DD294949B5 - Neue Cholecystokininhexapeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Acyl-Tyr(SE)-X-Gly-Trp-Y-GluNH-CH₂-CH₂-C₆H₅ I,

in der Acyl einen Aminosäurerest A oder einen Carbonsäurerest oder eine Schutzgruppe darstellt, SE für einen Sulfatesterrest am Tyrosin, X für einen Aminosäurerest B und Y für Met, Nie oder Leu stehen.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf neue Cholecystokininhexapeptide und ein Verfahren zur Herstellung neuer Antagonisten des Cholecystokinins der Formel I

Acyl-Tyr(SE)-X-Gly-Trp-Y-GluNH-CH₂-CH₂-C₆H₅ (I),

in der Acyl ζ. B. Asparaginsäure, Bernsteinsäure oder eine Schutzgruppe, wie Boc oder Z sein kann, SE einen Sulfatesterrest bedeutet, X für Thr, Nie, Leu oder Met und Y für Met, Nie oder Leu stehen kann.

L-Trp in Formel I kann durch D-Trp ersetzt sein. Die Anwendungsgebiete sind die medizinische Forschung und die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das gastrointestinale Peptidhormon Cholecystokinin (CCK) existiert in verschiedenen molekularen Formen, unter anderem als CCK-39, CCK-33, CCK-12 und CCK-8 (v. Mutt und E. Jorpes, Biochem. Journal 125, 57. [1971]).

Es zeigt eine Reihe wichtiger Effekte im Gastrointestinal-, Pankreas- und hepatobilären System. So stimuliert es die Gallenblasenkontraktion und bewirkt die Relaxation des Sphincter oddi (Übersichten siehe J. E. Morley, Life Sei. 30, 479, [19821 und Nieber, K.; Henklein, P.; Ott, T. und P. Oehme, Z. gesamte innere Medizin, 42, 501 [1987]).

Nach dem Auffinden von CCK im ZNS wurden weitere Effekte entdeckt. So spielt CCK unter anderem eine Rolle bei der Appetitsregulation, Analgesie, Ptosie und Katalepsie. Zur pharmakologischen Untersuchung all dieser Effekte sind Antagonisten wichtige Hilfsmittel. Die gegenwärtig bekannten Antagonisten des Cholecystokinins sind Derivate der Glutaminsäure-Proglumid-(A. L. Rovali, Minerva Medica 1967, 58 3651; Macovec et al., Eur. J. Med. Chem.-chim. Ther. 21, 9 [1986], des Tryptophans-BenzotripHHahne, W. F., Jensen, Т., Lemp, G. F. und J. D. Gardner Proc. Natl. Acad. Sei. 78, 6304 [1987]) bzw. verkürzte oder cyclische Sequenzen des Cholecystokinins [Spanarkel et al., J. Biol. Chem. 258, 6746 [1983]; M. Ch.

Galas, Am. J. Physiol. 254, G 176 [1988] sowie R. M. Freidinger et al., Proc. 19th Europ. Peptid Symp. 1986, EP-SP 0132919).

Neuere Derivate des Benzodiazepine besitzen entweder peripher oder zentral eine hohe antagonistische Aktivität (M. G. Bock,

J. med. Chem. 31, 264 [1988] und V. J. Lotti et al., Europ. J. Pharm. 162, 273 [1989]).

Kürzlich wurden auf der Basis von verkürzten Sequenzen neue wirksame Antagonisten entwickelt (DD 272 652, DD 272 653, DD 276 483, DD 277 276 und DD 276 482).

Alle bisher gefundenen Antagonisten auf Peptidbasis wiesen eine noch zu geringe antagonistische Aktivität auf (IC -Werte

10·⁶ bis 10⁸MoI. ⁵⁰

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, neuartige Antagonisten des Cholecystokinins auf Peptidbasis herzustellen, die eine höhere antagonistische Aktivität besitzen als die vergleichbaren bekannten Antagonisten auf Peptidbasis.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, nach dem sich neuartige Sequenzen des Cholecystokinins (CCK) mit antagonistischen Eigenschaften herstellen lassen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß C-terminal verkürzte Sequenzen synthetisiert wurden, denen die C-terminale Aminosäure Phenylalanin fehlt und Asparaginsäure in Position 32 durch Glutaminsäure ersetzt wird. Die endständige Aminosäure GIu wurde in das ß-Phenethylamid (PEA) umgewandelt. Die dadurch erhaltenen verkürzten CCK-Sequenzen zeigen überraschenderweise keinerlei CCK-Eigenschaften mehr, sind aber in der Lage, CCK in Konzentrationen von 10"⁸-10"⁹ Mol/l zu hemmen. Die Verbindungen wurden peptidchemisch in üblicherweise unter Verwendung bekannter Schutzgruppen hergestellt. Zu diesem Zweck wurde Boc-Trp-Met-Glu-PEA hergestellt, von der N-Schutzgruppe mit 2 N HCI/Eisessig befreit und mit Boc-Tyr-X-Gly-OH zum Hexapeptid umgesetzt. Das Hexapeptid Boc-Tyr-X-Gly-Trp-Y-Glu-PEA wird anschließend mit Pyridiniumacetylsulfat sulfatiert. Ein anderer Teil des Boc-geschützten Hexapeptides wird von der Boc-Schutzgruppe befreit, acyliert und anschließend mit Pyridiniumacetylsulfat sulfatiert.

