DD285348A5 - Verfahren zur herstellung von 1s-25-dihydroxy-cholecalciferol - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1S.25-Dihydroxy-cholecalciferol durch Bestrahlung einer auf 30 bis 5C gekuehlten Loesung von 1S.25-Dihydroxy-provitamin D3 in Methanol oder Methyl-tert.butylether mit UV-Licht, Abtrennung des gebildeten 1S.25-Dihydroxy-praevitamin D3, 1S.25-Dihydroxy-lumisterol3 und nicht umgesetztem 1S.25-Dihydroxy-provitamin D3 mittels Flash-Chromatographie an silberimpraegniertem Kieselgel, Rueckfuehrung von 1S.25-Dihydroxy-lumisterol3 und nicht umgesetztem 1S.25-Dihydroxy-provitamin D3 in den Bestrahlungsprozesz sowie Abtrennung des 1S.25-Dihydroxy-cholecalciferols von 1S.25-Dihydroxy-praevitamin D3 aus dem Gemisch der thermischen Isomerisierung mittels Flash-Chromatographie.{1S.25-Dihydroxy-cholecalciferol; 1S.25-Dihydroxy-provitamin D3; 1S.25-Dihydroxy-praevitamin D3; 1S-25-Dihydroxy-lumisterol3; Bestrahlung; thermische Isomerisierung; Flash-Chromatographie; silberimpraegniertes Kieselgel; Methanol; Recycling}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1 S^S-Dihydroxy-cholecalciferol. 1 S^S-Dihydroxy-cholecalciferol ist ein wichtiger Vertreter der Vitamin-D-Metaboliten, die in der Humanmedizin vielfältig verwendet werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Synthese von Vitamin-D-Metaboliten kann generell entweder aus dem über eine Vielzahl von Synthesestufen darstellbaren jeweiligen Provitamin-D-Metaboliten unter Einbeziehung eines photochemischen und nachfolgenden thermischen Isomerisierungsschrittes erfolgen, oder in der Totalsynthese wird von Bausteinen ausgegangen, die direkt zu der in den Vitamin-D-Metaboliten vorhandenen seco-B-Ring-Struktur führt, ohne daß ein lichtinduzierter Schritt benötigt wird [G.Quinckert, Synform 3 (2)41(1985)].

Letzterer Weg über die Totalsynthese hat gegenwärtig keine praktische Bedeutung, so daß für die Herstellung von 1 S.25-Dihydroxy-cholecalciferol im präparativen Maßstab in Analogie zur Darstellung von anderen Vitamin-D-Metaboliten nur der erste oben genannte Synstheseweg relevant ist. Der entsprechende Provitamin-D-Metabolit wird durch Bestrahlung mit UV-Licht in den jeweiligen Prävitamin-D-Metaboliten isomerisiert, und in einem nachfolgenden Schritt wird dieser Prävitamin-D-Metabolitthermisch isomerisiert.

Die thermische Isomerisierung läuft bei Einhaltung der an sich bekannten Reaktionsbedingungen im allgemeinen ohne nennenswerte Bildung von Nebenprodukten ab. Im photochemischen Schritt hingegen werden sowohl weitere, in den gewünschten Prävitamin-D-Metaboliten photochemisch zurückführbare (reversible) Isomeren als auch eine mehr oder weniger große Zahl nicht mehr verwendbarer (irreversibler) Nebenprodukte, sogenannte Überbestrahlungsprodukte, gebildet. Da die thermische Isomerisierung über Recycling praktisch zu einer quantitativen Umwandlung des jeweiligen Prävitamin-D-Metaboliten in den entsprechenden Vitamin-D-Metaboliten gestaltet werden kann, wird die Gesamtausbeute an Vitamin-D-Metaboliten letzthin durch die Effektivität des aus dem jeweiligen Provitamin-D-Metaboliten erzeugbaren Prävitamin-D-Metaboliten bestimmt. Die Produktzusammensetzung und damit der Anteil am jeweiligen Prävitamin-D-Metaboliten im Bestrahlungsgemisch wird vom aktinischen Licht, von der Reaktionsdauer bzw. Umsatzgrad bezogen auf den eingesetzten

