DD277276A1 - Verfahren zur herstellung neuer cholecystokinindialkylamide - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Antagonisten des Cholecystokinins der Formel I AcylTyr(SE)XGlyTrpYNR1R2 Iin der Acyl z. B. Asparaginsaeure, Bernsteinsaeure oder eine Schutzgruppe, wie Boc oder Z sein kann, SE einen Sulfatesterrest bedeutet, X fuer Thr, Nle, Leu oder Met und Y fuer Met, Nle, Leu, Met-Asp, Nle-Asp oder Leu-Asp stehen. L-Trp in Formel I kann durch D-Trp ersetzt sein. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Forschung und die pharmazeutische Industrie.

Description

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, neuartige Antagonisten des Cholecystokinins auf Peptidbasis herzustellen, die eine hohe antagonistische Aktivität besitzen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zu entwickeln, nach denen sich neuartige Sequenzen des Cholecystokinins (CCK) mit antagonistischen Eigenschaften herstellen lassen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß C-terminal verkürzte Sequenzen synthetisiert wurden, denen die C-terminalen Aminosäuren Phenylalanin oder Phenylalanin und Asparaginsäure fehlen. Die endständige Aminosäure Y wurde in das entsprechende Dialkylamid umgewandelt. Die so erhaltenen verkürzten CCK-Sequenzen zeigen überraschenderweise keinerlei agonistische Eigenschaften mehr, sind jedoch in der Lage, Cholecystokinin in Konzentrationen von 10~⁷ bis ICT⁸ Mol/l zu hemmen. Die neuartigen Verbindungen wurden peptidchemisch in üblicher Weise entweder stufenweise oder durch Fragmentkondensation unter Verwendung bekannter Schutzgruppen, beginnend vom Boc-Y-dialkylamid aufgebaut. Anschließend wird das geschützte Peptid von den Schutzgruppen befreit, acyliert und danach mit Pyridiniumacetylsulfat sulfatiert. Die Endreinigung erfolgt durch preparative HPLC an RP-18 isokratisch mit 25% Acetonitril/0,05n Ammoniumacetatlösung pH6,5

Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1 Suc-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-N(C₄H₉)₂

Boc-Trp-Met-OH wird mit H-ASp(OBu¹I-N(C₄H₉J₂ zum Boc-Trp-Met-Asp(OBu')-N(C₄H9)2 umgesetzt. Nach Abspaltung der Boc- und der Esterschutzgruppe wird das Tripeptid H-Trp-Met-Asp-N(C₄H₉)₂ mit Boc-Tyr-Met-Gly-ONB zum Hexapeptid verlängert. Nach Abspaltung der Schutzgruppe und nachfolgender Acylierung mit Bernsteinsäureanhydrid erhält man in Ausbeuten von 83% Suc-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-N(C₄H₉)₂

Fp. 130-14O⁰C. (unter Erweichen)

HPLC: Säule 2,1 χ 100mm ΟΟ5-ΗγρβΓ8ΪΙ5μιη

0,01 mol Ammoniumacetat/CHäCN 28% pH4,3

R₁ = 8,5 min einheitlich

Beispiel 2 Suc-Tyr(SE)-Met-Gly-Trp.Met-Asp-N(C₄H₉)j

1 kg vorstehender Verbindung wird mit 1 g Pyridiniumacetylsulfat 24h bei Raumtemperatur sulfatiert. Nach üblicher Aufarbeitung erfolgt die Reinigung an Vydac^RC1s 20 χ 250mm (0,05n Ammoniumacetat/25% CH₃CN) Ausbeute: 217mg

Fp. 212-235°C. unscharf unter Erweichen

HPLC: SäuleODS-Hypersil5Mm2,1 χ 100mm

0,01 m H₃PO₄/Acetonitril 28->42% (10min) pH2,2

R, = 2,3 min einheitlich

0,01 mol Ammoniumacetat/CH₃CN 28% pH4,3

R_t = 4,2 min einheitlich

Beispiel 3

Am isolierten Meerschweinchen ileum antagonisiert Suc-Tyr(SE)-Met-Gly-Trp-IVIet-Asp-N(C₄H₉)2 die kontraktionsauslösende Wirkung von CCK-8 kompetitiv. Bis zu einer Konzentration von 10~^s Mol/l zeigte die Substanz keinerlei kontrahierende Eigenwirkung. Der pA₂-Wert für 2 liegt bei 7.12 + 0,211 (n = 6)

