DE69735583T2

DE69735583T2 - Semisynthetisches verfahren zur herstellung von didemninanalogen

Info

Publication number: DE69735583T2
Application number: DE69735583T
Authority: DE
Inventors: L. Kenneth Urbana RINEHART; J. Alexandra Urbana SANBORN
Original assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Current assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Priority date: 1996-10-24
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2017-10-25
Also published as: JP2001503746A; EP0973518B1; ES2262175T3; EP0973518A4; DE69735583D1; AU731757B2; AU4916597A; EP0973518A1; WO1998017275A1; CA2269881A1; US20020037835A1; ATE321773T1; US6841530B2

Description

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Synthesen verschiedener Didemninderivate, einschließlich Didemnin M (1) ebenso wie Pyroglutaminyldidemnin B (2), wurden durchgeführt. Didemnin M, eines der aktivsten der Didemnine, enthält Pyroglutamat-, Glutamin-, Lactyl- und Prolingruppen in seiner Seitenkette, während Pyroglutaminyldidemnin B nur eine Pyroglutaminyleinheit zusätzlich zu den Lactyl- und Prolylresten enthält. Glutaminylderivate (3–5) wurden in dem Verfahren der Herstellung von Didemnin M ebenfalls synthetisiert. Struktur-Aktivitäts-Beziehungen der Didemnine werden in J. Med. Chem. 39 (14), 5. Juli 1996, 2819 diskutiert.
Die retrosynthetischen Trennungen, welche die Basis eines Plans für die Herstellung der Seitenkette von Didemnin M bildeten, sind in Gleichung 1 gezeigt. Trennung der Esterfunktion zwischen Milchsäure und L-Glutamin würde zwei Einheiten ergeben: ein Dipeptid, Einheit 7, bestehend aus Pyroglutamat und Glutamin; und Einheit 8, bestehend aus Milchsäure und Prolin.
GLEICHUNG 1
Ein gemischtes Anhydrid aus L-Pyroglutaminsäure 9 und Pivaloylchlorid wurde mit L-Glutamin-t-butylester 10 gekuppelt, nachfolgend sauer aufgearbeitet, wobei sich L-Pyroglutamyl-L-glutamin 7 ergab (Gleichung 2). Dieses Dipeptid wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradientensystems von Acetonitril/H₂O gereinigt.
GLEICHUNG 2
Die Synthese von Verbindung 8 begann mit dem Schutz von (S)-Ethyllactat, 11, als dem Benzyloxyderivat 12. Hydrolyse stellte die Säure 13 bereit, welche mit L-Prolinphenacylester gekuppelt wurde, wobei Verbindung 14 geliefert wurde. Behandlung mit einer Lösung von Zink in Essigsäure lieferte 8 (Schema I).
SCHEMA I
Didemnin M wurde durch ein drei-Schritt-Schema synthetisiert, was eine Kupplungsreaktion von O-Benzyllactylprolin, 8, mit Didemnin A, wobei sich das geschützte Derivat 15 ergibt, gefolgt von Hydrierung, wobei sich Didemnin B ergibt, beinhaltete. Der finale Schritt beinhaltete Kupplung der Pyroglutaminylglutamineinheit, 7, mit Didemnin B. Dieser wurde unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken ausgeführt, wobei die wirksamste die Methode mit gemischtem Anhydrid war (Schema II). Die Reinigung wurde unter Verwendung von HPLC mit einem Acetonitril/H₂O-Gradientensystem durchgeführt.
SCHEMA II
Eine zweite Herangehensweise in Richtung auf die Synthese von Didemnin M beinhaltete das Schützen von L-Glutamin, 16, als dem Benzyloxycarbonylderivat, 17, nachfolgend Kuppeln mit Didemnin B unter Verwendung von DCC. Während dieser Kupplungsprozedur wurden zwei Glutaminylderivate erzeugt, 18, das einen Glutaminylrest an nur dem Lactylrest trug, während das zweite, 19, zwei Glutaminylreste enthielt, einen an der Lactyleinheit und den zweiten an der Isostatineinheit. Diese Derivate wurden über Umkehrphasen-HPLC getrennt, dann hydriert, wobei die entschützten Verbindungen 3 und 4 bereitgestellt wurden (Schema III).
SCHEMA III
Ein andersartiger Versuch bei der Entschützung des Benzyloxycarbonylderivats 18 stellte noch ein anderes Glutaminyldidemninanaloges bereit. Dieses Analoge wurde bei Behandlung von 18 mit Bromwasserstoff in Essigsäure erzeugt. Es scheint, als ob eine Acetyleinheit zu dem Isostatinrest hinzugefügt wurde, um Verbindung 5 bereitzustellen (Gleichung 3). Diese zwei Verbindungen scheinen leicht durch Umkehrphasen-HPLC trennbar zu sein. Diese Entschützungstechnik erwies sich auch als mit dem Dibenzyloxycarbonylglutaminylderivat von Didemnin B, 19, verwendbar.