Provitamin-D-Metaboliten, von der Reaktionstemperatur, vom Lösungsmittel, und vom Sauerstoffanteil in der Lösung bestimmt. Die für einen relativ hohen Anteil an Prävitamin-D-Metaboliten im Produktgemisch erforderlichen Wellenlängenbereiche im UV sind ebenso wie die Erzeugung dieser am Reaktionsort durch eine geeignete Kombination von Strahlungsquelle und Filterlösung an sich bekannt (JP-PS 52-108-964; DD-WP 213210) bzw. bereits vorgeschlagen worden und sind praktisch für beliebige Derivate des Cholesta-5.7-dien-Grundkörpers gleichermaßen gut geeignet. Bekannt und für beliebige Derivate des Cholesta-5.7· diensystems ist auch, daß Sauerstoff die Bindung irreversibler Nebenprodukte fördert und daher auf an sich bekannte Weise durch Spülen der Reaktionslösung mit Argon oder Stickstoff sorgfältig auszuschließen ist. Die Unterschiede bei der Darstellung der Vielzahl von Vitamin-D-Metaboliten aus dem jeweiligen Provitamin bestehen vor allem in der Durchführung der notwendigen Trennprozesse. So kann das photochemisch erzeugte Prävitamin vor der thermischen Isomerisierung aus dem Produktgemisch der Bestrahlung abgetrennt werden, oder aber das Bestrahlungsgemisch wird direkt der thermischen Isomerisierung zugeführt, und die Abtrennung des jeweiligen Vitamin-D-Metaboliten erfolgt aus diesem Produktgemisch.

Es ist der Stand der Technik, daß die erforderlichen Trennprozesse im allgemeinen mittels chromatographischer Methoden realisiert werden. Bekannt ist, daß die Anwesenheit zusätzlicher Hydroxylgruppen im Α-Ring und/oder in der Seitenkette im Falle der Vitamin-D-Metaboliten zu einem weitgehend ähnlichen Trennverhalten aller im photochemischen und thermischen Schritt gebildeten Reaktionsprodukte führt, was die Auftrennung dieser Gemische erheblich kompliziert [M. P. Kautsky (Ed.), Steroid Analysis by HPLC, in Chromatographie Sciences, Vol. 16,173]. Dies kann bei der Synthese von Vitamin-D-Metaboliten noch dadurch erschwert werden, wenn die Bestrahlung des jeweiligen Provitamin-D-Metaboliten im üblichen Temperaturbereich von 0 bis -5⁹C zu einem besonders hohen Anteil verschiedenartiger irreversibler Nebenprodukte, vorwiegend als lichtinduziert gebildete Folgeprodukte des mit fortschreitender Bestrahlung zunehmend gebildeten jeweiligen Prävitamin-D-Metaboliten führt. Aus diesen Gründen wird zur Realisierung der Trennprozesse im wesentlichen die HPLC eingesetzt. Die vorgeschlagene Verwendung von Sephadex LH-20 als Trägermaterial bedingt nur einen geringen Stoffumsatz, erfordert sehr lange Trennzeiten und ist daher für Synthesen von Vitamin-D-Metaboliten in Grammengen nicht geeignet. Die für die Synthese verschiedener Vitamin-D-Metaboliten vorgeschlagene Kombination von Normaldruck-Flüssigkeitschromatographie, meist unter Anwendung einer Gradientenelution, und HPLC als zusätzliche Methode zur Reinigung des jeweiligen Zielproduktes führt nachteiligerweise zu einem erhöhten Arbeitsaufwand, erlaubt nur einen geringen Stoffdurchsatz oder erhöht in erheblichem Maße die Kosten bei Einsatz der präparativen HPLC.

Um die notwendigen Trennprozesse zu vereinfachen und die genannten Nachteile zu umgehen, werden bei der Synthese von Vitamin-D-Metaboliten die jeweiligen Provitamin-D-Metaboliten meist derivatisiert eingesetzt. Die Einführung und nachfolgende Abtrennung geeigneter Schutzgruppen führt nachteiligerweise zu einem erhöhten Arbeitsaufwand, höheren Kosten und verringert vor allem im erheblichen Maße die Ausbeute am jeweiligen Vitamin-D-Metaboliten, die im allgemeinen nur bei 10 bis 30%, bezogen auf den eingesetzten Provitamin-D-Metaboliten liegt.