1. Verfahren zur Herstellung neuer Cholecystokininsequenzen der allgemeinen Formel I

ACyI-TYr(SE)-X-GIy-TrP-Y-NR₁R₂ ,

in der Acyl einen Aminosäurerest A oder einen Carbonsäurerest oder eine Schutzgruppe darstellt | SE für einen Sulfatesterrest am Tyrosin, X für einen Aminosäurerest B und Y für einen oder mehrere ι Aminosäurereste C stehen und R₁, R₂ Alkylreste zwischen C₄ und C₇ darstellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I stufenweise oder durch Fragmentkondensation ι aufgebaut und nach der Abspaltung der Schutzgruppen acyliert und sulfatiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese unter Verwendung üblichen Schutzgruppen und beginnend von BoC-Y-NR₁R₂ erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest A vorzugsweise aus Asparaginsäure, der Carbonsäurerest vorzugsweise aus Bersteinsäure, die Schutzgruppen z. B. aus t-Butyloxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (2) bestehen, der Aminosäurerest B vorzugsweise für Thr, Nie, Leu, oder Met und C für Met, Nie, Leu, Met-Asp, Nle-Asp oder Leu-Asp stehen.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel 11 L-Trp durch D-Trp ersetzt werden kann.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellu ng von neuartigen acylierten Cholecystokininsequenzen der allgemeinen Formt

AeVl-TVr(SS)-X-GIy-TrC-Y-Ii

in der Acyl einen Aminosäurerest, vorzugsweise Asparaginsäure oder einen Carbonsäurerest, vorzugsweise Bersteinsäure odei eine in der Peptidchemie gebräuchliche Schutzgruppe wie t-Butyloxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) darstellt und Si einen Sulfatrest am Tyrosin bedeutet. X steht für einen Aminosäurerest, vorzugsweise Thr, Nie, Leu oder Met und YfOr Met, Nie: Leu, Met-Asp oder Nle-Asp oder Leu-Asp. Zur besseren enzymatischen Stabilität kann L-Trp durch D-Trp ersetzt werden. R, ui R₂ stehen für Alkylgruppen C₄ bis C₇. Derartige Peptide stellen neuartige, hochwirksame Antagonisten des Cholecystokinins dl und sind wertvolle Hilfsmittel für pharmakologische Untersuchungen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinisch Forschung und die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das gastrointestinale Peptidhormon Cholecystokinin (CCK) existiert in verschiedenen molekularen Formen, unter anderem a CCK-39, CCK-33, CCK-12 und CCK-8 (v. Mutt und E. Jorpes, Biochem. Journal 125,57 1971).

Es zeigt eine Reihe wichtiger Effekte im Gastrointestinal-, Pankreas- und hepatobilären System. So stimuliert es die Gallenblasenkontraktion und bewirkt die Relaxation des Sphincter oddi (Übersichten siehe J.E. Morley, Life Sei. 30,479,1982 und Nieber, K.; Henklein, P.; Ott, T. und P.Oehme Z. gesamte inn. Med. 42 [1987) 501).

Nach dem Auffinden von CCK im ZNS wurden weitere Effekte entdeckt. So spielt CCK unter anderem eine Rolle bei der Appetitsregulation, Analgesie, Ptosis oder Katalepsie.

Zur pharmakologischen Untersuchung all dieser Effekte sind Antagonisten wichtige Hilfsmittel. Die gegenwärtig bekannten Antagonisten des Cholecystokinins sind Derivate der Glutaminsäure - Proglumid- (A. L. Rovati, Minerva Medica 1967,58,365¹ Macovecetal.,Eur.J.Med. Chem.-chim.Ther.21 (1986]9),desTryptophans-Senzotript-(Hahne,W.F.; Jensen,T.; LempG.

und J. D. Gardner 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. 78 [1987) 6304) bzw. verkürzte oder cyclische Sequenzen des Cholecystokinins (Spanarkel et al., J. Biol. Chem. 258,6746 [1983]; M. Ch. Galas Am. J. Physiol. 254,8176 [ 1988] sowie R. M. Freidinger et al., P 19th. Europ. Peptid Symp. 1986 Porto Carras Griechenland, EP-PS 0132919).