GLEICHUNG 3
Pyroglutaminsäure wurde als das Benzyloxycarbonylderivat (20) geschützt, welches dann mit Glutaminyldidemnin B (3) unter Verwendung von DCC gekuppelt wurde, um die geschützte Form von Didemnin M (21) bereitzustellen. Entschützung über Hydrierung lieferte Didemnin M (1) (Schema IV). Reinigung über Umkehrphasen-HPLC stellte die gewünschte Verbindung bereit.
SCHEMA IV
Ein anderes interessierendes Analoges von Didemnin ist Pyroglutaminyldidemnin B (2). Die Synthese von 2 wurde durch Kuppeln von 20 mit Didemnin B unter Verwendung von EDC bewerkstelligt, wobei Cbz-Pyroglutaminyldidemnin B 22 bereitgestellt wurde. Die Entfernung der schützenden Gruppe wurde unter Verwendung von Hydrierung in Anwesenheit eines Palladiumkatalysators bewerkstelligt, wobei 2 geliefert wurde. Die Reinigung über Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Acetonitril/Wasser-Gradientensystems stellte die reine Verbindung bereit (Gleichung 4).
GLEICHUNG 4
Dehydrodidemnin B wurde synthetisiert, indem zuerst Boc-L-Prolin (23) mit Didemnin A unter Verwendung von EDC als dem Kupplungsmittel gekuppelt wurde. Die Boc-Schutzgruppe wurde bei Behandlung mit Säure entfernt und die resultierende Verbindung (25) wurde mit Brenztraubensäure gekuppelt, wobei Dehydrodidemnin B bereitgestellt wurde (Schema V). Die Verbindung wurde über Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradientensystems von Acetonitril/H₂O gereinigt.
SCHEMA V
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Allgemeine experimentelle Verfahrensweisen. ¹H-NMR-Spektren wurden auf den Spektrometern Varian XL-200, General Electric QE-300, Varian XL-400 und General Electric QN-500 aufgenommen. Chemische Verschiebungen von ¹H sind in CDCl₃ und Methanol-d₄ auf restliches CHCl₃ (7,26 ppm) und CD₂HOD (3,34 ppm) bezogen. Elektronenstoß-(EI)-Massenspektren wurden auf einem Spektrometer Finnigan MAT CH-5 DF aufgezeichnet. Massenspektren mit hoher Auflösung (HRFAB) und Bombardierung mit schnellen Atomen (FAB) wurden auf einem Massenspektrometer VG ZAB-SE aufgezeichnet, das unter Verwendung einer Universalmatrix²⁷ in dem FAB-Modus arbeitete. Mikroanalytische Ergebnisse wurden von dem School of Chemical Sciences Microanalytical Laboratory (Mikroanalytisches Laboratorium der Schule der chemischen Wissenschaften) erhalten. Infrarot-(IR)-Spektren wurden auf einem IR/32-FTIR-Spektrophotometer erhalten. Feste Proben wurden als Chloroformlösungen in Natriumchloridzellen analysiert. Flüssigkeiten oder Öle wurden als reine Filme zwischen Natriumchloridplatten analysiert.
Optische Drehungen (in Grad) wurden mit einem Digitalpolarimeter DIP 360 oder einem DIP 370 mit einer Na-Lampe (589 nm) unter Verwendung einer Zelle von 5 × 0,35 cm (1,0 ml) gemessen. Schmelzpunkte wurden auf einer Kapillarschmelzpunktapparatur bestimmt und sind nicht korrigiert. Normalphasen-Säulenchromatographie wurde unter Verwendung von Merck-Kieselgel-Silicagel (70–230 Mesh) durchgeführt. Fuji-Davison-C18 Gel (100–200 Mesh) wurde für Umkehrphasen-Säulenchromatographie verwendet. Alle Lösungsmittel waren spektral rein. Analytische Dünnschichtchromatographie wurde auf vorbeschichteten Platten (Merck, F-254-Indikator) durchgeführt. Diese Platten wurden durch verschiedenartige Methoden einschließlich Einwirkung von Ninhydrin, Iod und UV-Licht (254 nm) entwickelt. HPLC wurde mit einem Instrument Waters 990 und einer Econosil-C18-Säule (Alltech/Applied Science) und einer Phenomenex-C18-Säule durchgeführt.