" Aus den dargelegten Gründen wird nach dem gegenwärtigen Stand bei der Herstellung von 1 S^S-Dihydroxy-cholecalciferol (1S.25-Dihydroxyvitamin D₃) von einem derivatisierten Edukt, 3.1 S.2S (OCOCHah-Provitamin D₃ ausgegangen und folgende Verfahrensschritte ausgeführt (DE-PS 2607322):

- Darstellung von 3.1 S.25(OCOCH₃)₃-Provitamin Dadurch Acetylierung des freien Triols bzw. einer seiner Vorstufen (Ausbeute: 80 bis 85%);

- partielle Verseifung des Triacetats zu einem Gemisch von 1 S.25(OCOCH₃)₂-Provitamin D₃ und 1 S(OH).25(OCOCHj)-Provitamin D₃ (Ausbeute 82%);

- photochemische Darstellung von 1S.25(OCOCH₃)2-Prävitamin D₃; Isolierung von 1S.25(OCOCH₃)₂-Provitamin D₃ und 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ mittels HPLC aus dem Bestrahlungsgemisch; Rückführung von 1S.25(OCOCH₃)₂-Provitamin D₃ in den Bestrahlungsprozeß (Ausbeute nach dreimaligem Recycling: 25%);

- Verseifung von 1 S.25(OCOCH₃)2-Prävitamin D₃ zum Triol und dessen Umwandlung zum IS^S-Dihydroxy-cholecalciferol durch thermische Isomerisierung; Abtrennung von IS^S-Dihydroxy-cholecalciferol mittels HPLC (Ausbeute: 66%).

Dieser vorgeschlagene Weg zur Herstellung von IS^-Dihydroxy-cholecalciferol ist nachteiligerweise arbeits- und materialaufwendig, daher mit hohen Kosten verbunden, benötigt die HPLC zur Stofftrennung mit einem damit verbundenen nur geringen Stoffumsatz bzw. sehr hohen Kosten bei entsprechender Maßstabsvergrößerung und führt zu einer Gesamtausbeute von nur 10 bis 11 %, bezogen auf den entsprechenden Provitamin-D₃-Metaboliten.

Die sehr hohen Verluste bei dieser Verfahrensstufe der 1S.25-Dihydroxyvitamin-D₃-Herstellung von fast 90% entfallen zu etwa 40% auf die Derivatisierung (Acetylierung des Eduktes und Verseifung von 1 S.25(OCOCH₃)₂-Prävitamin D₃), die restlichen 60% haben ihre Ursache in der uneffektiven Gestaltung des Bestrahlungsschrittes. Bei den vorgeschlagenen Reaktionsbedingungen und Bedingungen für die Realisierung der Trennprozesse (HPLC; PorasilA-Säule) wird ein hoher Anteil nicht wieder verwendbarer Nebenprodukte (etwa 57%) gebildet, und ein Teil der über Recycling in 1 S.25(OH)_rPrävitamin D₃ zurückführbaren Nebenprodukte kann nicht isoliert und wieder eingesetzt werden.

Bei der in der JP-PS 52108964 vorgeschlagenen Synthese von 1 S^S-Dihydroxy-cholecalciferol wird auf die Derivatisierung verzichtet und als Edukt 1S.25(OH)₂-Provitamin D₃ eingesetzt. Zur Abtrennung von 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ aus dem Bestrahlungsgemisch und IS^S-Dihydroxy-cholecalciferol aus dem Gemisch der thermischen Isomerisierung wird Sephadex LH-20 mit den bereits oben dargelegten Nachteilen verwendet.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von IS^S-Dihydroxy-cholecalciferol, ausgehend von 3.1S.25-Trihydroxycholesta-5.7-dien (1 S.25(OH)₂-Provitamin D₃) zu finden, das mit einem geringen apparativen Aufwand in beliebig großem Maßstab durchführbar ist, zu einer hohen Ausbeute führt, die bestehenden Nachteile überwindet, auf diese Weise die Herstellung von 1 S^S-Dihydroxy-cholecalciferol ökonomisch günstig gestaltet und diesen für die Humanmedizin wichtigen Vitamin-Dj-Metaboliten in genügender Menge bereitzustellen gestattet.

