copolymer (50mg) wurde in 500μl unter Kühlen aufgelöst und mit 10μg rhBMP-2,
das durch eine genetische Rekombination erhalten wurde, gemischt
und die Mischung wurde im Vakuum bei 25°C für 8 Stunden getrocknet, um
Biomaterialien gemäß der vorliegenden
Erfindung in Gestalt von Pellets zu erzeugen. Dann wurden die Biomaterialien
unter die Faszien des Dorsalmuskels in Mäusen (5 Wochen alt) implantiert.
Nach drei Wochen wurden die Implantate herausgeschnitten, ihre Soft-Röntgenaufnahme und ihr histologischer
Eindruck wurden betrachtet und ihr Calciumgehalt wurde bestimmt,
um den Status von Knochengewebe zu überprüfen, woraufhin fibröse Bälkchen festgestellt wurden
und eine Knochenbildung bestätigt
wurde.
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Vergleichsbeispiel 1
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Anstelle
von p-Dioxanon, welches ein Material zur Herstellung des in Beispiel
1 verwendeten Copolymers war, wurde DL-Laktid verwendet und eine Reaktion
in Gegenwart von Polyethylenglykol für die Zusammensetzungsrate
durchgeführt,
wo die Menge des Laktids abnahm. Dann wurden Reaktion und Beindarstellung
ebenso in der gleichen Weise durchgeführt und ergaben 37g eines Copolymers.
Als dessen Molekulargewicht durch GPC gemessen wurde, war das Zahlenmittel
des Molekulargewichts 8.700, das Gewichtsmittel des Molekulargewichts
war 10.600 und die Molerkulargewichtsstreuung war 1,2. Als das Molverhältnis von
Milchsäure
zu Polyethylenglykol durch 1H-NMR gemessen
wurde, wurde herausgefunden, dass es 57:43 war. Die mittels DSC
gemessene Glasübergangstemperatur
war 10°C.
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Das
resultierende Copolymer wurde mit 10μg rhBMP-2 in der gleichen Weise
wie bei Beispiel 1 gemischt und unter die Faszien des Dorsalmuskels in
Mäusen
(5 Wochen alt) implantiert. Nach drei Wochen wurden die Implantate
herausgeschnitten, ihre Soft-Röntgenaufnahme
und ihr histologischer Eindruck wurden betrachtet und ihr Calciumgehalt
wurde bestimmt, um den Status von Knochengewebe zu überprüfen, woraufhin
eine Knochenbildung nur um die Implantate herum festgestellt werden
konnte und das Copolymermaterial im Zentrum verblieb. Der gleiche
Test wurde unter Verwendung von BMP alleine ohne die Verwendung
des obigen Materials durchgeführt,
woraufhin überhaupt
keine Knochenbildung festgestellt werden konnte.
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Beispiel 2
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Die
gleiche Reaktion wie in Beispiel 1 wurde unter Verwendung von 29,4g
L-Laktid, 15,9g Glykolid, 17,5g p-Dioxanon und 24,6g Polyethylenglykol mit
einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von 4.000 (ein von Kishida
Kagaku KK hergestelltes Reagenz) durchgeführt und eine Reindarstellung
wurde auf die gleiche Weise durchgeführt und ergab 65,6g eines Copolymers.
Als das Molekulargewicht dieses Copolymers durch GPC gemessen wurde,
war das Zahlenmittel des Molekulargewichts 9.100, das Gewichtsmittel
des Molekulargewichts war 10.000 und die Molekulargewichtsstreuung
war 1,1. Das Molverhältnis
von Milchsäure,
Glykolsäure,
Dioxanon und Ethylenoxideinheiten wurde durch 1H-NMR
gemessen und es wurde herausgefunden, dass es 24:19:8:49 war. Das
Ergebnis der Messung der Glasübergangstemperatur
mittels Messen durch DSC war –10°C.
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Das
Copolymer (150mg) wurde in 2ml Aceton unter Kühlen aufgelöst und mit 60μg rhBMP-2, das
mittels einer genetischen Rekombination erhalten wurde, gemischt
und die Mischung wurde im Vakuum für 24 Stunden bei Raumtemperatur
getrocknet und ergab die Biomaterialien der vorliegenden Erfindung
in Gestalt von Pellets. Die resultierenden Biomaterialien wurden
unter die Faszien des Dorsalmuskels in Mäusen (5 Wochen alt) im plantiert.