THF wurde von Natriumbenzophenonketyl und CH₂Cl₂ von P₂O₅ destilliert. Dimethylformamid (DMF), Triethylamin (Et₃N) und N-Methylmorpholin (NMM) wurden von Calciumhydrid destilliert und über KOH-Plätzchen aufbewahrt. Pyridin wurde von KOH destilliert und über Molekularsieben aufbewahrt. Andere Lösungsmittel, die in den Reaktionen verwendet wurden, waren ohne Reinigung von Reagenzqualität. Di-tert-butyldicarbonat [(Boc)₂O], Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDCI), Dimethylaminopyridin (DMAP), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), L-Glutamin, L-Pyroglutamin und L-Prolin wurden von der Aldrich Chemical Company erhalten. Alle Reaktionen, die wasserfreie Bedingungen erfordern, wurden unter einer Atmosphäre von Stickstoff durchgeführt.
Pyroglutaminylglutamin (7). Pyroglutaminsäure (0,11 g, 0,84 mmol) wurde in DMF (2,09 ml) gelöst und die Lösung wurde auf –20°C abgekühlt. N-Methylmorpholin (0,19 ml) und Pivaloylchlorid (0,10 ml) wurden zu der Lösung hinzugegeben und das Rühren wurde bei –20°C für 5 h fortgesetzt. Zu dieser Zeit wurden eine Lösung von Glutamin-t-butylester (0,20 g, 0,84 mmol) in DMF (0,42 ml) und N-Methylmorpholin (92 ml) tropfenweise hinzugegeben. Das Rühren wurde für 48 h fortgesetzt und die Lösung wurde sich auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen, dann in H₂O gegossen und mit EtOAc extrahiert. Die EtOAc-Schicht wurde mit 1 N HCl und H₂O gewaschen, dann getrocknet (Na₂SO₄), und das Lösungsmittel wurde sorgfältig unterhalb von 40°C entfernt. Ein weißer Feststoff wurde isoliert. Umkristallisation aus Ether/Petrolether stellte 7 als weißes kristallines Material (0,17 g, 79%) bereit; FABMS 258,1 (M + H); HRFABMS, ber. für C₁₀H₁₅N₃O₅ (M + H) 258,1090, gefunden 258,1091.
Ethyl-(S)-O-benzyllactat (12). Zu einer Lösung von Ethyl-(S)-lactat (2,36 g, 20,0 mmol) in THF (7,80 ml) wurde Natriumhydrid (60%ige Dispersion, 0,94 g, 24,0 mmol) portionsweise unter Kühlung hinzugegeben. Benzylbromid (2,60 ml, 22,0 mmol) wurde dann über einen Tropftrichter hinzugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 24 h stehen gelassen. Ethylacetat (70 ml) wurde langsam zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben, nachfolgend Wasser, um das überschüssige Natriumhydrid zu zerstören. Die Lösung wurde dann zur Trockene eingedampft und der ölige Rückstand wurde zwischen Ether (30 ml) und Wasser (60 ml) verteilt. Die Etherschicht wurde mit wässerigem Natriumbicarbonat (5 ml) und Kochsalzlösung gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei sich ein öliger Rückstand ergab, welcher über Nacht kristallisierte. Umkristallisation des Rohprodukts ergab die Verbindung als weißes kristallines Material (3,01 g, 72%); FABMS m/z 209,1 (M + H), 181,2 (M – C₂H₄).
O-Benzylmilchsäure (13). Zu einer kalten Lösung von 12 (0,31 g, 1,49 mmol) in THF (14,9 ml) wurde tropfenweise während 10 min eine kalte 0,2 M Lithiumhydroxidlösung (14,9 ml) hinzugegeben. Das Rühren wurde für 3 h bei Umgebungstemperatur fortgesetzt, dann wurde die Lösung auf die Hälfte ihres Volumens eingeengt und mit Ether (2 × 15 ml) gewaschen. Die vereinigten Etherschichten wurden mit gesättigtem NaHCO₃ (10 ml) extrahiert und die wässerigen Schichten wurden vereinigt und mit 1 N Kaliumhydrogensulfat auf pH 4 angesäuert. Die angesäuerte wässerige Schicht wurde mit Ether (3 × 50 ml) extrahiert und die vereinigten Etherextrakte wurden getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei die entsprechende Säure als Öl bereitgestellt wurde, welches direkt im nächsten Schritt verwendet wurde (0,21 g, 80%); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 1,46 (3 H, d), 4,05 (1 H, q), 4,55 (2 H, dd), 7,31 (5 H, s), 11,36 (1 H, s); FABMS 219,0 (M + K), 203,1 (M + Na), 181,2 (M + H); HRFABMS ber. für C₁₀H₁₂NaO₃ (M + Na) 203,0684, gefunden 203,0686; m/z ber. für C₁₀H₁₃O₃ (M + H) 181,0865, gefunden 181,0864.
