DD276483B5

DD276483B5 - Verfahren zur Herstellung neuer Cholecystokininpentapeptide

Info

Publication number: DD276483B5
Application number: DD32106888A
Authority: DD
Inventors: Peter Dipl-Chem Dr Re Henklein; Monika Dipl-Chem Boomgarden; Rudolf Dr Sc Med Morgenstern; Tilmann Prof Dr Sc Med Ott; Heike Ronneberger
Original assignee: Charite Med Fakultaet
Priority date: 1988-10-25
Filing date: 1988-10-25
Publication date: 1996-08-08
Also published as: DD276483A1

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuartigen acylierten Cholecystokininsequenzen der allgemeinen Formel I

ACyI-TYr(SE)-X-GIy-TrP-Y-NH-CH₂-CH₂CH₆H₆ ,

in der Acyl einen Aminosäurerest, vorzugsweise Asparaginsäure, oder einen Carbonsäurerest, vorzugsweise Bernsteinsäure, oder eine in der Peptidchernie gebräuchliche Schutzgruppe, vorzugsweise Butyloxycarbonyl (BOC) und Benzyloxycarbonyl (Z) darstellt und SE für einen Sulfatesterrest am Tyrosin steht. X steht für einen Aminosäurerest, vorzugsweise Thr, Nie, Leu oder Methionin und Y für Methionin, Norleucin oder Leucin. Zur besseren enzymatischen Stabilität kann anstelle von Trp auch D-Trp rein verwandt werden.

Derartige Peptide stellen neuartige wichtige Antagonisten des Cholecystokinins dar und sind wertvolle Hilfsmittel für pharmakologische Untersuchungen. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die medizinische Forschung und die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das gastrointestinale Peptidhormon Cholecystokinin (CCK) existiert in verschiedenen molekularen Formen, unter anderem als CCK-39, CCK-33, CCK-12 und CCK-8 (v. Mutt und E. Jorpes, Biochem. Journal 125,57 1971).

Es zeigt eine Reihe wichtiger Effekte im Gastrointestinal-,, Pankreas- und hepatobilären System. So stimuliert es die Gallenblasenkontraktion und bewirkt die Relaxation des Sphincter oddi (Übersichten siehe J.E. Morley, Life Sei. 30,479,1982 und Nieber, K.; Henklein, P.; Ott, T. und P.Oehme Z. gesamte inn. Med. 42 [1987] 501).

Nach dem Auffinden von CCK im ZNS wurden weitere Effekte entdeckt. So spielt CCK unter anderem eine Rolle bei der Appetitsregulation, Analgesie, Ptosie oder Katalepsie. Zur pharmakologischen Untersuchung all dieser Effekte sind Antagonisten wichtige Hilfsmittel. Die gegenwärtig bekannten Antagonisten des Cholecystokinins sind Derivate der Glutaminsäure - Proglumid - (A. L Rovati, Minerva Medica 1967, 58,3651; Macovec et al., Eur. J. Med. Chem.-chim. Ther. 21 [1986] 9), des Tryptophane -Benzotript- (Hahne, W. F. Jensen, T; Lemp G. F. und J.D.Gardner 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. 78 [1987] 6304) bzw. verkürzte oder cyclische Sequenzen des Cholecystokinins (Spanarkel et al., J. Biol. Chem. 258, 6746 [1983];

M. Ch. Galas Am. J. Physiol. 254, G176 [1988] sowie R. M. Freidinger et al., Proc. 19th. Europ. Peptid Symp. 1986 Porto Carras Griechenland, EP-PS 0132919).

Neuerdings fand man, daß 3-substituierte Benzodiazepine ebenfalls peripher eine hohe antagonistische Aktivität besitzen (Chang

R. U. Science 230 [1985] 177). Variationen der Substituenten führten zur weiteren Wirkungsverstärkung (Evans, B. E., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA83, [1986] 4918; US-PS 4554272, US-PS 4563451, US-PS 4559338, EP-PS 166353, EP-PS 166354, EP-PS 167920, EP-PS 170024).

Kürzlich wurden auf der Basis von verkürzten Sequenzen neue wirksame Antagonisten entwickelt (DD 272 652 und

DD 272 653). Alle bisher gefundenen Antagonisten auf Peptidbasis wiesen eine noch zu geringe antagonistische Aktivität

auf (ICso-Werte 10""⁶ bis 10"⁷ Mol).

