DD280465A1

DD280465A1 - Verfahren zur herstellung von bluthochdrucksenkenden mitteln

Info

Publication number: DD280465A1
Application number: DD32647089A
Authority: DD
Inventors: Claus Wagenknecht; Horst Heine; Manfred Wirth; Vera Moritz; Siegfried Martin; Rainer Macholz; Beate Voigt; Klaus Lusky; Frank Leopold; Wolfgang Roedel
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1989-03-10
Filing date: 1989-03-10
Publication date: 1990-07-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von bluthochdrucksenkenden Mitteln, die neben Wirkstoffen uebliche pharmazeutische Traeger oder Verduennungsmittel und gegebenenfalls weitere Wirkstoffkomponenten und Hilfsstoffe enthalten. Erfindungswesentlich ist der Einsatz von Wirkstoffen mikrobieller Biomassen, die durch Einwirkung von Mikroorganismen, vorzugsweise von lipidhaltigen Hefen auf Kohlenwasserstoffe erhalten wird. Erfindungsgemaess enthaelt die Biomasse vorzugsweise einen Gehalt an geradlinigen und ungeradzahligen ungesaettigten Fettsaeuren mit 13- bis 21-C-Atomen und Doppelbindungen in D 9- oder D 10-Position und/oder auf Methanol kultivierte Bakterienbiomassen oder deren lipidhaltigen Extrakte. Als weitere Wirkstoffkomponente wird biologisch hochwertiges Eiweiss eingesetzt und Ubichinon den Wirkstoffen zugesetzt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zu^r Herstellung von bluthochdrucksenkenden Mitteln auf der Basis von speziellen Fettsäuren mit einer höheren Anzahl von C-Atomen als W-rkstoff, die vorzugsweise zur Behandlung und Prophylaxe bei Herz- und Kreislauferkrankungen geeignet sind und eine verbesserte physiologische Wirksamkeit gegenüber gebräuchlichen Arzneimitteln und bekannten diätetischen Maßnahmen im menschlichen Körper haben.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bekannt ist der Einsatz von kurz-, mittol- und langkettigen Fettsäuren bzw. Fettsäurederivaten als Wirkstoffkomponente für Arzneimittel gegen Herz- und Kreislauferkrankungen.

In der DE-OS 3410850 A1 wird ein Arzneimittel zum Verstärken von Blutgefäßen beschrieben, das als Wirkstoffe Fettsäuren, wie

z. B Palmitinsäure, PaIn^- toleinsäure und Undecensäure enthält. Deren Kohlenstoffatome sind in cis-Form durch Einfach- oder Doppelbindungen miteinander verbunden.

Bekannt ist ebenfalls, daß flüssige Emulsionen, die als Wirkstoffe Fettsäuren mit 20- bis 22-C-Atomen oder einen Ester der Fettsäuren enthalten und aus Pflanzenöl, einem Emulgator und Wasser bestehen, antithrombotische und antiarteriosklerotische Wirkung besitzen (DE-OS 3409793 A1).

Bekannt ist weiterhin, und vielfach bereits praktiziert wird der Einsatz von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, vorrangig aus Fischölen, aber auch aus Mikroorganismen, insbesondere Algen (BOROWITZKA und BOROWITZKA1988). Der Applikation von Fischölen, vorrangig bestehend aus den Wirkkomponenten Arachidonsäure, Docosahexaensäure u.a. geradzahligen Fettsäuren, wird ein lioher Stellenwert bei der Prävention von Herz-Kreislauf-Krankheiten beigemessen. In der dieses Gebiet gründlich behandelnden wissenschaftlichen Literatur werden Fettsäuren mit ungerader An' ihl von C-Atomen weder als wesentliche Wirkkomponente noch entscheidende Inhaltsstoffe dieser Präparate beschrieben.

Andererseits ist es be'.annt, daß Prostaglandinverbindungen sowohl als Wirkstoff zur Senkung des Blutzuckerspiegels (DE-OS 2640953), zu' Senkung des Blutdruckes (DD-PS 133904) als auch als Kreislaufstabilisatoren (DE-OS 2736320) ihre Anwendung finden. Oie eingesetzten Prostaglandine oder ihre Derivate werden hierbei mit einer geradzahligen Anzahl von C-Atomen verwei.J-1. Bekannt ist auch der Einsatz von Arzneipräparaten zur Behandlung von Herzerkrankungen, deren Wirkstoffe modifizie rte methylverzweigte Fettsäuren mit 17-C-Atomen unter dem Namen 4, 5,9-Trimethyl-2-(4'azaamyl)-dekadien-4,8-säurc. enthalten.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Mitteln zu entwickeln, die neue Wirkstoffbestandteile enthalten und zur Bluthochdrucksenkung beim Menschen geeignet sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, spezielle Verfahrensbedingungen aufzuzeigen, welche die obige Zielstellung zu realisieren gestatten.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zur Herstellung von bluthochdrucksenkenden Mivteln, die neben Wirkstoffen übliche pharmazeutische Träger oder Verdünnungsmittel und gegebenenfalls weitere Wirkstoffkomponenten und Hilfsstoffe, vorzugsweise Andioxydantien enthalten, Wirkstoffe aus mikrowellen Biomassen eingesetzt werden. Sie werden

durch Kultivierung von Mikroorganismen, vorzugsweise lipidreichen Hefen, auf Kohlenwasserstoffen, vorzugsweise gereinigten n-Alkanen, gewonnen.