Soc-L-Prolinphenacylester. Boc-Prolin (1,00 g, 4,65 mmol) wurde in Ethylacetat (29,4 ml) gelöst, Triethylamin (0,46 g, 0,63 ml) und Phenacylbromid (0,93 g, 4,68 mmol) wurden hinzugegeben und innerhalb einiger Minuten bildete sich ein Niederschlag. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, Wasser und Ether wurden hinzugegeben und die zwei Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit 0,1 N HCl, gesättigtem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen, dann über MgSO₄ getrocknet. Verdampfung des Lösungsmittels stellte die gewünschte Verbindung (1,27 g, 83%) bereit; FABMS 334,2 (M + H), 234,1 (M + 2 H – Boc), 667,3 (2 M + H); HRFABMS ber. für C₁₈H₂₃NO₅ (M + H) 334,1654, gefunden 334,1665.
L-Prolinphenacylester. Boc-L-Prolinphenacylester (0,29 g, 0,87 mmol) wurde in EtOAc (25 ml) gelöst und ein stetiger Strom von HCl wurde für ungefähr 40 min durch die Lösung geleitet, woraufhin die TLC-Analyse zeigte, daß die Entschützung vollständig war. Das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei ein weißes kristallines Material bereitgestellt wurde. Umikristallisation aus Petrolether ergab durchsichtige Kristalle (0,19 g, 94%); FABMS 234,2 (M + H), 467,2 (2 M + H); HRFABMS ber. für C₁₃H₁₆NO₃ (M + H) 234,1130, gefunden 234,1129.
L-O-Benzyllactylprolinphenacylester (14). Prolinphenacylester (0,19 g, 0,83 mmol) in CH₂Cl₂, DMAP (0,10 g, 0,83 mmol) und DCC (0,19 g, 0,96 mmol) wurden bei 0°C zu einer Lösung von 13 (0,15 g, 0,83 mmol) gegeben. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und für 12 h gerührt. Dicyclohexylharnstoff wurde filtriert und mit Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und mit 10%iger Citronensäure, 5%igem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und eingeengt. Der rohe Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt, wobei mit Hexan und Ethylacetat (4:1) eluiert wurde, um das Produkt (0,19 g, 57%) als oranges Öl zu erhalten; FABMS 396,2 (M + H); HRFABMS ber. für C₂₃H₂₆NO₅ (M + H) 396,1811, gefunden 396,1812.
L-O-Benzyllactylprolin (8). Verbindung 14 (0,19 g, 0,48 mmol) wurde mit Zn (0,96 g) in AcOH/H₂O (70:30) behandelt, das Gemisch wurde bei RT über Nacht rühren gelassen, Zn wurde unter Verwendung von Celite abfiltriert und die Lösung wurde zwischen Ether und Wasser verteilt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und über Na₂SO₄ getrocknet, wobei die gewünschte Verbindung (0,11 g, 86%) geliefert wurde; FABMS 278,1 (M + H).
O-Benzyldidemnin B (15). L-O-Benzyllactylprolin (33,0 mg, 0,13 mmol) in DMF (3 ml), DMAP (0,6 mg) und DCC (26,0 mg, 0,13 mmol) wurden bei 0°C zu einer Lösung von Didemnin A (39,7 mg, 0,42 mmol) gegeben. Die Lösung wurde sich auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und für 12 h gerührt, Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und mit Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und mit 10%iger Citronensäure, 5%igem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, und die Extrakte wurden über MgSO₄ getrocknet und eingeengt. Der rohe Rückstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradientensystems von Acetonitril/H₂O gereinigt, wobei die Verbindung als gelbes Pulver (40,5 mg, 80%) bereitgestellt wurde; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), siehe Supplementary Material, S-1; FABMS 1241,2 (M + K), 1226,1 (M + Na), 1203,1 (M + H), siehe Supplementary Material, S-2; HRFABMS ber. für C₆₄H₉₆N₇O₁₅ (M + H) 1202,6964, gefunden 1202,6964.
Didemnin B. Geschütztes Didemnin B (15, 40,5 mg, 33,7 mmol) wurde in Isopropylalkohol (5 ml) gelöst, Katalysator (37,4 mg) Palladium auf Kohlenstoff (10%) wurde hinzugegeben und die Lösung wurde bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck für 3 h hydriert, woraufhin TLC zeigte, daß die Reaktion vollständig war. Der Katalysator wurde über Celite abfiltriert und das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei die gewünschte Verbindung als weißes Pulver bereitgestellt wurde. Umkehrphasen-HPLC (Acetonitril/H₂O-Gradientensystem) enthüllte, daß die Verbindung rein war, siehe Supplementary Material, S-3 (32,1 mg, 86%); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), siehe Supplementary Material, S-4; FABMS 1134,5 (M + Na), 1112,5 (M + H), Supplementary Material, S-5; HRFABMS ber. für C₅₇H₉₀N₇O₁₅ (M + H) 1112,6495, gefunden 1112,6491.