Derivate des Benzodiazepins wirken nur peripher.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, neuartige Antagonisten des Cholecystokinins auf Peptidbasis herzustellen, die eine höhere antagonistische Aktivität besitzen als die vergleichbaren bekannten Antagonisten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zu entwickeln, nach dem sich neuartige Sequenzen des Cholecystokinins (CCK) mit antagonistischen Eigenschaften herstellen lassen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß C-terminal verkürzte Sequenzen synthetisiert wurden, denen die beiden C-terminalen Aminosäuren Asparaginsäure und Phenylalanin fehlen. Die Aminosäure Y, die jetzt als C-terminale Aminosäure steht, wurde in das ß-Phenethylamid (PEA) umgewandelt. Die dadurch erhaltenen verkürzten CCK-Sequenzen zeigen überraschenderweise keinerlei CCK-Eigenschaften mehr, sind aber in der Lage, CCK in Konzentrationen von 10~⁸ bis 10~⁹ Mol/l zu hemmen. Die Verbindungen wurden peptidchemisch in üblicher Weise unter Verwendung bekannter Schutzgruppen hergestellt. Zu diesem Zweck wurde Boc-Trp-X-ß-phenethylamid hergestellt, von der N-Schutzgruppe mit 2 N HCL/Eisessig befreit und mit Boc-Tyr-X-Gly-ONB zum Pentapeptid umgesetzt. Das Pentapeptid Boc-Tyr-X-Gly-Trp-Y-PEA wird von der Boc-Schutzgruppe befreit, acyliert und anschließend mit Pyridiniumacetylsulfat sulfatiert. Die endgültige Reinigung erfolgt durch RP-18-Mitteldruckchromatographie isokratisch an 28% Acetonitril/0,05N Ammoniumacetatlösung pH 6,5. Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

Suc-Tyr(SE)-Met-Gly-Trp-Met-NH-CH₂-CH₂C₆H₅

Boc-Trp-Met-PEA

Das Dipeptid wurde durch Umsetzung von Boc-Trp-ONB mit H-MeI-NH-CH₂-CH₂C₆H₅ gewonnen.

Fp. 161-163 DC:CHCI₃/MeOH 9:1, R_F = 0,72

[a]2o° = _14₍37 с = 1

SUC-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-PEA

5 mMol Boc-Tyr-Met-Gly-ONB (hergestellt nach Henklein et al Z. Pharmazie 42,414 [1987]) werden mit 5 m Mol H-Trp-Met-PEA in 30ml DHF umgesetzt. Das Lösungsmittel wird auf ¹A des Volumens eingeengt und das verbleibende Öl in 10% KHSO₄ eingerührt.

Der Niederschlag wird getrocknet und von der Schutzgruppe durch Behandeln mit 10 ml 2 η HCI/Eisessig unter Zusatz von 0,5 ml Mercaptoethanol entfernt.

Das rohe Hydrochlorid wird wie üblich mit Bernsteinsäureanhydrid in Pyridin/DMF acyliert.

Die Lösung wird eingeengt, mit 0,1 η HcI verrieben.

Der resultierende Rückstand wird abgesaugt und mit Wasser gewaschen.

SUC-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-PEA MG = 1016

Fp. 144-50 (Zers.), R_F EssigesterSchwyzer Grundlösung (Pyr:HOAc:H₂O = 20:6:11) = 70:30 Suc-Tyr(SE)-Met-Gly-Trp-Met-PEA

MG 1097 Fp. 144-52X (unter Erweichen)

HPLC: Säule ODS Hypersil 5μιη 2,1 x 100mm

Laufmittel A: 0,01 H₃PO₄ pH 2,2/CH₃CN

Gradient 28-42% CH₃CN

FlußO,7ml; R_T = 1,18min Laufmittel B: 0,01 m Ammoniumacetat pH 4,13/25% CH₃CN; R₁ = 4,13 min.

Beispiel 2

Am isolierten Meerschweinchenileum antagonisiert SUC-Tyr-(SE)-Met-Gly-Trp-Met-NH-CH₂-CH₂-C_eH5 die kontraktionsauslösende Wirkung von CCK-8 kompetitiv. Die Substanz zeigte bis zu einer Konzentration von 10~⁵ Mol keine kontrahierende Eigenwirkung. Der pA₂-Wertfür SUC-Tyr(SE)-Met-Gly-Trp-Met-NH-CH₂-CH₂-C₆H₅ beträgt 8,04 ± 0,19 (n = 6).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung neuer Cholecystokininpentapeptide der allgemeinen Formel I,

ACyI-TYr(SE)-X-GIy-TrP-Y-NH-CH₂-CH₂-C₆H₅ I,

in der Acyl einen Aminosäurerest A oder einen Carbonsäurerest oder eine Schutzgruppe darstellt, SE für einen Sulfatesterrest am Tyrosin, X für einen Aminosäurerest B und Y für Met, Nie oder Leu stehen, dadurch gekennzeichnet, daß vom ß-Phenethylamid (PEA) die Derivate Boc-Trp-X-PEA hergestellt, von der N-Schutzgruppe befreit, mit Boc-Tyr-X-Gly-ONB zu den Pentapeptiden Boc-Tyr-X-Gly-Trp-Y-PEA umgesetzt, die von der Schutzgruppe befreit, dann acyliert und anschließend sulfatiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest A vorzugsweise aus Asparaginsäure, der Carbonsäurerest vorzugsweise aus Bernsteinsäure, die Schutzgruppe z. B. aus t-Butyloxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) bestehen und der Aminosäurerest B vorzugsweise Thr, Nie, Leu oder Met bedeutet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel I L-Trp durch D-Trp ersetzt werden kann.