Darlegung des Wesens der Erfindung

DerErfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von iS^S-Dihydroxy-cholecalciferol durch Bestrahlung von S.IS^S-Trihydroxy-cholesta-S^-dien (1S.25(OH)₂-Provitamin D₃) nach dem an sich bekannten Zweistufenprozeß, bestehend aus der Photolyse von 1 S.25(OH)₂-Provitamin D₃ mit UV-Licht und der nachfolgenden thermischen Isomerisierung von 9.10-seco-Cholesta-6.8.10(5)-trien (1S.25(OH)_rPrävitamin D₃) zu finden, das nur die Mindestanzahl an Verfahrensschritten erfordert und unter Anwendung einfacher, schneller und für einen beliebig großen Maßstab gleichermaßen gut geeigneter Trennverfahren einen großen Stoffumsatz ermöglicht und eine hohe Ausbeute erzielt. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß

a) als Lösungsmittel für den Bestrahlungsschritt Methanol oder Methyl-tert.butylether (MTBE) verwendet wird;

b) die Bestrahlung bei einer Temperatur von —30 bis—10⁴C erfolgt;

c) die Abtrennung von 1S.25(OH)_rPrävitamin D₃,1S.25(OH)₂-Lumisterol₃ und nicht umgesetztem 1S.25(OH)₂-Provitamin D₃' mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung eines silberimprägnierten Kieselgels als stationäre Phase erfolgt;

d) die Abtrennung von 1 S^S-Dihydroxy-cholecalciferol von 1 S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ aus dem Gemisch der thermischen Isomerisierung mittels Flash-Chromatographie erfolgt.

Erfindungsgemäß eignen sich als Lösungsmittel für den Bestrahlungsprozeß Methanol oder Methyl-tert. butylether, gegebenenfalls unter Zusatz von 1 bis 10% Methanol, Ethanol, n- oder iso-Propanol. Die erfindungsgemäßen Lösungsmittel für die Photoreaktion haben die erforderliche optische Transmission oder sind auf einfache Weise aus einem Produkt geringerer Qualität in eine solche Qualitätsstufe überführbar, besitzen gegenüber dem Edukt und dessen photochemischer Folgeprodukte eine ausreichende Löslichkeit und ermöglichen vor allem ein schnelles und kostengünstiges Einengen der Bestrahlungslösung bei der zur Vermeidung einer vorzeitigen thermischen Isomerisierung notwendigen Temperatur von 0 bis S⁰C. Die Konzentration der für die Bestrahlung eingesetzten Lösung kann 0,001 bis 1 g/l betragen. Die Bestrahlung kann in einem beliebigen Photoreaktor oder in einer einfachen Bestrahlungsapparatur erfolgen. Die für einen relativ hohen Anteil an 1 S.25(OH)_r Prävitamin D₃ im Produktgemisch erforderlichen Wellenlängenbereiche sind an sich bekannt und liegen bei 270 bis 310 nm. Vorteilhaft ist jedoch eine synchrone Bestrahlung mit UV-Licht im Wellenlängenbereich 254 bis 300 und 310 bis 350nm (DD-WP 213210).

Die für die Erzeugung dieser am Reaktionsort erforderliche Kombination von Strahlungsquelle und Filterlösung ist bereits vorgeschlagen worden. So erzeugt beispielsweise eine Quecksilberhochdrucklampe TQ150/21 der Firma Heraeus (Hanau) in Kombination mit einer Hiterlösung, bestehend aus 0,001 bis 1 g/l 2.7-Dimethyl-3.6-diaza-cycloheptadien-tetrafluoroborat und 0,1 bis 10g/l Biphenyl in Ethanol, eine für die bevorzugte Bildung von 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ hohe aktinische Lichtintensität und ist praktisch beliebig lange verwendbar. Erfindungsgemäß beträgt die Reaktionstemperatur für den Bestrahlungsprozeß —30 bis —10°C, vorzugsweise —25 bis -15⁴C. Bei dieser Temperatur ist der Anteil der gebildeten Nebenprodukte relativ gering, und die Reaktion kann bis zu einem Umsatz von 40 bis 80%, vorzugsweise 50 bis 60%, bezogen auf das Edukt, geführt werden. Überraschend wurde gefunden, daßmittels der einfachen, schnellen und in beliebig großem Maßstab durchführbaren Flash-Chromatographie (W. C. Still et al., J. Organic Chemistry, 43(1978)2923] unter Verwendung von silberimprägniertem Kieselgel aus dem aus vielen Komponenten mit weitgehend ähnlichem Trennverhalten bestehenden Bestrahlungsgemisch das gewünschte 1 S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ in sehr reiner Form und alle wieder verwendbaren Nebenprodukte sowie das nicht umgesetzte 1 S.25(OH)₂-Provitamin D₃ praktisch quantitativ abgetrennt werden können, während beispielsweise mit der in seiner Trennleistung an sich überlegenen HPLC unter Verwendung der in der HPLC üblichen Trägermaterialien nureine bedingte Auftrennung des Produktionsgemisches möglich ist.