Pyroglutaminylglutaminyldidemnin B [Didemnin M (1)]. Pyroglutaminylglutamnin (3,42 mg, 14,4 μmol) wurde in DMF (36,0 μl) gelöst und die Lösung wurde auf –20°C gekühlt. N-Methylmorpholin (3,27 μl) und Pivaloylchlorid (1,72 μl) wurden zu der Lösung hinzugegeben und das Rühren wurde bei –20°C für 5 h fortgesetzt, woraufhin eine Lösung von Didemnin B (16,0 mg, 14,4 μmol) in CH₂Cl₂ (7,23 μl) und N-Methylmorpholin (1,59 μl) tropfenweise hinzugegeben wurden. Das Rühren wurde für 48 h fortgesetzt, dann wurde die Lösung sich auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und das Gemisch wurde in H₂O gegossen und mit EtOAc extrahiert. Die EtOAc-Schicht wurde mit 1 N HCl und H₂O gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel wurde sorgfältig unterhalb von 40°C entfernt. Umkehrphasen- HPLC unter Verwendung eines Gradientensystems von Acetonitril/H₂O lieferte die gewünschte Verbindung, siehe Supplementary Material, S-6 (8,1 mg, 79%); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), siehe Supplementary Material, S-7; FABMS m/z 1389,5 (M + K), 1374,5 (M + Na), 1351,6 (M + H), siehe Supplementary Material, S-8; HRFABMS m/z ber. für C₆₇H₁₀₃N₁₀O₁₉ (M + H) 1351,7401, gefunden 1351,7406.
N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamin (17). Glutamin (1,84 g, 12,62 mmol) wurde in 1 N NaOH (12,58 ml) gelöst und die Lösung wurde auf 0°C gekühlt und für 30 min gerührt, und dann wurden Na₂CO₃ (3,30 g) und Benzylchlorformiat (4,38 ml) in Dioxan (19,30 ml) allmählich in gleichen Portionen hinzugegeben. Das Rühren wurde bei 0°C für 1 h fortgesetzt, dann wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur rühren gelassen und wurde mit Ethylether (2 × 20 ml) extrahiert. Die wässerige Lösung wurde mit 2 N HCl auf pH 5 angesäuert und mit Ethylacetat (3 × 50 ml) extrahiert, welches über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft wurde, wobei sich ein Öl ergab, welches über Nacht kristallisierte. Umkristallisation des Rohprodukts ergab ein weißes kristallines Material (3,07 g, 87%); FABMS 319,1 (M + K), 281,1 (M + H).
N-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyldidemnin B (18). Zu einer Lösung von Cbz-Glutamin (0,14 g, 0,55 mmol) in trockenem DMF (2,50 ml) wurden DMAP (0,6 mg) und DCC (20,6 mg, 0,11 mmol) bei 20°C unter Rühren hinzugegeben. Das Rühren wurde bei Raumtemperatur für 2 h fortgesetzt und eine Lösung von Didemnin B (23,0 mg, 20,6 μmmol) in DMF (2,50 ml) wurde unter Rühren hinzugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 24 h gerührt, mit CH₂Cl₂ verdünnt und mit 5%igem NaHCO₃ und Wasser zu neutralem pH gewaschen. Die Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und eingedampft, wobei sich ein weißer Feststoff ergab, welcher durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradientensystems von Acetonitril/Wasser gereinigt wurde, siehe Supplementary Material, S-9 (51,3 mg, 34%); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), siehe Supplementary Material, S-10; FABMS 1374,6 (M + H), siehe Supplementary Material, S-11; HRFABMS ber. für C₇₀H₁₀₄N₉O₁₉ (M + H) 1374,7448, gefunden 1374,7446. Aus der HPLC-Reinigung wurde auch ein zweites Derivat erhalten (siehe Supplementary Material, S-12) und es wurde gefunden, daß es Di-(benzyloxycarbonyl)glutaminyldidemnin B (36,0 mg, 20%) war; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), siehe Supplementary Material, S-13; FABMS 1637,2 (M + H), siehe Supplementary Material, S-14; HRFABMS ber. für C₈₃H₁₁₈N₁₁O₂₃ (M + H) 1636,8402, gefunden 1636,8401.
Glutaminyldidemnin B (3). Verbindung 18 (25,1 mg, 18,2 μmol) wurde in Isopropylalkohol (1,00 ml) gelöst und 10%-Pd/C-Katalysator (0,99 mg) wurde hinzugegeben. Die Lösung wurde für 3 h hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration über Celite entfernt und das Lösungsmittel wurde entfernt, wobei 3 geliefert wurde, welches durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradientensystems von Acetonitril/Wasser gereinigt wurde, siehe Supplementary Material, S-15 (19,6 mg, 87%); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), siehe Supplementary Material, S-16; FABMS 1278,5 (M + K), 1262,6 (M + Na), 1240,7 (M + H), siehe Supplementary Material, S-17; HRFABMS ber. für C₆₂H₁₀₆N₁₁O₁₉ (M + H) 1240,7081, gefunden 1240,7076.
