DD277276B5 - Verfahren zur Herstellung neuer Cholecystokinindialkylamide - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuartigen acylierten Cholecystokininsequenzen der allgemeinen Formel

A«yl-Tyr( SE)-I-

⁴R₂

in der Acyl einen Aminosäurerest, vorzugsweise Asparaginsäure oder einen Carbonsäurerest, vorzugsweise Bersteinsäure oder eine in der Peptidchemie gebräuchliche Schutzgruppe wie t-Butyloxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) darstellt und SE einen Sulfatrest am Tyrosin bedeutet. X steht für einen Aminosäurerest, vorzugsweise Thr, Nie, Leu oder Met und Y für Met, Nie, Leu, Met-Asp oder Nle-Asp oder Leu-Asp. Zur besseren enzymatischen Stabilität kann L-Trp durch D-Trp ersetzt werden. R₁ und R₂ stehen für Alkylgruppen C₄ bis C₇. Derartige Peptide stellen neuartige, hochwirksame Antagonisten des Cholecystokinins dar und sind wertvolle Hilfsmittel für pharmakologische Untersuchungen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Forschung und die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das gastrointestinale Peptidhormon Cholecystokinin (CCK) existiert in verschiedenen molekularen Formen, unter anderem als CCK-39, CCK-33, CCK-12 und CCK-8 (v. Mutt und E. Jorpes, Biochem. Journal 125, 57 1971).

Es zeigt eine Reihe wichtiger Effekte im Gastrointestinal-, Pankreas- und hepatobilären System. So stimuliert es die Gallenblasenkontraktion und bewirkt die Relaxation des Sphincter oddi (Übersichten siehe J.E. Morley, Life Sei. 30,479,1982 und Nieber, K.; Henklein, P.; Ott,T. und P.OehmeZ. gesamte inn. Med. 42 [1987] 501).

Nach dem Auffinden von CCK im ZNS wurden weitere Effekte entdeckt. So spielt CCK unter anderem eine Rolle bei der Appetitsregulation, Analgesie, Ptosis oder Katalepsie.

Zur pharmakologischen Untersuchung all dieser Effekte sind Antagonisten wichtige Hilfsmittel. Die gegenwärtig bekannten Antagonisten des Cholecystokinins sind Derivate der Glutaminsäure-Proglumid-(A. L. Rovati, Minerva Medica 1967,58,3651; MacovecetaUEur.J.Med.Chem.-chim.Ther. 21 [1986] 9), desTryptophans-Senzotript-(Hahne, W. F.; Jensen,T.; LempG.F.

und J. D.Gardner 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. 78 [1987] 6304) bzw. verkürzte oder cyclische Sequenzen des Cholecystokinins (Spanarkel et al., J. Biol. Chem. 258, 6746 [1983); M. Ch. Galas Am. J. Physiol. 254, 8176 [1988] sowie R. M. Freidinger et al., Proc.

19th. Europ. Peptid Symp. 1986 Porto Carras Griechenland, EP-PS 0132919).

Neuerdings fand man daß 3-substituierte Benzodiazepine ebenfalls peripher eine hohe antagonistische Aktivität besitzen (Chang

R. U. Science 230 [1985] 177). Variationen der Substituenten führten zur weiteren Wirkungsverstärkung (Evans, B.E., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 83, [1986] 4918; US-PS 4554272, US-PS 4563451, US-PS 4559338, EP-PS 166353, EP*PS 166354, EP-PS 167920, EP-PS 170024).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, neuartige Antagonisten des Cholecystokinins auf Peptidbasis herzustellen, die eine hohe antagonistische Aktivität besitzen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zu entwickeln, nach denen sich neuartige Sequenzen des Cholecystokinins (CCK) mit antagonistischen Eigenschaften herstellen lassen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß C-terminal verkürzte Sequenzen synthetisiert wurden, denen die C-terminalen Aminosäuren Phenylalanin oder Phenylalanin und Asparaginsäure fehlen. Die endständige Aminosäure Y wurde in das entsprechende Dialkylamid umgewandelt. Die so erhaltenen verkürzten CCK-Sequenzen zeigen überraschenderweise keinerlei agonistische Eigenschaften mehr, sind jedoch in der Lage, Cholecystokinin in Konzentrationen von 10~⁷ bis 1СГ⁸ Mol/l zu hemmen. Die neuartigen Verbindungen wurden peptidchemisch in üblicher Weise entweder stufenweise oder durch Fragmentkondensation unter Verwendung bekannter Schutzgruppen, beginnend vom Boc-Y-dialkylamid aufgebaut. Anschließend wird das geschützte Peptid von den Schutzgruppen befreit, acyliert und danach mit Pyridiniumacetylsulfat sulfatiert. Die Endreinigung erfolgt durch preparative HPLC an RP-18 isokratisch mit 25% Acetonitril/0,05 η Ammoniumacetatlösung pH 6,5

Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1 Suc-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-N(C₄H₉)₂

Boc-Trp-Met-OH wird mit H-ASp(OBu¹I-N(C₄H₉J₂ zum Boc-Trp-Met-Asp(OBu')-N(C₄H₉J₂ umgesetzt. Nach Abspaltung der Boc- und der Esterschutzgruppe wird das Tripeptid H-Trp-Met-Asp-N(C₄H₉J₂ mit Boc-Tyr-Met-Gly-ONB zum Hexapeptid verlängert. Nach Abspaltung der Schutzgruppe und nachfolgender Acylierung mit Bernsteinsäureanhydrid erhält man in Ausbeuten von 83% Suc-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-N(C₄H₉)₂

Fp. 130-140⁰C. (unter Erweichen)

HPLC: Säule 2,1 x 100mm ODS-Hypersil 5μηη

0,01 mol Ammoniumacetat/CHaCN 28% pH4,3

R_t = 8,5 min einheitlich

Beispiel 2 Suc-Tyr(SE)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-N(C₄H₉)2

1 kg vorstehender Verbindung wird mit 1 g Pyridiniumacetylsulfat 24 h bei Raumtemperatur sulfatiert. Nach üblicher Aufarbeitung erfolgt die Reinigung an Vydac^RC'¹⁸ 20 χ 250mm (0,05n Ammoniumacetat/25% CH₃CN) Ausbeute: 217mg

Fp. 212-235⁰C. unscharf unter Erweichen

HPLC: Säule ODS-Hypersil 5μηι 2,1 χ 100mm

0,01 m H₃PO₄/Acetonitril 28^42% (10min) pH2,2

R_t = 2,3 min einheitlich

0,01 mol Ammoniumacetat/CHaCN 28% pH4,3

R, = 4,2min einheitlich

Beispiel 3

Am isolierten Meerschweinchen ileum antagonisiert Suc-Tyr(SE)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-N(C₄H₉)₂ die kontraktionsauslösende Wirkung von CCK-8 kompetitiv. Bis zu einer Konzentration von 10~⁵ Mol/l zeigte die Substanz keinerlei kontrahierende Eigenwirkung. DerpA₂-Wertfür2 liegt bei 7.12 ± 0,211 (n = 6)

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung neuer Cholecystokininsequenzen der allgemeinen Formel I

ACyI-TYr(SE)-X-GIy-TrP-Y-NR₁R₂ ,

in der Acyl einen Aminosäurerest A oder einen Carbonsäurerest oder eine Schutzgruppe darstellt, SE für einen Sulfatesterrest am Tyrosin, X für einen Aminosäurerest B und Y für einen oder mehrere Aminosäurereste C stehen und R₁, R₂ Alkylreste zwischen C₄ und C₇ darstellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I stufenweise oder durch Fragmentkondensation aufgebaut und nach der Abspaltung der Schutzgruppen acyliert und sulfatiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese unter Verwendung üblicher Schutzgruppen und beginnend von BoC-Y-NR₁R₂ erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest A vorzugsweise aus Asparaginsäure, der Carbonsäurerest vorzugsweise aus Bersteinsäure, die Schutzgruppen z.B. aust-Butyloxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) bestehen, der Aminosäurerest B vorzugsweise für Thr, Nie, Leu, oder Met und C für Met, Nie, Leu, Met-Asp, Nle-Asp oder Leu-Asp stehen.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel I L-Trp durch D-Trp ersetzt werden kann.