Erfindungsgemäß wird für die flash-chromatographische Auftrennung des Bestrahlungsgemisches ein silberimprägniertes Kieselgel als stationäre Phase und als Elutionsmittel ein Lösungsmittelgemisch aus Essigester und Aceton, vorzugsweise in der Zusammensetzung 60 bis 90Vol.-% Essigester und 10 bis 40 Vol-% Aceton, verwendet. Das Trägermaterial kann beispielsweise so hergestellt werden, daß Kieselgel von 30 bis 40pm mit einer 0,5 bis 5%igen Lösung von Silbernitrat in Acetonitril innig vermischt, abfiltriert, mit η-Hexan gewaschen und getrocknet wird.

Vorteilhafterweise werden vier Fraktionen abgenommen. Die erste Fraktion ist Vorlauf und enthält gegebenenfalls einen sehr geringen Anteil schnell laufender irreversibler Nebenprodukte. Die zweite Fraktion enthält reines 1S.25(OH>2-Prävitamin D₃ (etwa 80% des im Gemisch vorhandenen Produktes). Die dritte Fraktion besteht aus dem restlichen Anteil 15.25(OH)₂-Prävitamin D₃ und 2 bis 3 weiteren Nebenprodukten und die vierte Fraktion enthält nicht umgesetztes 1S.25(OH)₂-Provitamin D₃ und 1 S.25(OH)₂-Lumisterol₃. Letztere Fraktion wird, gegebenenfalls unter Zusatz einer geringen Menge Natriumchlorid zwecks Entfernung sehrgeringer Silberspuren zurTrockene eingeengt. Der Rückstand wird in Methanol oder MTBE aufgenommen, und diese 1 S.25(OH)₂-Provitamin D₃ und 1 S.25(OH)j-Lumistero1₃ enthaltende Lösung wird erfindungsgemäß einer erneuten Bestrahlung zugeführt.

Aus der dritten Fraktion wird mittels einer erneuten flash-chromatographischen Trennung das restliche 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ abgetrennt, so daß mit der erfindungsgemäßen Trennung mehr als 95% des im Bestrahlungsgemisch vorhandenen 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ in sehr reiner Form isoliert werden kann.

Die vereinigten 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ enthaltenden Fraktionen werden eingeengt und auf an sich bekannte Weise in beispielsweise Dioxan oder Ethanol thermisch isomerisiert. Erhalten wird nach Abzug des Lösungsmittels ein öliges Produktgemisch, bestehend aus etwa 80% IS^ö-Dihydroxy-cholecalciferol und 20% 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃. Überraschend wurde gefunden, daß dieses Produktgemisch flash-chromatographisch praktisch quantitativ in die reinen Komponenten auftrennbar ist, obwohl der auf einer Kieselgelplatte maximal erreichbare R_F-Wert-Unterschied von nur 0,05 bis 0,06 weit unterhalb der an sich bekannten unteren Grenze für flash-chromatographische Trennungen [W. C. Still et al., J. Org. Chem. 43(1978)2923] liegt.

Erfindungsgemäß wird als stationäre Phase zur flash-chromatographischen Abtrennung von IS^-Dihydroxy-cholecalciferol aus dem Gemisch dertherm jschen Isomerisierung ein Kieselgel relativ einheitlicher Korngröße, vorzugsweise im Bereich von 15 bis 40μηι, verwendet, aber es ist auch das in der Flash-Chromatographie an sich bekannte: Kieselgel mit 40 bis 63 μιτι Korngröße verwendbar. Nachteiligerweise entsteht in diesem Fall eine nicht vollständig getrennte Überlappungsfraktion im Eluat. Diese wird einer erneuten Trennung zugeführt und erhöht auf diese Weise den Arbeitsaufwand. Als Elutionsmittel ist das in der Flash-Chromatographie übliche Lösungsmittelgemisch, bestehend aus Essigester und η-Hexan, vorzugsweise in der

Zusammensetzung 50 bis 90Vol.-% Essigester und 10 bis 50Vol.-% η-Hexan, geeignet. Die zweite Fraktion, die S.25(OH)₂-Prävitamin O₃ enthält, wird der erneuten thermischen Isomerisierung zugeführt Auf diese Weise wird eine praktisch

quantitative Umwandlung von 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ in IS^S-Dihydroxy-cholecalciferol erreicht.