Neuerdings fand man daß 3-substituierte Benzodiazepine ebenfalls peripher eine hohe antagonistische Aktivität besitzen (Chi

R. U. Science 230 [1985] 177). Variationen der Substituenten führten zur weiteren Wirkungsverstärkung (Evans, B.E., Proc. N Acad. Sei. USA 83, [1986] 4918; US-PS 4554272, US-PS 4563451, US-PS 4559338, EP-PS 166353, EP-PS 166354, EP-PS 1679 EP-PS 170024).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, neuartige Antagonisten des Cholecystokinins auf Peptidbasis herzustellen, die eine hohe antagonistische Aktivität besitzen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde. Verfahren zu entwickeln, nach denen sich neuartige Sequenzen des Cholecystokinins (CCK) mit antagonistischen Eigenschaften herstellen lassen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß C-terminal verkürzte Sequenzen synthetisiert wurden, denen die C-terminalen Aminosäuren Phenylalanin oder Phenylalanin und Asparaginsäure fehlen. Die endständige Aminosäure Y wurde in das entsprechende Dialkylamid umgewandelt. Die so erhaltenen verkürzten CCK-Sequenzen zeigen überraschenderweise keinerlei agonistische Eigenschaften mehr, sind jedoch in der Lage, Cholecvstokinin in Konzentrationen von 10"' bis 10"⁸ Mol/l zu hemmen. Die neuartigen Verbindungen wurden peptidchemisch in üblicher Weise entweder stufenweise oder durch Fragmentkondensation unter Verwendung bekannter Schutzgruppen, beginnend vom Boc-Y-dialkylamid aufgebaut. Anschließend wird das geschützte Peptid von den Schutzgruppen befreit, acyliert und danach mit Pyridiniumacetylsulfat sulfatiert. Die Endreinigung erfolgt durch präparative HPLC an RP-18 isokratisch mit 25% Acetonitril/0,05n Ammoniumacetatlösung pH 6,5

Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1 Suc-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-NICiHsh

Boc-Trp-Met-OH wird mit H-Asp(0Bu')-N(C4H₉)₂zum Boc-Trp-Met-Asp(OBu')-N(C₄H₉I₂ umgesetzt. Nach Abspaltung der Boc- und der Esterschutzgruppe wird das Tripeptid H-Trp-Met-Asp-NICjHg^ mit Boc-Tyr-Met-Gly-ONB zum Hexapeptid verlängert. Nach Abspaltung der Schutzgruppe und nachfolgender Acylierung mit Bernsteinsäureanhydrid erhält man in Ausbeuten von 83% Suc-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-N(C₄H₉)₂

Fp. 130-140⁰C. (unter Erweichen)

HPLC: Säule 2,1 χ 100mm ODS-Hypersil 5pm

0,01 mol Ammoniumacetat/CH₃CN 28% pH 4,3

R₁ = 8,5min einheitlich

Beispiel 2 Suc-Tyr(SE)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-N(C₄H9)₂

1kg vorstehender Verbindung wird mit 1g Pyridiniumacetylsulfat 24 h bei Raumtemperatur sulfatiert. Nach üblicher Aufarbeitung erfolgt die Reinigung an Vydac^RC'¹⁸ 20 χ 250 mm (0,05n Ammoniumacetat/25% CH₃CN) Ausbeute: 217mg

Fp. 212-235T. unscharf unter Erweichen

HPLC: Säule ODSHypersil 5pm 2,1 χ 100mm

0,01 m H₃PO₄/Acetonitril 28^42% (10min) pH2,2

R₁ = 2,3min einheitlich

0,01 mol Ammoniumacetat/CH₃CN 28% pH 4,3

R, = 4,2mir, einheitlich

Beispiel 3

Am isolierten Meerschweinchen ileum antagonisiert Suc-TydSEl-Met-Gly-Trp-Met-Asp-NiCjHg^ die kontraktionsauslösende Wirkung von CCK-8 kompetitiv. Bis zu einer Konzentration von 10"⁵ Mol/l zeigte die Substanz keinerlei kontrahierende Eigsnwirkung. Der pA₂-Wert für 2 liegt bei 7.12 ± 0.211 (n = 6)

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung neuer Cholecystokininsequenzen der allgemeinen Formel I