Glutaminylglutaminyldidemnin B (4). Die Verfahrensweise war identisch mit der vorstehend für 3 beschriebenen. Verbindung 4 wurde auch durch Behandlung von 19 mit Bromwasserstoff in Essigsäure hergestellt; FABMS 1368,7 (M + H), siehe Supplementary Material, S-18; HRFABMS ber. für C₆₇H₁₀₆N₁₁O₁₉ (M + H) 1368,7666, gefunden 1368,7680.
N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamin (20). L-Pyroglutamin (2,02 g, 13,83 mmol) wurde in 1 N NaOH (13,84 ml) gelöst und die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt. Nach 30 min Rühren wurden Na₂CO₃ (3,63 g) und Benzylchlorformiat (4,82 ml) in Dioxan (21,23 ml) allmählich in gleichen Portionen hinzugegeben. Das Rühren wurde bei 0°C für 1 h fortgesetzt, dann wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und mit Ethylether (2 × 20 ml) extrahiert. Die wässerige Lösung wurde mit 2 N HCl auf pH 5 angesäuert, mit Ethylacetat (3 × 50 ml) extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, wobei sich ein Öl ergab, welches über Nacht kristallisierte. Umkristallisation des Rohprodukts ergab weißes kristallines Material (2,86 g, 87%); FABMS 240,1 (M + H).
L-(N-Benzyloxycarbonyl-pyroglutaminyl)-L-glutaminyldidemnin B (21). Zu einer Lösung von Cbz-Pyroglutamin (10,2 mg, 38,7 μmol) in trockenem DMF (0,18 ml) wurden DMAP (0,22 mg) und DCC (7,59 mg, 7,74 μmol) bei 20°C unter Rühren hinzugegeben. Das Rühren wurde bei Raumtemperatur für 2 h fortgesetzt und eine Lösung von Gln-Didemnin B (9,60 mg, 7,74 μmol) in DMF (2,50 ml) wurde unter Rühren hinzugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 24 h gerührt. Die Lösung wurde mit CH₂Cl₂ verdünnt und mit 5%igem NaHCO₃ und Wasser zu neutralem pH gewaschen. Die Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel verdampft, wobei sich 21 als weißer Feststoff ergab. Die Verbindung wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradientensystems von Acetonitril/Wasser gereinigt (siehe Supplementary Material, S-19 (5,19 mg, 46%); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), siehe Supplementary Material, S-20; FABMS 1524,2 (M + K), 1509,1 (M + Na), 1485,8 (M + H), siehe Supplementary Material, S-21; HRFABMS ber. für C₇₅H₁₀₉N₁₀O₂₁ (M + H) 1485,7769, gefunden 1485,7765.
L-pyroglutaminyl-L-glutaminyldidemnin B [Didemnin M (1)]. Verbindung 21 (2,12 mg, 1,40 μmol) wurde in Isopropylalkohol (1,00 ml) gelöst und 10%-Pd/C-Katalysator (9,90 μg) wurde hinzugegeben. Die Lösung wurde für 3 h hydriert, der Katalysator wurde durch Filtration über Celite entfernt und das Lösungsmittel wurde entfernt, um die gewünschte Verbindung zu liefern. Die Verbindung wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradientensystems von Acetonitril/Wasser gereinigt (siehe Supplementary Material), S-6 (1,66 mg, 88%); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), siehe Supplementary Material, S-7; FABMS 1389,5 (M + K), 1374,5 (M + Na), 1351,6 (M + H), siehe Supplementary Material, S-8; HRFABMS ber. für C₆₇H₁₀₃N₁₀O₁₉ (M + H) 1351,7401, gefunden 1351,7406.
N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutaminyldidemnin B (22). DMAP (0,48 mg) und EDC (16,5 mg, 88,0 μmol) wurden bei 20°C unter Rühren zu Verbindung 20 (0,11 g, 0,44 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (2,00 ml) gegeben. Das Rühren wurde bei Raumtemperatur für 2 h fortgesetzt und eine Lösung von Didemnin B (9,20 mg, 8,24 μmol) in CH₂Cl₂ (2,00 ml) wurde unter Rühren hinzugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 24 h gerührt, mit CH₂Cl₂ verdünnt und mit 5%igem NaHCO₃ und Wasser zu neutralem pH gewaschen. Die Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel verdampft, wobei sich die Verbindung als weißer Feststoff ergab. Die Verbindung wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradientensystems von Acetonitril/Wasser (5,70 g, 52%) gereinigt; FABMS 1356,7 (M + H), siehe Supplementary Material, S-22; HRFABMS ber. für C₇₀H₁₀₂N₉O₁₈ (M + H) 1356,7343, gefunden 1356,7335.