Die "iS^S-Dihydroxy-cholecalciferol enthaltende Fraktion wird bei 5 bis 10'C eingeengt und im Ölpumpenvakuum getrocknet. Zurück bleibt ein farbloses bis schwach gelbliches, öliges Produkt, das in üblicher Weise kristallisiert oder gegebenenfalls

erfindungsgemäß durch Zugabe von MTBE und η-Hexan in das in Form weißer Nadeln leicht kristallisierbare und bedeutend stabilere MTBE-Addukt überführt werden kann.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Ausbeute an IS^-Dihydroxy-cholecalciferol beträgt 38 bis 42%, bezogen

auf daseingesetzte 1S.25(QH)₂-Provitamin D₃.

Das erfindungsgemäße Verfahren 2ur Herstellung von IS^S-Dihydroxy-cholecalciferol aus 1 S.25(OH)₂-Provitamin D₃ umgeht

die Derivatisierung, erfordert daher nur die Mindestzahl an dafür unbedingt notwendigen Verfahrensschritten, ist daher arbeits- und kostengünstig, für einen beliebig großen Maßstab ohne wesentliche Erhöhung des materiellen und zeitlichen Aufwandes gleichermaßen gut geeignet und erreicht eine höhere Ausbeute als gegenwärtig bekannt ist.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1:1 S.25-Dihydroxy-prä vitamin D₃

a) Bestrahlung von 1S.25-Dihydroxy-provitamin D₃

150 mg 1S.25-Dihydroxy-provitamin D₃ werden in 450 ml mit Argon gespültem Methyl-tertbutylether (MTBE) bei RT gelöst, auf -4O⁰C vorgekühtt und in den unterSchutzgas gebrachten, bereits vorgekühlten Photoreaktor überführt. Als Photoreaktor wird ein 450-ml-Reaktor der Firma Heraeus (Hanau) mit kühlbarem Tauchlampeneinsatz, Mantelkühlung und Umwälzung mit einer magnetgekoppelten Kreiselpumpe verwendet. Die Kühlung der Reaktorflüssigkeit sowie der Filterlösung erfolgt jeweils mittels eines Kryostaten MK 70.

Das aktinische Licht wird durch die Kombination des Quecksilberhochdruckstrahles TQ150/Z1 der Firma Heraeus, Hanau, mit

einer Filterlösung, bestehend aus 160 mg 2.7-Dimethyl-3.6-diaza-cycloheptadien-tetrafluoroborat und 3,2 g Biphenyl in 21

Ethanol p.a. realisiert. Die Lösung wird bei einer Temperatur von -25⁰C unter Umpumpen40 min bestrahlt. Der Umsatz beträgt etwa 60%, bezogen

auf das eingesetzte 1 S.25-Dihydroxy-provitamin D₃. Nach dem Einengen der Lösung unter Schutzgas im Ölpumpenvakuum bei etwa 0"C wird der Ölige Rückstand in 5ml Essigester/Aceton (v/v = 70/30) aufgenommen.

b) flash-chromatographische Trennung

Das für die flash-chromatographische Trennung des Bestrahlungsgemisches verwendete silberimprägnierte Kieselgel wird wie folgt hergestellt:

50gKieselgel Si 60,30 bis 40pm Korngröße, werden 2 Stunden mit 150 ml einer 2%igen Lösung von Silbernitrat in Acetonitril p.a. unter Lichtausschluß innig vermischt. Das Gel wird über eine G 4-Fritte abgesaugt, mit je 30 ml Acetonitril und Essigester/ η-Hexan gewaschen und bei 60"C 2 Stunden getrocknet. Das so erhaltene Kieselgel ist ein weißes bis leicht graues Pulver und ändert seine Farbe bei Aufbewahrung im Dunkeln nicht. Die chromatographische Säule (20x 150mm) wird mit etwa 30g silberimprägniertem Kieselgel gefüllt und mit etwa 500ml Essigester/Aceton (v/v = 70/30) equilibriert. Nach Aufgabe der Probe wird mit 200 ml des gleichen Lösungsmittelgemisches bei einem Druck von 0,7 atm eluiert. Es werden vier Fraktionen abgenommen:

I.Fraktion (30 ml), 2. Fraktion (35 ml), 3. Fraktion (25 ml), 4. Fraktion (90 ml).