Erfindungswesentlich dabei ist, daß eine Biomasse eingesetzt wird, die vorzugsweise einen hohen Gehalt an geradlinigen und ungeradzahligen ungesättigten Fettsäuren mit 13- bis i1-C-Atomen und Doppelbindungen in Δ9- oder ΔΙΟ-Positionen und/oder auf Methanol kultivierte Bakterienbiomassen oder deren lipidartige Extrakte, vorzugsweise Biomasse mit biologisch hochwertigem Eiweiß bei einem Gehalt an Ubichinon >0,04% enthält. Dabei können die Fettsäuren in freier und/oder gebundener Form vorliegen.

Die Gewinnung der Lipidextrakte bzw. der freien Fettsäuren erfolgt durch Verwendung von Lösungsmitteln, vorzugsweise durch Extraktion mit Hexan, Petrolether, chlorierten Kohlenwasserstoffen, Gemischen aus Benzin/Methanol, vorzugsweise im Verhältnis 80/20 von Benzin/Ethanol oder Hexan/Ethylether-Gemischen (95:5 in der günstigsten Variante). Die Extraktion ist nach alkalischer Hydrolyse der Lipidphase (z. B. gewonnen mit o.g. Lösungsmitteln) und Ansäuern durchzuführen.

Es hat sich gezeigt, daß auch physiko-cnamische Fraktionierungsve'fahren, wie die Anwendung von Gasen im überkritischen Zustand zur Gewinnung des natürlichen Gemisches der Fettsäuren bevorzugt geeignet sind, wobei gleichzeitig eine Aufkonzentrierung der Wirkstoffkomponenten, Lipidfraktion und Ubichinon mit diesen Verfahrensschritten erreicht wird.

Die Erfindung wird an nachfolgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Die Kultivierung des Hefestammes Lodderomyces elongisporus IMET128 erfolgt in einem 1001 Rührfermentor, de' mit allen für die aerobe Züchtung von Mikroorganismen notwendigen Einrichtungen und der erforderlichen Meßtechnik ausgei üo'.?t ist. Als Kohlenstoff- und Energiequelle für den Fermentationsprozeß dient ein gereinigtes Gemisch von η-Paraffinen der Kettenlänge

Die Nährlösung hat folgende Zusammensetzung:

KCI	1g/l
MgSO₄ -7 H₂O	0,4 g/l
MnSO₄-4 H₂O	6mg/l
MoSO₄-2 H₂O	3mg/l
CnSO₄-5H₂O	0,5mg/l
FeCI₃ -7 H₂O	5mg/l
H₃PO₄,75%ig	0,9 g/l
tiauuiibuuuiiiyuii^ Paraffingehalt:	jell oiiiu ιuiy 4Ma.-%
Temperatur:	33⁰C
pH-Wert:	4,2
Belüftungsrate:	70 l/kg h

Zu Beginn werden 5Ol Nährlösung in den Fermentor gegeben, temperiert, belüftet und mit Hefesuspension beimpft.

Zur pH-Regelung des Fermentationsmediums wird 5%ige Natronlauge verwendet.

Die Stickstoffversorgung im Limitationsbereich erfolgt mit Ammoniakwasser derart, daß der aktuelle Stickstoffgehalt des zellfreien Fermentationsmediums 10mg/l nicht übersteigt.

Der Wachstumsprozeß wird bis zur Auszehrung der Kohlenstoff- und Energiequelle, die sich durch Absinken des Anteils sprossender Zellen auf etwa 20%, Ansteigen des pH-Wertes, der Gelöstsauerstoffkonzentration des Fermentationsmediums, Abfall des CO₂-Gehaltes und Ansteigen des O₂-Gehaltes in der Abluft ankündigt, geführt.

Die Hefesuspension wird in einem Aufrahmgefäß während einer Verweilzeit von 40 Minuton von dem Prozeßwasser getrennt, auf 85°C erwärmt und in einem geeigneten Separator auf einen Feststoffgehalt von 15-20Ma.-% aufkonzentriert. Aus diesem Konzentrat wird mit Hilfe eines Sprühtrockners die Hefetrockensubstanz mit einem Wassergehalt von 5-8Ma.-% gewonnen.