Nach drei Wochen wurden die Implantate herausgeschnitten und ihre
Soft-Röntgenaufnahme
und ihr histologischer Eindruck wurden betrachtet und ihr Calciumgehalt
wurde gemessen, um den Status von Knochengewebe zu überprüfen, woraufhin
die gleiche Knochenbildung wie in Beispiel 1 bestätigt wurde.
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Beispiel 3
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Die
gleiche Reaktion wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt unter
Verwendung von 14,4g DL-Laktid, 5,1g p-Dioxanon und 16,5g Polyethylenglykol
mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von 4.000 und ergab
26g eines Copolymers. Als das Molekulargewicht dieses Copolymers
mittels GPC gemessen wurde, betrug das Zahlenmittel des Molekulargewichts
8.000, das Gewichtsmittel des Molekulargewichts war 8.600 und die
Molekulargewichtsstreuung war 1,1. Das Molverhältnis von Milchsaure, Dioxanon und
Ethylenoxideinheiten wurde durch 1H-NMR
gemessen und es wurde herausgefunden, dass es 28:6:66 war. Das Ergebnis
der Messung der Glasübergangstemperatur
mittels Messen durch DSC war –6°C, während der
Schmelzpunkt 34°C
war. Das Copolymer (5omg) wurde mit 25μg rhBMP-2 gemischt, zu Pellets
gemacht und unter die Faszien des Dorsalmuskels in Mäusen auf
die gleiche Weise wie in Beispiel 1 implantiert. Nach drei Wochen
wurde der Status der Knochenbildung geprüft, woraufhin eine gute Knochenbildung
bestätigt
wurde.
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Beispiel 4
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Die
gleiche Reaktion wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt unter
Verwendung von 26g DL-Laktid, 7,4g p-Dioxanon und 7,5g Polyethylenglykol
mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von 1.000 und ergab
32g eines Copolymers. Als das Molekulargewicht dieses Copolymers
mittels GPC gemessen wurde, betrug das Zahlenmittel des Molekulargewichts
3.900, das Gewichtsmittel des Molekulargewichts war 4.300 und die
Molekulargewichtsstreuung war 1,1. Das Molverhältnis von Milchsäure, Dioxanon und
Ethylenoxideinheiten wurde durch 1H-NMR
gemessen und es wurde herausgefunden, dass es 59:11:30 war. Das
Ergebnis der Messung der Glasübergangstemperatur
mittels Messen durch DSC war –9°C. Das Copolymer
(50mg) wurde mit 25μg rhBMP-2
gemischt, zu Pellets gemacht und unter die Faszien des Dorsalmuskels
in Mäusen
auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 implantiert. Nach drei Wochen
wurde der Status der Knochenbildung geprüft, woraufhin eine gute Knochenbildung
bestätigt wurde.
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Beispiel 5
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Die
gleiche Reaktion wie in Beispiel 1 wurde unter Verwendung von 25,7g
L-Laktid, 6,1g p-Dioxanon, 11,3g Polyethylenglykol mit einem Zahlenmittel des
Molekulargewichts von 20.000 und 8,5g Trimethylencarbonat bei 164°C für 15 Stunden
durchgeführt
und eine Reindarstellung wurde durchgeführt und ergab 29g eines Copolymers.
Als das Molekulargewicht dieses Copolymers durch GPC gemessen wurde,
betrug das Zahlenmittel des Molekulargewichts 33.000, das Gewichtsmittel
des Molekulargewichts war 45.000 und die Molekulargewichtsstreuung
war 1,4. Das Molverhältnis
von Milchsäure,
Dioxanon, Ethylenoxid und Trimethylencarbonateinheiten wurde durch 1H-NMR gemessen und es wurde herausgefunden,
dass es 39:5:47:9 war. Das Ergebnis der Messung des Schmelzpunktes,
gemessen durch DSC, war 41°C.
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rhBMP-2
(10μg) wurden
mit 100μl
Wasser gemischt, 50mg des obigen Copolymers wurden dazu hinzugegeben
und damit adsorbiert und eine Gefriertrocknung wurde für 30 Stunden
durchgeführt, um
die Biomaterialien der vorliegenden Erfindung in Form von Pellets
zu ergeben. Die resultierenden Biomaterialien wurden unter die Faszien
des Dorsalmuskels in Mäusen
(5 Wochen alt) implantiert. Nach drei Wochen wurden die Implantate
geprüft
und ihre Soft-Röntgenaufnahme
und ihr histologischer Eindruck wurden betrachtet und ihr Calciumgehalt
wurde gemessen, um den Status der Knochengewebe zu überprüfen, woraufhin
die gleiche Knochenbildung wie in Beispiel 1 bestätigt wurde.