Die dritte Fraktion wird unter den gleichen Bedingungen erneut flash-chromatographisch getrennt. Auf diese Weise wird praktisch quantitativ das im Bestrahlungsgemisch vorhandene 1 S.25(OH)j-Prävitamin D₃ in reiner Form isoliert. Die in der letzten Fraktion der zweiten Trennung noch isolierte geringe Menge an 1 S.25(OH)₂-Provitamin Dj wird mit der vierten Fraktion der ersten Trennung vereinigt, und nach Zugabe einer kleinen Spatelspitze Natriumchlorid wird die Lösung eingeengt, dreimal mit je 5 ml MTBE digeriert und vom festen Rückstand abfiltriert Es werden insgesamt 53 mg eines Gemisches aus 1S.25(OH)₂-Provitamin D₃ und 1S.25(OH)₂-Lumisterol₃ erhalten, die in 400ml MTBE gelöst und, wie unter a) beschrieben, erneut bestrahlt und anschließend unter den oben dargelegten Bedingungen flash-chromatographisch getrennt werden. Es werden 15mg eines Gemisches aus 1S.25(OH)₂-Provitamin D₃ (etwa 80%) und 1S.25(OM)₂-Lumisterol₃ (etwa 20%) erneut erhalten. Dieses Produktgemisch kann wieder einer Bestrahlung zugeführt werden. Das isolierte 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ wird mit den anderen 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ enthaltenden Fraktionen vereinigt und die Lösung wird nach Zugabe einer kleinen Menge Natriumchlorid unter Schutzgas zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird dreimal mit je 10ml MTBE digeriert. Nach Abzug des Lösungsmittels werden insgesamt 57 mg 1S.25(OH)_r Prä vitamin D₃ als öliges Produkt erhalten; das sind 42,2% bezogen auf das umgesetzte 1S.25(OH)₂-Provitamin D₃. Kn„ (Ethanol) = 260nm; R_F = 0,36 [HPTLC-Fertigplatte (Merck), silberimprägniert; Essigester/Aceton (v/v = 70/30) ].

Beispiel 2:1 S^S-Dihydroxy-cholecalciferol

57mg 1 S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ werden in 30ml Dioxan unter Schutzgas 2,5 Stunden erhitzt, und anschließend wird das

Lösungsmittel eingeengt. Es wird ein schwach gelblicher, öliger Rückstand erhalten, der mit 5 ml Essigester/n-Hexan (v/v = 75/

25) aufgenommen wird. Die flash-chromatographische Abtrennung von 1 S^S-Dihydroxy-cholecalciferol erfolgt unter folgenden

Bedingungen:

stationäre Phase: Kieselgel Si 60, Korngröße 30 bis 40pm

Säule: 2Ox 150ml (Trockenfüllung)

mobile Phase: Essigester/n-Hexan (v/v -75/25); 350ml

Druck: 0,8 atm

Es werden 180 ml Vorlauf abgenommen. Die nächste Fraktion (30ml) enthält reines 1S.25-Dihydroxy-cholecalciferol, dann werden 30 ml abgenommen, die einen geringen Anteil eines Nebenproduktes enthält und verworfen wird, und die letzte Fraktion (80 ml) besteht aus reinem 1S.25(OH)2-PräVrtamin D₃. Diese Fraktion wird nach Einengen wiederthermisch isomerisiert und das gebildete 1S.25-Dihydroxy-cholecalciferol wird erneut flash-chromatographisch abgetrennt. Die vereinigten 1S.25-Dihydroxycholecalciferol enthaltenden Fraktionen werden bei 5°C im Vakuum unter Schutzgas eingeengt. Erhalten werden 54 mg reines 1S.25-Dihydroxy-cholecalciferol; das sind 40% bezogen auf das umgesetzte 1S.25(OH)₂-Provitamin D₃. Die Identität der erhaltenen Verbindung wurde durch Vergleich mit einer authentischen Probe gesichert: TLC(50ug):