Beispiel 2

Der im Beispiel 1 beschriebene Fermentationsprozeß wird zur Erzeugung einer lipidreichen Hefetrockensubstanz so geführt, daß die Stickstoffversorgung mittels Ammoniakwasser schrittweise so gesenkt wird, daß im zellfreien Fermentationsmedium der Stickstoffgehalt auf 0mg/l absinkt.

Alle weiteren Aufarbeitungsschritte erfolgen analog Beispiel 1.

Beispiel 3

50g Hefetrockensubstanz werden mit Ethanol/Wasser 60/40 gut gemischt und anschließend in einem mit Rührer und RückflußkühlerversehenenöOO-ml-Dreihalskolben gegeben. Das Gemisch wird auf 40°C erwärmt, und nach 10 Minuten werden 100g Benzin/Ethanol/Wasser 80/19/1 hinzugefügt. Der Siedebereich des verwendeten Benzins liegt zwischen 60⁰C und 85°C.

Die Extraktion der Lipide erfolgt durch intensives Rühren bei 40°C über eine Zeit von 10 Minuten. Anschließend wird die Miszella über eine geeignete Glasfilternutsche abgesaugt und die Extraktion auf gleiche Art noch dreimal wiederholt.

Die Miszella der einzelnen Extraktionsstufen wird vereinigt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt.

Beispiel 4

10g eines nach Beispiel 3 erhaltenen Lipidextraktes werden mit 100 ml Ethanol und 8g KOH versetzt und 2 Stunden am Rückfluß verseift. Nach Zugabe von 100ml dest. Wasser wird das Hydrolysegemisch dreimal mit 100ml η-Hexan extrahiert Die Hexanphasen werden verworfen. Das Freisetzen der Fettsäuren aus der Seifenlösung erfolgt durch Zugabe von 6N HCI bis zu

einem pH-Wert von 1. Die freien Fettsäuren werden durch Extraktion (dreimal mit 100ml η-Hexan) aus dem Reaktionsgemisch isoliert und mit dest. Wasser bis zur neutralen Reaktion des Waschwassers gewaschen. Anschließend wird die Hexanphase über Na₂SO₄ sicc. getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt

Der Destillationsrückstand stellt ein Gemisch aus freien Fettsäuren im Bereich von C₁₂-C₁₈ dar.

Beispiel 5

Die Umsetzung der freien Fettsäuren zu Methylestern erfolgt mit einem Gemisch aus Methanol und konz. Salzsäure folgender Zusammensetzung

130ml Methanol 20 ml konz. HCI

Zu 150ml des salzsauren Methanols werden 20g einer Fettsäure oder eines Fettsäuregemisches hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wird 3 h bei 70-80°C unter Verschluß gehalten. Nach dem Abkühlen werden die Methylester dreimal mit 100ml η-Hexan extrahiert. Die Entfernung des Lösungsmittels erfolgt im Wasserstrahlvaxuum bei 4O⁰C.

Beispiel 6

Herstellung einer ubichinonhaltigen Bakterienbiomasse

In einem Rührfermentor von 121 Bruttovolumen werden 51 eines Nährmediums folgender Zusammensetzung gegeben:

NH₄CI	2 g/l
K₂HPO₄	0,6 g/l
MgSO₄-7 H₂O	0,4 g/l
CaSO₄-5 H₂O	2,4 mg/1
CoS0₄-5H₂0	0,6 mg/1
MnSC₄-4 H₂O	4,7 mg/1
H₃BO₃	7,0 mg/1
FeCI₃ · 7 H₂O	4,2 mg/1
CaCI₂ 6H₂O	7,2 mg/1
Na₂MoO₄-2 H₂O	7,8 mg/1
ZnCI₂-7 H₂O	6,0 mg/1
Hefeextrakt	0,1 %

Dieses Näh. medium ermöglicht einen Organismenzuwuchs von 5g/l. Nach Einstellen eines pH-Wertes von 4,1 durch verdünnte Schwefp'.säure und einer Temperatur von 32⁰C wird das Fermentationsmedium mit der Kultur Acetobacter methanolicus IMET B 3^~ oeimpft, so daß sich eine Startkonzentration von etwa 0,5 g Biomasse/l ergibt. Das Medium wird mit einer Belüftungsrate von 100l/h begast und mit 1200 U/min gerührt. Durch Zusatz von 3g Methanol/l wird der diskontinuierliche Wachstumsprozeß gestartet und die Methanolkonzentration anschließend durch kontinuierliche Zugabe von 0,1-0,3g/l Methanol gehalten.