L-Pyroglutaminyldidemnin B (2). Verbindung 22 (5,70 mg, 4,28 mmol) wurde in Isopropylalkohol (0,5 ml) gelöst und 10%-Pd/C-Katalysator (0,25 mg) wurde hinzugegeben. Die Lösung wurde für 5 h hydriert, der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde entfernt, wobei 2 geliefert wurde; welches durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradientensystems von Acetonitril/Wasser gereinigt wurde, siehe Supplementary Material, S-23 (4,28 mg, 82%); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), siehe Supplementary Material, S-24; FABMS 1223,7 (M + H), siehe Supplementary Material, S-25; HRFABMS ber. für C₆₂H₉₅N₈O₁₇ (M + H) 1223,6815, gefunden 1223,6811.
Boc-L-Prolyldidemnin A (24). DMAP (0,75 mg) und EDC (11,5 mg, 60,0 mmol) wurden bei 20°C unter Rühren zu Boc-L-Prolin (23) (25,0 mg, 0,12 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (2,00 ml) gegeben. Das Rühren wurde bei Raumtemperatur für 2 h fortgesetzt und eine Lösung von Didemnin A (44,4 mg, 40,0 mmol) in CH₂Cl₂ (2,00 ml) wurde unter Rühren hinzugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 24 h gerührt. Die Lösung wurde mit CH₂Cl₂ verdünnt und mit 5%iger NaHCO₃-Lösung und Wasser zu neutralem pH gewaschen. Die Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei sich die Verbindung als weißer Feststoff (17,5 mg, 42%) ergab; FABMS 1140,6 (M + H), 1040,6 (M + 2 H – Boc).
L-Prolyldidemnin A (25). Verbindung 24 (15,1 mg, 13,2 μmol) wurde in 5 N HCl in Ethylacetat gelöst. Nach 3 h Rühren bei Raumtemperatur zeigte die TLC-Analyse, daß die Entschützung vollständig war. Das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei ein weißes kristallines Material (12,5 mg, 91%) bereitgestellt wurde; FABMS 1040,6 (M + H), siehe Supplementary Material, S-26.
Dehydrodidemnin B. DMAP (0,16 mg) und DCC (2,62 mg, 12,8 μmol) wurden bei 20°C unter Rühren zu einer Lösung von Brenztraubensäure (2,61 mg, 29,7 μmol) in trockenem DMF (0,10 ml) gegeben. Das Rühren wurde bei Raumtemperatur für 2 h fortgesetzt und eine Lösung von Prolyldidemnin A (10,3 mg, 9,90 μmol) in DMF (0,40 ml) wurde unter Rühren hinzugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 24 h gerührt, mit CH₂Cl₂, verdünnt und mit 5%iger NaHCO₃-Lösung und Wasser zu neutralem pH gewaschen, dann getrocknet (Na₂SO₄), und das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei sich das Produkt als weißer Feststoff ergab. Die Verbindung wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradientensystems von Acetonitril/Wasser gereinigt (siehe Supplementary Material, S-27), wobei sich eine weiße pulverförmige Substanz ergab; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), siehe Supplementary Material, S-28; FABMS 1110,6 (M + H), siehe Supplementary Material, S-29; HRFABMS ber. für C₅₇H₈₈N₇O₁₅ (M + H) 1110,6338, gefunden 1110,6334.
TABELLE I – ANTIVIRALE AKTIVITÄTEN VON DIDEMNINEN^A (# – NEUE VERBINDUNGEN)

FUSSNOTEN: ^a Durchgeführt von Dr. G. R. Wilson in diesem Laboratorium; ^b 0 (am wenigsten toxisch) bis 16 (toxisch); ^c +++ = vollständige Hemmung; ++ = starke Hemmung; + = mäßige Hemmung; – = keine Hemmung.

TABELLE II – CYTOTOXIZITÄT VON DIDEMNINEN^A # = NEUE VERBINDUNGEN

^a Durchgeführt von Dr. G. R. Wilson in diesem Laboratorium. ^b NT = nicht getestet.