ACyI-TYr(SE)-X-GIy-TrP-Y-NR₁R₂ ,

in der Acyl einen Aminosäurerest A oder einen Carbonsäurerest oder eine Schutzgruppe darstellt, SE für einen Sulfatesterrest am Tyrosin, X für einen Aminosäurerest B und Yfür einen oder mehrere Aminosäurereste C stehen und R₁, R₂ Alkylreste zwischen C₄ und C₇ darstellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I stufenweise oder durch Fragmentkondensation aufgebaut und nach der Abspaltung der Schutzgruppen acyliert und sulfatiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese unter Verwendung üblicher Schutzgruppen und beginnend von BoC-Y-NR₁R₂ erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest A vorzugsweise aus Asparaginsäure, der Carbonsäurerest vorzugsweise aus Bersteinsäure, die Schutzgruppen z. B. aus t-Butyloxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) bestehen, der Aminosäurerest B vorzugsweise für Thr, Nie, Leu, oder Met und C für Met, Nie, Leu, Met-Asp, Nle-Asp oder Leu-Asp stehen.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel I L-Trp durch D-Trp ersetzt werden kann.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuartigen acylierten Cholecystokininsequenzen der allgemeinen Formel

Aeyl-Tyr(SE)-X-Gly-TrD-Y-Ti ' ,

^NR >

in der Acyl einen Aminosäurerest, vorzugsweise Asparaginsäure oder einen Carbonsäurerest, vorzugsweise Bersteinsäure oder eine in der Peptidchemie gebräuchliche Schutzgruppe wie t-Butyloxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) darstellt und SE einen Sulfatrest am Tyrosin bedeutet. X steht für einen Aminosäurerest, vorzugsweise Thr, Nie, Leu oder Met und Yfür Met, Nie, Leu, Met-Asp oder Nle-Asp oder Leu-Asp. Zur besseren enzymatischen Stabilität kann L-Trp durch D-Trp ersetzt werden. Ri und R₂ stehen für Alkylgruppen C₄ bis C₇. Derartige Peptide stellen neuartige, hochwirksame Antagonisten des Cholecystokinins dar und sind wertvolle Hilfsmittel für pharmakologische Untersuchungen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Forschung und die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das gastrointestinale Peptidhormon Cholecystokinin (CCK) existiert in verschiedenen molekularen Formen, unter anderem als CCK-39, CCK-33, CCK-12 und CCK-8 (v. Mutt und E. Jorpes, Biochem. Journal 125,57 1971).

Es zeigt eine Reihe wichtiger Effekte im Gastrointestinal-, Pankreas- und hepatobilären System. So stimuliert es die Gallenblasenkontraktion und bewirkt die Relaxation des Sphincter oddi (Übersichten siehe J.E. Morley, Life Sei. 30,479,1982 und Nieber, K.; Henklein, P.; Ott, T. und P.Oehme Z. gesamte inn. Med. 42 [1987] 501).

Nach dem Auffinden von CCK im ZNS wurden weitere Effekte entdeckt. So spielt CCK unter anderem eine Rolle bei der Appetitsregulation, Analgesie,.Ptosis oder Katalepsie.

Zur pharmakologischen Untersuchung all dieser Effekte sind Antagonisten wichtige Hilfsmittel. Die gegenwärtig bekannten Antagonisten des Cholecystokinins sind Derivate der Glutaminsäure- Proglumid - (A. L. Rovati, Minerva Medica 1967,58,3651; Macovec et al., Eur. J. Med. Chem.-chim. Ther. 21 [198619), des Tryptophans-Senzotript-(Hahne, W. F.; Jensen, T.; Lemp G. F.

und J.D.Gardner 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. 78 [1987] 6304) bzw. verkürzte oder cyclische Sequenzen des Cholecystokinins (Spanarkel et al., J. Biol. Chem. 258,6746 (1983); M. Ch. Galas Am. J. Physiol. 254,8176 [1988] sowie R. M. Freidinger et al., Proc.

19th. Europ. Peptid Symp. 1986 Porto Carras Griechenland, EP-PS 0132919).

Neuerdings fand man daß 3-substituierte Benzodiazepine ebenfalls peripher eine hohe antagonistische Aktivität besitzen (Chang

R. U. Science 230 (1985) 177). Variationen der Substituenten führten zur weiteren Wirkungsverstärkung (Evans, B. E., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 83, [1986] 4918; US-PS 4554272, US-PS 4563451, US-PS 4559338, EP-PS 166353, EP'PS 166354, EP-PS 167920, EP-PS 170024).