Zur Regulierung des pH-Wertes wird b%ige Natronlauge verwendet. Nach Erreichen einer Biomassekonzentration von etwa 5g/l erfolgt der Übergang zur kontinuierlichen Prozeßführung mit einer Verweilzeit von 6,5 Stunden. Die im kontinuierlichen Prozeß eingesetzte Nährlösung ist bilanziert für einen Organismenzuwachs von 15g/l. Der Prozeß wird so geführt, daß die Stickstoffkonzentration im Fermentationsmedium 10mg/l nicht übersteigt. Ein weiterer Zusatz von Hefeextrakt im unsterilen kontinuierlichen Prozeß ist nicht erfordsrlich.

Bedingt durch die vorgegebene Nährstoffkonzentration wird im stationären Prozeßzustand eine Zellkonzentration von 15,8g/l erreicht.

Die Biomasse wird nach einer vorgeschalteten Separationsstufe durch Sprühtrocknung aus dem Fermentationsmedium gewonnen. Die Biomasse enthält 0,08% Ubichinon -10.

Beispiel 7

Gewinnung eines ubichinonhaltigen Extraktes.

250g sprühgetrocknete Biomasse eines auf Methanol kultivierten Bakterienstammes der Gattung Acetobacter (Beispiel 1) werden zweimal mit 750g Aceton/Wasser (90:10, v/v) je 30 Minuten bei Raumtemperatur extrahiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Wasserstrahlvakuum werden 2,9 g Extrakt erhalten. Der Extrakt enthält 5,5% Ubichinon -10.

Beispiel 8

Gewinnung von Ubichinon -10.

10g eines nach Beispiel 2 erhaltenen Lipidextraktes werden mit 20ml 10%iger methanolischer KOH und 4ml 10%iger wäßrip"-Natriumdithionitlösung 20 Minuten am Rückfluß verseift. Nach Zugabe von 100 ml Wasser wird die Seifenlösung dreimal r 100ml η-Hexan extrahiert. Die vereinigten Hexanph.-.sen werden mit Wasser neutral gewaschen und über Na₂SO₄ sicc.

getrocknet. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt. Aus dem Rückstand wird mittels Säulenchromatographie an Silicagel die Ubichinonfraktion isoliert. Nach Umkristallisation aus Aceton werden 450mg Ubichinon -10 erhalten.

Beispiel 9

Zur Herstellung eines bluthochdrucksenkenden Mittels werden die folgenden Bestandteile gewählt:

Lipidextraktion aus n-Paraffinhefe	10,5%
Ubichinon	0,05%
Methionin	0,01 %
Threonin	0,01 %
Casein	ad. 100%

Die Substanz wird mit Drageedeckmasse bzw. Gelatinekapsel in bekannter Weise umhüllt.

Beispiel 10

Nach einer anderen Variante werden zur Herstellung eines bluthochdrucksenkenden Mittels die folgenden Komponenten miteinander vermischt.

Lipidextraktaus	5%
Methanol-Biomasse	20%
Lipidextraktaus n-Paraffinhefe	0,05%
Methionin	ad. 100%
Ackerbohneneiweißisolat

Beispiel 11

Nach einer weiteren Variante werden biomasseeigene Proteinquellen genutzt:

Lipidextraktaus n-Paraffinhefe 5%

Methionin 0,05%

Proteinisolat aus n-Paraffinhefe ad. 100%

Beispiel 12

Nach einer anderen Variante werden die folgenden Komponenten miteinander gemischt

Fettsäuregemisch aus Lipidextrakt der	3%
n-Paraffinhefe	0,5%
Ubichinon	0,01 %
Methionin	0,01
Threonin	ad. 100%
Casein

Claims

1. Verfahren zur Hersteilung von bluthochdrucksenkenden Mitteln, die neben Wirkstoffen übliche pharmazeutische Träger oder Verdünnungsmittel und gegebenenfalls weitere Wirkstoffkomponenten und Hilfsstoffe, vorzugsweise Antioxydantien enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß Wirkstoffe mikrobieller Biomassen, die durch Kultivierung von Mikroorganismen, vorzugsweise lipidreichen Hefen auf Kohlenwasserstoffen, insbesondere auf gereinigten n-Alkanen, erhalten werden und vorzugsweise einen Gehalt an geradkettigen und ungeradzahligen ungesättigten Fettsäuren mit 13- bis 21-C-Atomen und Doppelbindungen in Δ9- oder ΔΙΟ-Position und/oder auf Methanol kultivierten Bakterienbiomassen oder deren lipidartige Extrakte, vorzugsweise Biomasse mit einem Gehalt an Ubichinon, eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäuren in freier und/oder gebundener Form vorliegen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als weitere Wirkstoffkomponenten biologisch hochwertiges Eiweiß, welches hydrolysiert als Peptid oder Aminosäuremischung, vorzugsweise angereichert mit Methionin und Threonin, vorliegt, eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Zusätze der Wirkstoffe Ubichinon und/oder als ubichinonhaltige Extrakte erfolgen.