Die endgültige Reinigung erfolgt durch RP-18-Mitteldruckchromatographie isokratisch an 25 % Acetonitril/0,05 N Ammoniumacetatlösung pH 6,5.

Überraschenderweise ruft der Einbau der Aminosäure Glutaminsäure eine erhöhte Rezeptorbindung hervor. Die in natürlichen CCK nicht vorhandene Glutaminsäure bewirkt dadurch eine erhöhte antagonistische Aktivität. Dabei zeigen die neuen Verbindungen bis zu einer Konzentration von 10"⁵ Mol keine kontrahierende Eigenwirkung. Am isolierten Meerschweinchenileum antagonisieren Suc-Tyr(SE)-Nle-Gly-Trp-Met-Glu-PEA und Boc-Tyr(SE)-Nle-Gly-Trp-Met-Glu-PEA die kontraktionsauslösende Wirkung von CCK-8 kompetetiv

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

1. Suc-Tyr(SE)-Nle-Gly-Trp-Met-Glu-PEA

Boc-Trp-Met-OH wird mit H-GIu-PEA zum Boc-Trp-Met-Glu-PEA umgesetzt. Nach Abspalten der Boc-Schutzgruppe wird das Tripeptid H-Trp-Met-Glu-PEA mit Boc-Tyr-Nle-Gly-OH mittels TBTU zum Hexapeptid verlängert. Erneutes Abspalten der Boc-Schutzgruppe und Acylierung mit Bernsteinsäureanhydrid führen zum Suc-Tyr-Nle-Gly-Trp-Met-Glu-PEA. Sulfatierung mit Pyridiniumacetylsulfat und Reinigung mittels präparativer HPLC 0,05 η Ammoniumacetat/25 % Acetonitril pH 6,5 liefern Suc-Tyr(SE)-Nle-Gly-Trp-Met-Glu-PEA

Schm.-Bereich: 180-205 °C

HPLC: Säule Vydac RP 18 15-20 μη% 4,6 mm i.D. χ 250 mm A 2 000 ml 0,025 M NH₄Ac pH 6,0 + 700 ml Methanol B = Methanol

Fließgeschw. 2 ml/min, Gradient 10 % B - 50 % B in 80 min R_T = 32,9 min

2. Boc-Tyr(SE)-Nle-Gly-Trp-Met-Glu-PEA

Fp 250-253 ⁰C

HPLC: Laufmittel u. Säule wie Bsp. 1, Gradient 35 % B - 60 % B in 50 min R_T = 14,1

Beispiel 2

Am isolierten Meerschweinchenileum antagonisieren Suc-Tyr(SE)Nle-Gly-Trp-Met-Glu-PEAd) und Boc-Tyr(SE)-Nle-Gly-Trp-Met-Glu-PEA(2) die kontraktionsauslösende Wirkung von CCK-8 kompetitiv. Die Substanzen zeigten bis zu einer Konzentration von 10⁵ Mol keine kontrahierende Eigenwirkung. Die pA₂-Wertefür 1 betragen 7,54 + 0,27 (n = 6) und für 2 8,06 ± 0,43 (n = 7).

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung neuer Cholecystokininhexapeptide der allgemeinen Formel I,

Acyl-Tyr(SE)-X-Gly-Trp-Y-GluNH-CH₂-CH₂-C₆H₅ I

in der Acyl einen Aminosäurerest A oder einen Carbonsäurerest oder eine Schutzgruppe darstellt, SE für einen Sulfatesterrest am Tyrosin, X für einen Aminosäurerest B und Y für Met, Nie oder Leu stehen, dadurch gekennzeichnet, daß vom ß-Phenethylamin (PEA) das Derivat Boc-Trp-Y-GluPEA hergestellt, von der N-Schutzgruppe befreit, mit Boc-Tyr-X-Gly-ONB zu den Hexapeptiden Boc-Tyr-x-Giy-Trp-Y-GiuPEA umgesetzt, die von der Schutzgruppe befreit, dann acyliertund anschließend sulfatiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest A vorzugsweise aus Asparaginsäure, der Carbonsäurerest vorzugsweise aus Bernsteinsäure, die Schutzgruppe z. B. aust-Butyloxycarbonyl (BOC) oder Benzyloxycarbonyl (Z) bestehen und der Aminosäurerest B vorzugsweise Thr, Nie, Leu oder Met bedeutet.

3. Verfahren nach Anspruch Ί und 2, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel I L-Trp durch D-Trp ersetzt werden kann.

4. Neue Cholecystokininhexapeptide der allgemeinen Formel I,