HPTLC-Fertigplatte (Merck); Essigester/n-Hexan (v/v = 75/25) R, = 0,23 (Probe); R, « 0,23 (Vergleichsprobe) HPTLC-Fertigplatte (Merck); silberimprägniert; Essigester/Aceton (v/v = 70/30) R_f = 0,28 (Probe); R, = 0,28 (Vergleichsprobe)

UV-Spektrum (Ethanol): X„„_x = 265 nm \_m„ = 265 nm

(Probe) (Vergleichsprobe)

λ,,ίη = 226 nm ' A_n,,-,, = 226 nm

Massenspektrum:

gef. 416,3290 (Probe) ber. für C₂₇H₄₄O₃ = ,3313 gef. 416,3290 (Vergleich)

Beispiel 3:1 S^S-Dihydroxy-cholecalciferol-Methyl-tert.butylether-Addukt

50 mg 1 S^S-Dihydroxy-cholecalciferol werden mit 5 ml Methyl-tert.butylether (MTBE) unter Schutzgas aufgenommen, und es werden langsam 5ml η-Hexan zugefügt. Die Kristallisation wird im Kühlschrank vervollständig. Es werden 62 mg 1S.25-

Dihydroxy-cholecalciferol-MTBE in Form kleiner weißer Nadeln erhalten. Die Produktanalyse erfolgt durch Kombination von

¹H-NMR-und UV-Spektrum.

Das erhaltene Addukt ist sehr stabil. Bei einer 6monatigen Lagerung im Tiefkühlschrank unter Schutzgas können mittels Nano- Dünnschichtchromatographie (50μρ) keine Zersetzungsprodukte nachgewiesen werden.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von IS^ö-Dihydroxy-cholecalciferol durch Bestrahlung von 3.1S.25-Trihydroxy-cholesta-5.7-dien (1S.25(OH)₂-Provitamin Ds) in einem organischen Lösungsmittel urid thermische Isomerisierung des gebildeten 9.10-seco-Cholesta-6.8.10(5)-trien (1S.25(OH)2-Prävitamin D₃) gekennzeichnet dadurch, daß

a) als Lösungsmittel für den Bestrahlungsschritt Methanol oder Methyl-tert. butylether (MTBE) verwendet wird;

b) die Bestrahlung bei einerTemperaturvon —30 bis —10⁰Cerfolgt;

c) die Abtrennung von 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃,1S.25(OH)₂-Lumisterol₃ und nicht umgesetztem 1S.25(OH)₂-Provitamin D₃ mittels Flash-Chromatographie unter Verwendung eines silberimprägnierten Kieselgels als stationäre Phase erfolgt;

d) die Abtrennung von IS^ö-Dihydroxy-cholecalciferol von 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃ aus dem Gemisch der thermischen Isomerisierung mittels Flash-Chromatographie erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Bestrahlung von 15.25(OH)₂-Provitamin-D₃-Lösung vorzugsweise bei —15 bis-25⁰C erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, gekennzeichnet dadurch, daß Methyl-tert.butylether, gegebenenfalls unter Zusatz von 1 bis 10% Methanol, Ethanol, η- oder iso-Propanol, verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration der Lösung für die Bestrahlung 0,01 bis 1 g/l beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß zur flash-chromatographischen Abtrennuungvon 1S.25(OH)₂-Prävitamin D₃,1S.25(OH)₂-Provitamin D₃ und 1S.25(OH)₂-Lumisterol₃ ein Lösungsmittelgemisch aus Essigester und Aceton, vorzugsweise in der Zusammensetzung bis 90 Vol.-% Essigester und 10 bis 40 Vol.-% Aceton, verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß 1 S.25(OH)₂-Provitamin D₂ und 1 S.25(OH)₂- Lumisterol₃ der Bestrahlung erneut zugeführt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß zur flash-chromatographischen Abtrennung von IS^ö-Dihydroxy-cholecalciferol aus dem Gemisch der thermischen Isomerisierung ein Kieselgel relativ einheitlicher Korngröße, vorzugsweise im Bereich von 15 bis 40 pm, verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß das ölige iS.25-Dihydroxycholecalciferol gegebenenfalls als Methyl-tert. butylether-Addukt kristallisiert wird.