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Beispiel 6
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In
ein 50ml Reaktionsgefäß wurden
28g DL-Laktid, 4,5g p-Dioxanon und 12,7g Polyethylenglykol mit einem
Zahlenmittel des Molekulargewichts von 4.000 gegeben, dann wurden
52μl einer
8%-igen Lösung
von Zinnoctanoat in Diethylether dazu hinzugegeben und die Mischung
wurde bei –48°C gefroren.
Nach dem Einfrieren wurde sie im Vakuum bei 1mm Hg für eine Stunde
evakuiert, versiegelt, bei 140°C
für 8 Stunden
reagieren gelassen und weiter bei 155°C für 11 Stunden reagieren gelassen.
Ein Prozeß,
bei dem das Reaktionsprodukt in einem Liter Wasser bei 90°C feinstverteilt
und ein Niederschlag daraus gesammelt wurde, wurde dreimal wiederholt, um
eine Beindarstellung vorzunehmen. Nach einer Gefriertrocknung des
gereinigten Produkts wurde ein Copolymer in einer Menge von 34g
erhalten. Als das Copolymer einer Messung des Molekulargewichts durch
GPC unterzogen wurde, betrug das Zahlenmittel des Molekulargewichts
9.600, das Gewichtsmittel des Molekulargewichts betrug 10.500 und
die Molekulargewichtsstreuung war 1,1. Als das Molverhältnis von
Milchsäure,
Dioxanon und Ethylenoxideinheiten mittels 1H-NMR
bestimmt wurde, wurde herausgefunden, dass es 45:4:51 war. Die Glasübergangstemperatur,
gemessen durch DSC, war –10,4°C. Das resultierende
Copolymer (10mg) wurde zu 1ml einer 100μg G-Kolonie-Stimulierungsfaktor
enthaltenden wässrigen
Lösung
hinzugegeben, so dass der G-Kolonie-Stimulierungsfaktor damit adsorbiert
wurde und dann wurde eine Gefriertrocknung durchgeführt, um Biomaterialien
der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Die Biomaterialien (2mg)
wurden in die dorsalen subkutanen Taschen von Ratten implantiert
und die Leukozytenzahl der Ratte nach 18 Tagen geprüft, woraufhin
bestätigt
wurde, dass die Leukozytenzahl der Ratte größer war, als im Fall einer
Kontrolle, wo die Biomaterialien der vorliegenden Erfindung nicht
verwendet wurden.
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Vorzug der
Erfindung
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Die
Biomaterialien der vorliegenden Erfindung sind gleichmäßig geschwollen,
wenn Wasser darin eindringt und deshalb wird ein Polypeptid, welches
darin enthalten ist, gelöst
und die Diffusion der Lösung
ist konstant. Weiter, weil der Status des Wassereindringens beibehalten
wird, haben die Biomaterialien eine hohe Affinität zum lebenden Körper und, anders
als ein Hydrogel, welches im wasserhaltigen Zustand bröcklig wird,
erlangen sie Elastizität
und Hafteigenschaften bei der Temperatur des lebenden Körpers und
haben die Eigenschaft, dass ihre Gestalt durch den Druck des Gewebes
des lebenden Körpers
kaum zerkrümelt.
Die besagte Eigenschaft bewirkt den Effekt, dass der Einfluß des in
dem Biomaterial enthaltenen Polypeptids auf eine Freisetzungsrate
klein gemacht wird.
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Zusätzlich,
und anders als andere Materialien, welche sogar nach der Elution
des Polypeptids verbleiben, wird das Copolymer, das die Biomaterialien
der vorliegenden Erfindung bildet, im lebenden Körper hydrolisiert; und das
Molekulargewicht des hydrophoben Abschnitts ist geeignet, um abzunehmen,
wobei das Copolymer die Eigenschaft hat, dass es nach der Elution
vom Polypeptid schnell verschwindet. Demgemäß sind die Biomaterialien der vorliegenden
Erfindung in Bezug auf Anpassungsfähigkeit in der Verwendung innerhalb
eines breiten Gebiets ausgezeichnet.