TABELLE III T/C (% DER KONTROLLE, LEBENSVERLÄNGERUNG) IM VERHÄLTNIS ZU P388
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein ¹H-NMR-Spektrum von O-Benzyldidemnin B (15). 2 ist ein LRFAB-Massenspektrum von O-Benzyldidemnin B (15). 3 ist eine RPHPLC-Spur von Didemnin B. 4 ist ein ¹H-NMR-Spektrum von Didemnin B. 5 ist ein LRFAB-Massenspektrum von O-Benzyldidemnin B (15). 6 ist eine RPHPLC-Spur von Didemnin M (1). 7 ist ein ¹H-NMR-Spektrum von Didemnin M (1). 8 ist ein LRFAB-Massenspektrum von Didemnin M (1). 9 ist eine RPHPLC-Spur von Benzyloxycarbonyl-L-Glutaminyldidemnin B (18). 10 ist ein ¹H-NMR- Spektrum von Benzyloxycarbonyl-L-Glutaminyldidemnin B (18). 11 ist ein LRFAB-Massenspektrum von Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyldidemnin B (18). 12 ist eine RPHPLC-Spur von (Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl)₂didemnin MB (19). 13 ist ein ¹H-NMR-Spektrum von (Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl)₂didemnin MB (19). 14 ist ein LRFAB-Massenspektrum von (Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl)₂didemnin MB (19). 15 ist eine RPHPLC-Spur von Glutaminyldidemnin B (3). 16 ist ein ¹H-NMR-Spektrum von Glutaminyldidemnin B (3). 17 ist ein LRFAB-Massenspektrum von Glutaminyldidemnin B (3). 18 ist ein LRFAB-Massenspektrum von Diglutaminyldidemnin B (4). 19 ist eine RPHPLC-Spur von Benzyloxycarbonyldidemnin M (21). 20 ist ein ¹H-NMR-Spektrum von Benzyloxycarbonyldidemnin M (21). 21 ist ein LRFAB-Massenspektrum von Benzyloxycarbonyldidemnin M (21). 22 ist ein LRFAB-Massenspektrum von Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutaminyldidemnin B (22). 23 ist eine RPHPLC-Spur von Pyroglutaminyldidemnin B (2). 24 ist ein ¹H-NMR-Spektrum von Pyroglutaminyldidemnin B (2). 25 ist ein LRFAB-Massenspektrum von Pyroglutaminyldidemnin B (2). 26 ist ein LRFAB-Massenspektrum von Prolyldidemnin A (25). 27 ist eine RPHPLC-Spur von Dehydrodidemnin B. 28 ist ein ¹H-NMR-Spektrum von Dehydrodidemnin B. 29 ist ein LRFAB-Massenspektrum von Dehydrodidemnin B.

Claims

Verbindung Gln-Didemnin B.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Verbindung Gln-Didemnin B und einen optionalen pharmazeutisch verträglichen Excipienten, ein Verdünnungsmittel oder einen Träger.
Verbindung Cbz-Gln-Didemnin B.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Verbindung Cbz-Gln-Didemnin B und einen optionalen pharmazeutisch verträglichen Excipienten, ein Verdünnungsmittel oder einen Träger.
Verbindung pGlu-Didemnin B.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Verbindung pGlu-Didemnin B und einen optionalen pharmazeutisch verträglichen Excipienten, ein Verdünnungsmittel oder einen Träger.
Verbindung Cbz-pGlu-Didemnin B.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Verbindung Cbz-pGlu-Didemnin B und einen optionalen pharmazeutisch verträglichen Excipienten, ein Verdünnungsmittel oder einen Träger.
Verbindung Gln[GlnIst²]-Didemnin B.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Verbindung Gln[GlnIst²]-Didemnin B und einen optionalen pharmazeutisch verträglichen Excipienten, ein Verdünnungsmittel oder einen Träger.
Verbindung Cbz-Gln[Cbz-GlnIst²]-Didemnin B.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Verbindung Cbz-Gln[Cbz-GlnIst²]-Didemnin B und einen optionalen pharmazeutisch verträglichen Excipienten, ein Verdünnungsmittel oder einen Träger.
Synthetisches Verfahren für die Herstellung von Didemnin M, umfassend den Schritt, die Pyroglutaminylglutaminverbindung (7) mit Didemnin B zu kuppeln, um Didemnin M zu liefern.
Synthetisches Verfahren für die Herstellung von Didemnin M, umfassend die Schritte: (a) Kuppeln von o-Benzyllactylprolin (8) mit Didemnin A, um ein geschütztes Derivat (15) zu ergeben; (b) Hydrierung von Derivat (15), um Didemnin B zu liefern; und (c) Kuppeln der Pyroglutaminylglutaminverbindung (7) mit Didemnin B, um Didemnin M zu liefern.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie in Anspruch 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 definiert bei der Herstellung eines Medikaments für die wirksame Behandlung neoplastischer Tumore von Säugern.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie in Anspruch 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 definiert bei der Herstellung eines Medikaments für die wirksame Behandlung RNA- oder DNA-viraler Infektionen von Säugern.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie in Anspruch 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 definiert bei der Herstellung eines Medikaments für die wirksame Behandlung bakterieller Infektionen von Säugern.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie in Anspruch 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 definiert bei der Herstellung eines Medikaments für die wirksame Behandlung pilzlicher Infektionen von Säugern.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie in Anspruch 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 definiert bei der Herstellung eines Medikaments für die wirksame Förderung der Immunsuppression bei Säugern.